小麥G2-like轉(zhuǎn)錄因子家族基因鑒定與表達(dá)模式分析

賈玉庫 高宏歡 馮健超 郝紫瑞 王晨陽 謝迎新 郭天財(cái) 馬冬云

研究簡報(bào)

小麥G2-like轉(zhuǎn)錄因子家族基因鑒定與表達(dá)模式分析

賈玉庫**高宏歡**馮健超 郝紫瑞 王晨陽 謝迎新 郭天財(cái) 馬冬云*

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 國家小麥工程技術(shù)研究中心/ 河南省小麥技術(shù)創(chuàng)新中心, 河南鄭州 450046

()轉(zhuǎn)錄因子, 是屬于MYB類轉(zhuǎn)錄因子中GARP超家族的成員, 在調(diào)節(jié)葉綠體發(fā)育中起重要作用。本研究利用生物信息學(xué)方法對小麥基因進(jìn)行了全基因組鑒定, 并對其理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、啟動(dòng)子順式作用元件及對非生物脅迫和激素的響應(yīng)模式進(jìn)行了分析。從小麥中共鑒定出87個(gè)基因, 不均勻的分布在小麥21條染色體上, 系統(tǒng)發(fā)育分析將這些基因分為14個(gè)亞族。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測表明, 小麥基因的氨基酸序列均以α螺旋和隨機(jī)卷曲為主要結(jié)構(gòu)。啟動(dòng)子順式作用元件分析表明其上游2 kb區(qū)域含有7種(P-box、SpI、LTR、ABRE、MBS、TGA-element和AE-box)與逆境脅迫誘導(dǎo)相關(guān)順式作用元件。其中含有順式調(diào)控元件結(jié)合位點(diǎn)最多, 一共有18個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。qRT-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),、、和在PEG和鹽脅迫下以及GA、IAA和ABA激素誘導(dǎo)下表達(dá)量顯著上調(diào), 這些基因可能介導(dǎo)了小麥對多種非生物逆境的響應(yīng)。

小麥; G2-like轉(zhuǎn)錄因子; 生物信息學(xué); 逆境脅迫; 表達(dá)分析

小麥?zhǔn)俏覈钪饕募Z食作物之一, 其產(chǎn)量高低對國家糧食安全至關(guān)重要。近年來, 隨著氣候變化和農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境污染, 各種環(huán)境脅迫包括低溫[1-2]、高溫[3]、干旱[4-5]和鹽脅迫[6-7]等嚴(yán)重影響小麥生長。因此, 提升小麥在逆境條件下的防御水平, 對小麥增產(chǎn)增收意義重大。

植物中轉(zhuǎn)錄因子在逆境脅迫下可以激活或者抑制某些基因的轉(zhuǎn)錄, 影響其蛋白在植物體內(nèi)的表達(dá)量及功能, 從而在植物逆境應(yīng)答和生長發(fā)育中起重要作用[8-9]。(或)轉(zhuǎn)錄因子是屬于MYB類轉(zhuǎn)錄因子中GARP超家族的成員, 廣泛存在于陸地植物中。首先在玉米中被發(fā)現(xiàn)[10], 隨后在擬南芥、水稻、辣椒和番茄中均有存在, 在葉綠體發(fā)育、果實(shí)品質(zhì)、植物衰老及響應(yīng)逆境脅迫等方面均起作用[11-13]。e家族成員的特征是在過渡和早期成熟階段調(diào)節(jié)葉綠體的形成[14-15], 對葉綠體的發(fā)育是不可或缺的基因。玉米和這一對同源基因功能基本相同, 分別在葉肉細(xì)胞和維管束鞘細(xì)胞中表達(dá)[16]。過表達(dá)可以增強(qiáng)調(diào)控葉綠體的發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá), 進(jìn)而影響成熟果實(shí)中的糖類和類胡蘿卜素的含量[13]。

基因沉默后的番茄植株表現(xiàn)出對干旱和低溫的抗性下降[17]。擬南芥在低溫下基因通過抑制花青素合成基因和抑制花青素的積累并增強(qiáng)黃酮和香豆素苷的積累, 從而對低溫產(chǎn)生抗性[18]。對玉米植株在低溫(4℃)和干旱脅迫處理下的轉(zhuǎn)錄因子家族的20個(gè)基因表達(dá)量分析, 發(fā)現(xiàn)部分基因的表達(dá)與植株抗逆性有關(guān)[19]。同時(shí)轉(zhuǎn)錄因子影響控制氣孔開閉和鉀離子運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因的表達(dá), 從而對氣孔起到調(diào)節(jié)作用[20]。植物激素如生長素和油菜素類固醇與果實(shí)葉綠體的發(fā)育有關(guān), 且與的表達(dá)上調(diào)有關(guān)[21]。目前關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子在小麥中的研究尚未有詳細(xì)報(bào)道。因此, 通過對小麥基因組中轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了系統(tǒng)挖掘, 結(jié)合生物信息學(xué)分析和對部分小麥轉(zhuǎn)錄因子在干旱和鹽脅迫下的表達(dá)模式分析, 篩選抗逆相關(guān)的家族成員, 為小麥抗逆基因的挖掘和在育種中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 小麥G2-like基因的全基因組鑒定、編碼蛋白的理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)分析和亞細(xì)胞定位分析

從Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫(http://plants.ensembl.org/ index.html)獲取小麥蛋白序列, 以玉米G2-like蛋白序列作為query序列進(jìn)行BLASTP比對(-value<1E–5)獲得同源序列。在Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)下載G2-like保守結(jié)構(gòu)域PF00249.29, 利用HMM3.0進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域比對; 同時(shí)利用Pfam搜索(http://pfam.xfam.org/)、SMART (http://samrt.embl-heidelberg.de/)和HMMER (https://www. ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/hmscan)驗(yàn)證候選蛋白保守結(jié)構(gòu)域。利用ExPASy-ProtParam (https://web.expasy.org/ protparam/)計(jì)算G2-like蛋白的氨基酸長度和分子量等基本理化性質(zhì)。分別利用軟件NPS-SOPMA (https://npsa- prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)和ProtComp 9.0 (https://linux1.Softbe-rry.com/berry.phtml)預(yù)測G2-like的二級(jí)結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位。

1.2 小麥G2-like基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)和基序分析

利用Clustal_W工具對G2-like蛋白序列進(jìn)行多重比對, 結(jié)果放入MEGA 7.0[22]軟件, 采用鄰接法(Neighbor- Jointing, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(bootstrap, 1000; 基序, 10)。利用TBtools軟件[23]作圖。

1.3 小麥G2-like基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化、染色體定位和共線性分析

根據(jù)IWGSC (http://wheat-urgi.versailles.inra.fr/)小麥基因組數(shù)據(jù)BLASTN構(gòu)建本地?cái)?shù)據(jù)庫, 通過比對獲得基因在染色體上的物理位置。利用MG2C (http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/)構(gòu)建基因在染色體上的物理圖譜。利用MCScanX[24]進(jìn)行共線性分析(-value<1E–5), Circos軟件可視化分析[25]。利用KaKs_Calculator軟件計(jì)算非同義替代率(Ka)和同義替代率(Ks)[26], 預(yù)測基因CDS區(qū)的適應(yīng)性進(jìn)化。

1.4 小麥G2-like基因的順式作用元件分析

利用TBtools軟件截取基因CDS上游2.0 kb的DNA序列, 提交至PlantCARE數(shù)據(jù)庫(http://bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)進(jìn)行啟動(dòng)子順式作用元件的預(yù)測。

1.5 小麥G2-like基因在不同組織部位、逆境脅迫下的表達(dá)分析

利用expVIP數(shù)據(jù)庫(http://www.wheat-expression.com/)和Wheat Exp數(shù)據(jù)庫(https://wheat.pw.usda.gov/WheatExp/)中小麥基因組和在干旱、熱脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 分析基因在不同組織及逆境脅迫下表達(dá)模式。

1.6 小麥G2-like轉(zhuǎn)錄因子家族部分基因qRT-PCR驗(yàn)證

選用河南省主推小麥品種百農(nóng)207為試驗(yàn)材料, 挑選籽粒飽滿大小一致的種子經(jīng)75%乙醇消毒處理后, 用蒸餾水沖洗5次, 然后置于光照培養(yǎng)箱中。在23℃/18℃ (白天/黑夜)、光/暗周期為16 h/8 h培養(yǎng), 然后挑選發(fā)芽一致的種子采用Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng), 每2 d更換一次培養(yǎng)液。待其長到二葉一心進(jìn)行干旱(20% PEG-6000)、鹽脅迫(200 mmol L–1NaCl)、以及生長素(100 μmol L–1IAA)、赤霉素(100 μmol L–1GA)和脫落酸(100 μmol L–1ABA)處理, 正常營養(yǎng)液培養(yǎng)作為對照, 所有處理重復(fù)3次。分別在處理0、1、6、12和24 h時(shí)取不同處理幼葉, 立即置于液氮中保存。使用TRIZOL (北京全式金生物技術(shù)股份有限公司)提取RNA, 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈合成, 用于Real-time PCR分析(表1)。在QuantStudio 5 Real-time PCR System (Themo Fisher, BIO INC, CA, 美國)上進(jìn)行qRT-PCR分析, 反應(yīng)體系與程序參考TB Green Premix ExII (TaKaRa, 大連)試劑盒說明書, 采用2–ΔΔCt法計(jì)算相對表達(dá)量[27]。

表1 部分G2-like基因熒光定量所用引物

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥G2-like基因全基因組鑒定、編碼蛋白的基本理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位分析

根據(jù)59個(gè)玉米基因的蛋白序列, 利用BLASTP和HMM比對搜索, 在小麥基因組數(shù)據(jù)庫中得到110個(gè)候選基因。通過Pfam、SMART、HMMER驗(yàn)證是否有G2-like MYB DNA保守結(jié)構(gòu)域, 共鑒定出87個(gè)基因, 據(jù)其在染色體上的位置進(jìn)行命名(表2)。

蛋白序列一級(jí)結(jié)構(gòu)理化性質(zhì)分析顯示, 87個(gè)G2-like蛋白序列長度為224～534氨基酸, 分子量為24.03～58.47 kD, 等電點(diǎn)范圍為4.84～9.65, 其中43個(gè)蛋白理論等電點(diǎn)在酸性范圍內(nèi), 其余均在堿性范圍內(nèi), 表明G2-like蛋白質(zhì)酸堿分布均勻; 疏水性指數(shù)范圍為–0.945～ –0.319; 不穩(wěn)定系數(shù)范圍為28.00～73.87, 其中有8個(gè)G2-like蛋白不穩(wěn)定系數(shù)小于40, 相對來說為穩(wěn)定蛋白質(zhì)。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)均含有α螺旋、延伸鏈、β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲, 但以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主要結(jié)構(gòu)。亞細(xì)胞定位預(yù)測表明, 大部分位于核膜, 3個(gè)位于線粒體膜, 9個(gè)位于質(zhì)膜, 1個(gè)位于細(xì)胞質(zhì)膜。

2.2 G2-like基因家族系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)和基序分析

基于進(jìn)化關(guān)系、基序和結(jié)構(gòu)分析,基因家族可分為14 (I～XIV)組(圖1-A)。每組基因分布不均勻, 第9組數(shù)量最多(13個(gè)), 第3組最少只有2個(gè)。一般來說, 聚集在同一分組的基因表現(xiàn)出相似的基序結(jié)構(gòu)和基因結(jié)構(gòu)。利用MEME motif搜索工具, 鑒定出G2-like蛋白10個(gè)保守基序(圖1-B)。幾乎每個(gè)基因都有基序1和基序2結(jié)構(gòu)域(沒有)。此外, 每個(gè)分組都有獨(dú)特的基序, 說明轉(zhuǎn)錄因子在進(jìn)化過程中存在內(nèi)部分化, 這可能是基因功能多樣性的來源。依據(jù)基因組DNA和CDS序列, 獲得了基因的外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)(圖1-C)。所有的e基因都具有完整的基因結(jié)構(gòu), 但是有14個(gè)基因沒有UTR結(jié)構(gòu)。當(dāng)缺失UTR時(shí), 意味著基因的調(diào)控功能(mRNA的穩(wěn)定性、折疊、核內(nèi)運(yùn)輸相互作用, RNA加工、剪切和翻譯等)會(huì)受到影響[28-29]。

2.3 小麥G2-like基因的染色體分布及共線性分析

基因在小麥A、B、D三種染色體上是不均勻分布, 且不同染色體上基因位置和數(shù)目明顯不同(圖2)。其中2A、2B和2D染色體上分布的最少(7個(gè)), 在7A、7B和7D染色體上分布的最多(22個(gè))。有6個(gè)基因形成3對串聯(lián)重復(fù)基因?qū)?和、和和

通過BLASTP和MCscanX對進(jìn)行重復(fù)模式分析, 表明小麥基因組內(nèi)存在79,067個(gè)共線性區(qū)域(包括Un染色體), 共存在107,545個(gè)基因(圖3)。有74個(gè)小麥基因定位在共線性區(qū)域內(nèi), 說明這些基因由片段復(fù)制模式產(chǎn)生。同時(shí), 3個(gè)基因同時(shí)涉及到片段復(fù)制和串聯(lián)重復(fù)事件, 表明這些基因由兩種重復(fù)模式互作擴(kuò)增而來。家族的同源基因?qū)Φ腒a/Ks值均小于1, 表明這些同源基因?qū)艿截?fù)選擇作用, 同時(shí)其進(jìn)化過程中受到功能限制作用。

2.4 小麥G2-like基因啟動(dòng)子的順式作用元件分析

對基因啟動(dòng)子序列分析表明, 其2 kb上游區(qū)域含有響應(yīng)抗逆脅迫的7種潛在順式作用調(diào)控元件(圖4), 其中與激素、干旱、低溫、鹽脅迫誘導(dǎo)有關(guān)的MBS、P-box、Sp1、TGA-element、LTR、ABRE和AE-box順式作用元件。本研究中62個(gè)基因至少含有5個(gè)抗逆脅迫順式作用元件結(jié)合位點(diǎn),含有順式調(diào)控元件結(jié)合位點(diǎn)最多, 一共有18個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。表明小麥基因家族可能參與多種非生物逆境的響應(yīng)。

圖1 小麥G2-like基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、保守蛋白基序結(jié)構(gòu)和基因結(jié)構(gòu)

A: 利用MEGA7基于小麥G2-like蛋白全長序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。B: 小麥G2-like蛋白的基序組成。不同顏色表示motif 1～motif 10; 蛋白質(zhì)的長度可以用底部的刻度來估計(jì)。C: 小麥基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。綠色方框表示未翻譯的5-和3-區(qū)域;黃色框表示外顯子; 黑線表示內(nèi)含子。

A: phylogenetic tree was constructed based on the full-length sequences of wheat G2-like proteins using MEGA 7. B: the motif composition of the wheat G2-like proteins. Different colors indicate motif 1–motif 10. The length of the protein can be estimated using the scale at the bottom. C: the exon-intron structures of wheatgenes. Green boxes indicate untranslated 5-regions and 3-regions; yellow boxes indicate exons; and black lines indicate introns.

圖2 小麥G2-like基因染色體定位

標(biāo)度代表兆堿基(Mb)。The scale represents Mb.

圖3 小麥G2-like基因的染色體位置及共線性關(guān)系

所有的共線區(qū)域和基因由灰線連接,基因的片段重復(fù)基因?qū)τ眉t線標(biāo)出。

All syntenic blocks and genes are linked by the grey lines, and segmental duplication pairs ofgenes are highlighted by red lines.

圖4 小麥G2-like基因啟動(dòng)子區(qū)域與抗逆相關(guān)的7種順式作用元件

順式作用元件用不同的彩色方框表示。

Different colored boxes indicate different cis-acting elements in the scale at the bottom.

2.5 小麥G2-like基因組織表達(dá)及逆境脅迫下表達(dá)分析

基因的表達(dá)模式分析表明(圖5),基因家族可分為5類(A～E), 其中大部分基因在葉中均有表達(dá); 模式A和E中的基因幾乎在根、葉、穗和籽粒的所有時(shí)期都有較高水平表達(dá); 模式B中的基因主要在根中表達(dá); 模式D主要是在葉和穗中表達(dá); 在模式C中有12個(gè)的基因在不同組織和不同時(shí)期的表達(dá)量都很低或沒有表達(dá)。

對候選小麥基因在干旱、高溫及干旱和高溫雙重脅迫下的表達(dá)情況分析(圖6), 發(fā)現(xiàn)大部分基因在脅迫下均有較高的表達(dá)量, 表達(dá)模式基本相同。、、、、、和在3類脅迫下表達(dá)量均較高; 特別是, 其表達(dá)量在3種脅迫下最高, 表明這個(gè)基因在小麥遭受熱、干旱脅迫時(shí)可能發(fā)揮重要作用。、、和在干旱脅迫下的表達(dá)量顯著高于熱脅迫, 表明這4個(gè)基因?qū)Ω珊得{迫可能更加敏感。但是、、、和在不同的脅迫下的表達(dá)量均較低或者沒有, 可能是這5個(gè)基因?qū)δ婢趁{迫不敏感。

圖5 不同時(shí)期籽粒、葉片、根和穗中87個(gè)G2-like基因表達(dá)譜熱圖

S: 幼苗期; V: 期; R: 生殖期。紅色或綠色代表每個(gè)樣品中每個(gè)轉(zhuǎn)錄本的較高或較低的相對豐度。

S: at seedling stage; V: at vegetative stage; R: at reproductive stage. The red or green colors stand for the higher or lower relative abundance of each transcript in each sample.

圖6 小麥G2-like基因在熱、干旱以及熱和干旱共同脅迫下的表達(dá)模式

D1、D6:干旱處理1、6 h; H1、H6: 高溫處理1、6 h; D+H1、D+H6: 在高溫和干旱脅迫下處理時(shí)間為1、6 h。紅色和綠色分別代表每個(gè)樣品中每個(gè)轉(zhuǎn)錄本的較高和較低的相對豐度。

D1, D6: drought treatment of 1 h and 6 h; H1, H6: heat treatment of 1 h and 6 h; D+H1, D+H6: heat and drought treatments of 1h and 6 h. The red and green colors represent the higher or lower relative abundance, respectively.

2.6 小麥G2-like轉(zhuǎn)錄因子家族部分基因qRT-PCR驗(yàn)證分析

為探究基因?qū)Ψ巧锩{迫及激素的響應(yīng), 根據(jù)基因在不同組織部位表達(dá)量, 以及啟動(dòng)子區(qū)域順式調(diào)控元件結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量等綜合考慮, 挑選了14個(gè)小麥基因進(jìn)行qRT-PCR表達(dá)分析(圖7)。結(jié)果表明, 在鹽脅迫下只有表達(dá)量顯著降低, 在脅迫24 h后較CK下降了3倍; 而、、、、、、、和表達(dá)量顯著升高, 其中、升高最為明顯, 在脅迫24 h后其表達(dá)量相對于CK分別提高了8倍、15倍和11倍。

在干旱脅迫下,、、、和、、和表達(dá)量顯著升高, 其中和上升最為顯著, 在脅迫24 h后其表達(dá)量相對于CK分別升高了10倍、13倍和12倍; 而在脅迫下上調(diào)最不明顯, 在脅迫24 h后相對于CK上升大致為1.3倍。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫下顯著上調(diào), 但在干旱脅迫下其表達(dá)量并沒有顯著變化(脅迫12 h除外);在鹽脅迫下顯著下調(diào), 而在干旱脅迫6 h之后其表達(dá)量較對照顯著上調(diào), 表明這2個(gè)基因在響應(yīng)干旱和鹽脅迫中可能存在差異。

在3種激素誘導(dǎo)下,、、、、、和表達(dá)量均顯著升高(圖8), 其中和升高最為明顯, 其表達(dá)量相對CK上調(diào)10倍以上。、和表達(dá)量隨GA和IAA誘導(dǎo)時(shí)間的延長呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢, 且均在誘導(dǎo)1 h之后表達(dá)量顯著上調(diào)。但其對ABA誘導(dǎo)的響應(yīng)相對較弱,和分別在ABA誘導(dǎo)6 h和24 h、6 h時(shí)表達(dá)量較對照顯著上調(diào); 而在ABA處理12 h之后表達(dá)量顯著上調(diào)。在IAA處理下表達(dá)量顯著升高, 在誘導(dǎo)24 h后較CK上升3倍左右; 而在3種激素處理下表達(dá)量均表現(xiàn)出下降的趨勢, 其中在IAA處理下降最明顯, 在誘導(dǎo)24 h后較CK下調(diào)了0.3倍。

3 討論

小麥在生產(chǎn)過程經(jīng)常遭受各種逆境脅迫的影響, 挖掘小麥抗逆基因資源對于小麥抗逆育種有重要作用。植物在面臨逆境脅迫時(shí), 其體內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子迅速啟動(dòng)相應(yīng)基因的表達(dá)和逆境信號(hào)的傳遞, 啟動(dòng)抗逆應(yīng)答反應(yīng), 在植物逆境應(yīng)答和生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[9]。轉(zhuǎn)錄因子, 是屬于MYB類轉(zhuǎn)錄因子中GARP超家族的成員, 廣泛存在于陸地植物中。本研究在小麥中共鑒定出87個(gè)基因, 不均勻的分布在21條染色體上; 通過共線性分析發(fā)現(xiàn)小麥基因家族主要由片段重復(fù)產(chǎn)生, 同時(shí)還有3個(gè)串聯(lián)重復(fù)基因?qū)? 植物基因家族擴(kuò)張的主要途徑是串聯(lián)重復(fù)和片段重復(fù)[30], 片段復(fù)制在進(jìn)化較慢的基因家族中是有規(guī)律出現(xiàn)的。計(jì)算Ka/Ks值后發(fā)現(xiàn)2種重復(fù)基因?qū)Ρ戎稻∮?, 表明基因在進(jìn)化過程中可能是相對保守的, 進(jìn)化較慢。

圖7 定量實(shí)時(shí)PCR分析14個(gè)G2-like基因?qū)aCl、PEG處理的響應(yīng)

*表示處理間存在顯著差異(< 0.05)。

* indicates significant differences between the stress conditions and the control condition (< 0.05).

(圖8)

圖8 定量實(shí)時(shí)PCR分析14個(gè)G2-like基因?qū)BA、GA和IAA處理的響應(yīng)

*表示處理間存在顯著差異(< 0.05)。

* indicates significant differences between the stress conditions and the control condition at< 0.05.

位于啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件通過對不同環(huán)境信號(hào)的響應(yīng)來調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄, 從而影響植物的生長發(fā)育[31]。在玉米中發(fā)現(xiàn)與激素、干旱和低溫誘導(dǎo)響應(yīng)有關(guān)的MBS、P-box、Sp1、TGA-element和AE-box順式作用元件[32]; 在水稻中發(fā)現(xiàn)的ABRE順式調(diào)控元件, 參與干旱誘導(dǎo)和脫落酸誘導(dǎo)[33-34]; LTR順式調(diào)控元件, 在擬南芥鹽脅迫中發(fā)揮重要作用[35]。本研究發(fā)現(xiàn), 小麥基因啟動(dòng)子區(qū)域含有多種順式作用元件, 包括MBS、P-box、ABRE等響應(yīng)逆境脅迫元件, 表明小麥基因在參與逆境脅迫中可能發(fā)揮重要作用。已有研究結(jié)果表明基因在植物葉綠體的發(fā)育具有重要作用[36]。對不同組織部位基因表達(dá)模式分析表明, 不同基因在小麥葉片中均有表達(dá), 且在干旱、高溫以及干旱和高溫共同脅迫下,基因都有較高的表達(dá)量, 表明基因可能在葉綠體發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)中均發(fā)揮著重要作用, 但其具體的調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

玉米中有10個(gè)基因在干旱和低溫脅迫下表達(dá)量均上調(diào), 其中基因在低溫和干旱脅迫下表達(dá)量顯著上調(diào)[19]。劉俊芳等[17]發(fā)現(xiàn)鹽處理后有6個(gè)基因表達(dá)上調(diào), 干旱處理后有3個(gè)基因表達(dá)上調(diào), 其中基因在干旱和低溫脅迫中應(yīng)答明顯, 沉默后番茄植株對干旱和低溫的抗性降低。本研究中通過實(shí)時(shí)熒光定量分析發(fā)現(xiàn), 14個(gè)基因中, 幾乎所有的基因在鹽脅迫和干旱脅迫下顯著上調(diào), 表明多數(shù)基因在鹽和干旱脅迫下表現(xiàn)為正向調(diào)控; 同時(shí)發(fā)現(xiàn)基因在干旱脅迫下顯著下調(diào); 表明盡管轉(zhuǎn)錄因子的蛋白氨基酸序列相似, 但轉(zhuǎn)錄因子對干旱脅迫的調(diào)控機(jī)制不盡相同。其中、和在這兩種脅迫下表達(dá)量上調(diào)幅度最高, 可能在小麥抗鹽和抗旱中發(fā)揮重要作用, 有關(guān)其功能驗(yàn)證及作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是植物響應(yīng)鹽和干旱脅迫的關(guān)鍵途徑之一;雙突變體在擬南芥種子萌發(fā)和幼苗發(fā)育期間表現(xiàn)出對ABA高度敏感, 在幼苗發(fā)育期間也有抗?jié)B透脅迫的作用;基因調(diào)控包括WRKY40在內(nèi)的幾種ABA響應(yīng)基因, 在ABA反應(yīng)中起負(fù)調(diào)控作用[37]。本研究中多數(shù)基因在ABA誘導(dǎo)下顯著上調(diào), 與干旱脅迫下表達(dá)模式相似, 表明這些轉(zhuǎn)錄因子參與干旱信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能需借助ABA信號(hào)途徑; 而表達(dá)量對ABA響應(yīng)程度較小, 可能其不依賴ABA信號(hào)途徑對抗旱能力進(jìn)行調(diào)控。如在水稻的研究中表明參與介導(dǎo)植物對ABA和干旱的反應(yīng)[38],而過表達(dá)植株對外源ABA沒有響應(yīng)[39]。在沉默了抑制生長素響應(yīng)的基因株系中,的表達(dá)升高[40]。本研究14個(gè)基因中, 幾乎所有的基因均在IAA和GA誘導(dǎo)下顯著上調(diào), 只有和分別在IAA和GA誘導(dǎo)下顯著下調(diào)表達(dá), 表明不同轉(zhuǎn)錄因子對激素的響應(yīng)模式存在一定差異, 可能與其參與植株生長發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)的調(diào)控模式有關(guān)。多數(shù)基因?qū)γ{迫和激素誘導(dǎo)均明顯響應(yīng), 其中、、和在不同脅迫和激素處理下應(yīng)答最為明顯, 表明這4個(gè)基因可能在小麥抗逆應(yīng)答過程中發(fā)揮著重要作用。同時(shí)必須指出的是,本研究在逆境脅迫和激素誘導(dǎo)基因表達(dá)分析中, 僅選用了1個(gè)品種, 且脅迫類型和激素種類較少; 盡管百農(nóng)207為適應(yīng)性好、綜合抗逆能力強(qiáng)的品種, 但選擇抗逆能力不同小麥品種、同時(shí)增加逆境脅迫和激素種類可能更有利于抗逆相關(guān)基因鑒定, 關(guān)于基因?qū)Σ煌婢趁{迫和激素誘導(dǎo)的響應(yīng)需進(jìn)一步驗(yàn)證。根據(jù)基因表達(dá)模式并結(jié)合生信分析,可能在小麥抗逆中發(fā)揮重要作用。通過載體構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化, 已經(jīng)成功獲得了10株過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系, 有關(guān)過表達(dá)株系在逆境下的表型及相應(yīng)生理機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Genome-wide identification and expression analysis of G2-like transcription factors family genes in wheat

JIA Yu-Ku**, GAO Hong-Huan**, FENG Jian-Chao, HAO Zi-Rui, WANG Chen-Yang, XIE Ying-Xin, GUO Tian-Cai, and MA Dong-Yun*

College of Agronomy, Henan Agricultural University / National Engineering Research Center for Wheat / Technology Innovation Center of Henan Wheat, Zhengzhou 450046, Henan, China

() transcription factor, a member of the GARP superfamily of MYB transcription factors, plays an important role in regulating chloroplast development. In this study, genome-wide identification ofgenes in wheat was carried out by bioinformatics methods, and their physicochemical properties, subcellular localization, cis-acting elements of promoters, and response patterns to abiotic stresses and hormones were analyzed. A total of 87genes were identified from wheat, which distributed in evenly on 21 chromosomes in wheat. Phylogenetic analysis showed that these genes were divided into 14 subfamilies, and fragment replication was the main reason for the expansion of this gene family. The prediction of protein secondary structure revealed that α helix and random curl were the main amino acid sequences ofgene in wheat. Promoter-acting elements showed that there were seven-acting elements (P-box, SpI, LTR, ABRE, MBS, TGA-Element, and AE-box) in 2-kb region upstream of the promoter. Among them,contained the most-regulatory element binding sites with a total of 18 binding sites. The qRT-PCR revealed. that the relative expression levels of,,, andwere significantly up-regulated under PEG and salt stresses, and induced by GA, IAA, and ABA hormones. These genes may mediate the response of wheat plant to various abiotic stresses.

wheat;transcription factors; bioinformatics; adversitystress; the relative expression level

10.3724/SP.J.1006.2023.21036

本研究由國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2015BAD26B00)和河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目(212102110281)資助。

This study was supported by the National Science and Technology Support Program of China (2015BAD26B00) and the Science and Technology Project of Henan Province (212102110281).

馬冬云, E-mail: xmzxmdy@126.com

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

賈玉庫, E-mail: 13633969649@163.com; 高宏歡, E-mail: 2972620298@qq.com

2022-05-13;

2022-07-22;

2022-08-18.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220817.1833.011.html

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