鹽脅迫下不同甘薯品種的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析

張小紅 彭 瓊 鄢 錚

研究簡(jiǎn)報(bào)

鹽脅迫下不同甘薯品種的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析

張小紅 彭 瓊 鄢 錚*

福州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所, 福建福州 350018

為了獲得甘薯耐鹽轉(zhuǎn)錄組序列信息, 挖掘差異表達(dá)基因及其相關(guān)代謝途徑, 本文以鹽脅迫處理0 d、3 d和6 d的耐鹽甘薯品種‘榕薯819’以及不耐鹽甘薯品種‘榕薯910’的葉片為材料, 借助高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。結(jié)果表明, 2個(gè)品種共獲得157,252條Unigenes, 平均組裝長(zhǎng)度為576 bp。其中有83,264條Unigenes在七大數(shù)據(jù)庫(kù)中得到注釋, 占總數(shù)的52.95%。NR注釋分類(lèi)結(jié)果顯示, 在牽?；?)中比對(duì)到同源序列的Unigenes最多, 共43,620條, 占總數(shù)的57.05%。Unigenes在KOG數(shù)據(jù)庫(kù)中的注釋主要富集在普通功能預(yù)測(cè)(8752個(gè))、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制(5067個(gè))以及翻譯后修飾、蛋白轉(zhuǎn)換、分子伴侶(4471個(gè))中。差異表達(dá)分析顯示, 在‘榕薯819’中, 鹽處理3 d和6 d的樣品差異表達(dá)基因數(shù)分別為323個(gè)和3752個(gè), 共參與了33個(gè)GO功能分類(lèi)項(xiàng)和302條KEGG代謝通路。在‘榕薯910’中, 差異表達(dá)基因數(shù)則分別為5554個(gè)和7395個(gè), 共參與了50個(gè)GO功能分類(lèi)項(xiàng), 涉及了329條KEGG代謝通路。以部分差異表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ), 進(jìn)行了表達(dá)量熱圖繪制。結(jié)果顯示, 注釋到淀粉和蔗糖代謝途徑的7個(gè)差異表達(dá)β-葡萄糖苷酶基因均表現(xiàn)為在耐鹽品種中上調(diào), 在不耐鹽品種中下調(diào); 注釋到Ca2+信號(hào)途徑的7個(gè)類(lèi)鈣調(diào)素基因中, 有2個(gè)在耐鹽品種中特異上調(diào), 5個(gè)在不耐鹽品種中特異下調(diào)。差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量熱圖顯示,僅在耐鹽品種中特異表達(dá),、、和僅在不耐鹽品種中特異表達(dá), 而在耐鹽品種中下調(diào)表達(dá), 在不耐鹽品種中上調(diào)表達(dá)。綜上分析, 甘薯耐鹽轉(zhuǎn)錄組獲得的Unigenes數(shù)量較大, 序列信息豐富, 鹽脅迫下獲得的差異表達(dá)基因及高豐度轉(zhuǎn)錄因子可能在甘薯抵御鹽脅迫過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

甘薯; 鹽脅迫; 轉(zhuǎn)錄組; 高通量測(cè)序

土壤作為農(nóng)作物的直接載體, 鹽漬化發(fā)展容易導(dǎo)致耕地土壤質(zhì)量下降, 農(nóng)作物減產(chǎn)減收, 嚴(yán)重影響著國(guó)家糧食安全生產(chǎn)與發(fā)展。合理種植耐鹽植物被認(rèn)為是最有效的改良土壤環(huán)境、保障作物生產(chǎn)水平的方法之一[1]。甘薯((L.) Lam.)作為重要的新型能源作物, 種植面積廣泛, 具有高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、適應(yīng)性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)效益高等特點(diǎn)[2]。近年來(lái), 甘薯更是被當(dāng)作鹽堿地改良的優(yōu)勢(shì)作物, 廣泛種植于濱海鹽堿土地, 但隨著土壤鹽漬化發(fā)展日趨嚴(yán)重, 過(guò)高的土壤鹽分大大增加了甘薯的種植難度, 高鹽會(huì)對(duì)甘薯產(chǎn)生毒害作用, 直接影響甘薯的生長(zhǎng)發(fā)育, 進(jìn)而導(dǎo)致甘薯減產(chǎn)減收[3-4]。因此, 研究甘薯耐鹽相關(guān)代謝途徑, 了解甘薯響應(yīng)鹽脅迫的分子調(diào)控機(jī)制, 對(duì)甘薯耐鹽優(yōu)良種質(zhì)資源的篩選與利用具有重要的意義。

目前, 國(guó)內(nèi)外關(guān)于甘薯耐鹽性的相關(guān)研究主要集中在品種選育[5]、生理特性分析[6-7]和耐鹽相關(guān)基因挖掘與鑒定[8-10]等方面, 在轉(zhuǎn)錄組水平上的研究仍落后于水稻、玉米、小麥等作物。而高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)則大幅度豐富了甘薯在轉(zhuǎn)錄組學(xué)上的研究, 為甘薯的抗逆分子機(jī)理研究提供了重要手段[11-13]。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在甘薯轉(zhuǎn)錄組研究中已得到了廣泛的應(yīng)用。Wang等[14]于2010年對(duì)甘薯品種‘廣薯87’塊根進(jìn)行了高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序, 以產(chǎn)生大量轉(zhuǎn)錄物序列, 用于甘薯塊根形成發(fā)育相關(guān)基因的挖掘和分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)。Tao等[15]利用Illumina配對(duì)末端測(cè)序技術(shù), 在甘薯中獲得了128,052個(gè)轉(zhuǎn)錄本, 同時(shí)還鑒定出大量的差異表達(dá)和特異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本。此外, 還對(duì)涉及病毒基因組、淀粉代謝以及潛在脅迫耐受性和抗蟲(chóng)性的基因進(jìn)行了表達(dá)特征的鑒定。Tao等[16]利用RNA測(cè)序技術(shù), 鑒定出了可能的甘薯花特異性基因和開(kāi)花調(diào)控相關(guān)基因。Li等[17]通過(guò)對(duì)黃肉甘薯品種‘維多麗’及其突變體‘HBV-3’的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究, 挖掘到58,277條轉(zhuǎn)錄本和35,909條Unigenes, 并鑒定出參與類(lèi)胡蘿卜素生物合成的22個(gè)差異表達(dá)基因和31個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。Luo等[18]比較了鹽脅迫和對(duì)照條件下的甘薯二倍體鹽生野生近緣種假厚藤()的轉(zhuǎn)錄組信息, 發(fā)現(xiàn)有大量的基因參與了假厚藤直系根和葉的鹽脅迫響應(yīng), 并涉及了4個(gè)不同的代謝過(guò)程。Zhu等[19]以耐旱型甘薯品種‘徐薯55-2’為研究對(duì)象, 通過(guò)Illumina高通量測(cè)序鑒定出11,359個(gè)差異表達(dá)基因, 涉及了脫落酸(abscisic acid, ABA)、乙烯(ethylene, ETH)和茉莉酸(jasmonic acid, JA)信號(hào)通路, 進(jìn)一步揭示了甘薯抵御干旱脅迫的分子機(jī)制。Arisha等[20]從‘徐紫薯8號(hào)’的轉(zhuǎn)錄組研究數(shù)據(jù)庫(kù)中挖掘到重要的功能基因, 獲得了相對(duì)豐富的基因表達(dá)信息。高通量測(cè)序技術(shù)雖然已經(jīng)在甘薯轉(zhuǎn)錄組研究中得到了廣泛的應(yīng)用, 但關(guān)于甘薯在鹽脅迫條件下的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析相關(guān)研究仍舊較少。本研究利用高通量技術(shù)手段, 將生物信息學(xué)分析與分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合, 從轉(zhuǎn)錄組學(xué)水平研究不同甘薯品種對(duì)鹽脅迫的應(yīng)答, 通過(guò)對(duì)未知序列的挖掘和差異表達(dá)基因的分析, 全面了解甘薯響應(yīng)鹽脅迫過(guò)程中所涉及的代謝通路, 為揭示甘薯抵御鹽脅迫的抗性機(jī)理提供理論保障。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為耐鹽甘薯品種‘榕薯819’和不耐鹽甘薯品種‘榕薯910’, 2個(gè)品種均為福州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所自主選育品種。

1.2 方法

1.2.1 供試樣品的鹽脅迫處理 將甘薯擴(kuò)繁苗種植于田間, 30 d后, 選取長(zhǎng)勢(shì)一致、含7片完全展開(kāi)葉片的甘薯苗插入蛭石中, 并浸泡于200 mmol L-1NaCl溶液中, 分別于鹽溶液浸泡處理后3 d、6 d對(duì)甘薯苗功能葉(頂葉向下數(shù)第3葉)進(jìn)行取樣。以處理0 d的樣品作為對(duì)照組, 將葉片液氮凍存后, 置于-80℃冰箱保存, 用于總RNA提取。試驗(yàn)設(shè)置3組生物學(xué)重復(fù), 共18份樣品。樣品名稱標(biāo)記為: 耐鹽品種‘榕薯819’的鹽脅迫對(duì)照組R 1-1～R 1-3; 3 d處理組R 2-1～R 2-3; 6 d處理組R 3-1～R 3-3; 不耐鹽品種‘榕薯910’的鹽脅迫對(duì)照組T 1-1～T 1-3; 3 d處理組T 2-1～T 2-3; 6 d處理組T 3-1～T 3-3。

1.2.2 總RNA提取、cDNA文庫(kù)構(gòu)建及高通量測(cè)序 總RNA 提取及質(zhì)量檢測(cè)、cDNA文庫(kù)構(gòu)建以及高通量測(cè)序均委托北京組學(xué)生物科技有限公司進(jìn)行。RNA樣品檢測(cè)合格后, 進(jìn)行mRNA的富集及cDNA文庫(kù)的構(gòu)建。文庫(kù)構(gòu)建完成后, 通過(guò)Qubit 2.0、Agilent 2100及Q-PCR的方法對(duì)文庫(kù)質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。庫(kù)檢合格后, 進(jìn)行Illumina高通量測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 對(duì)原始數(shù)據(jù)(raw data)進(jìn)行數(shù)據(jù)過(guò)濾, 去除其中的接頭序列及低質(zhì)量Reads, 獲得高質(zhì)量的Clean data。采用Trinity[21]組裝軟件對(duì)所有樣品的Clean reads進(jìn)行序列組裝, 獲得轉(zhuǎn)錄本信息, 隨后選取轉(zhuǎn)錄本中最長(zhǎng)的序列作為Unigene序列, 獲得甘薯的Unigene庫(kù)。

文庫(kù)質(zhì)量評(píng)估合格后, 使用BLAST[22]軟件先將組裝后的Unigene序列與NR (NCBI non-redundant protein sequences)、Swiss-Prot (A manually annotated and reviewed protein sequence database)、GO (Gene ontology)、COG (Clusters of orthologous groups of proteins)、KOG (Eukaryotic ortholog groups)和KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genomes)這六大公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì), 使用KOBAS 2.0[23]軟件獲得Unigene在KEGG中的KEGG Orthology結(jié)果, 預(yù)測(cè)完Unigene的氨基酸序列之后使用HMMER[24]軟件與Pfam (Protein family)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì), 獲得Unigene的注釋信息。

采用RPKM算法計(jì)算Unigene表達(dá)量, 其計(jì)算公式為:RPKM =×106/(×/103), 式中為比對(duì)到某一轉(zhuǎn)錄本上的片段數(shù)目,為比對(duì)到所有轉(zhuǎn)錄本上的片段總數(shù),為轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度。利用DESeq[25]軟件, 以差異倍數(shù)(Fold Change)≥2、錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(False Discovery Rate, FDR) < 0.01作為篩選標(biāo)準(zhǔn), 對(duì)18個(gè)樣品進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選。最后對(duì)篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG代謝通路分析。采用Bioinformatics在線工具(http://www. bioinformatics.com.cn/)繪制部分差異表達(dá)基因和差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序結(jié)果評(píng)估及組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì)

通過(guò)Illumina測(cè)序, 18個(gè)樣品共獲得533,839,471的Clean reads數(shù)。各樣品中Clean reads的堿基質(zhì)量值Q20均高于97%, Q30均高于93%, 表明其堿基識(shí)別準(zhǔn)確性較高, 測(cè)序結(jié)果質(zhì)量良好。由此可見(jiàn), 該轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果滿足后續(xù)組裝的質(zhì)量要求。

為提高測(cè)序深度和轉(zhuǎn)錄本組裝的完整性, 采用Trinity組裝軟件對(duì)所有樣品的Clean reads進(jìn)行序列組裝。共獲得211,688條轉(zhuǎn)錄本, 平均組裝長(zhǎng)度為759 bp。其中, 長(zhǎng)度超過(guò)500 bp的轉(zhuǎn)錄本有71,388條, 占轉(zhuǎn)錄本總數(shù)的33.72%; 長(zhǎng)度超過(guò)1.0 kb的有44,790條, 占轉(zhuǎn)錄本總數(shù)的21.16%。隨后選取轉(zhuǎn)錄本中最長(zhǎng)的序列作為Unigene序列, 總共獲得157,252條Unigene, 平均組裝長(zhǎng)度為576 bp, N50達(dá)到了1064 bp (表1)。其中Unigene長(zhǎng)度在500 bp以上的有34,641條, 占Unigene總數(shù)的22.03%; 長(zhǎng)度在1.0 kb以上的有19,856條, 占總數(shù)的12.63%。轉(zhuǎn)錄本和Unigenes的長(zhǎng)度頻數(shù)分布見(jiàn)圖1。

表1 樣品拼裝結(jié)果統(tǒng)計(jì)

圖1 組裝所得轉(zhuǎn)錄本和Unigenes長(zhǎng)度分布圖

2.2 Unigene的功能注釋

將組裝后的Unigenes序列與七大數(shù)據(jù)庫(kù)(NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、KEGG和Pfam)進(jìn)行比對(duì)后(表2)發(fā)現(xiàn), 共有83,264條Unigenes注釋成功, 占總數(shù)的52.95%, 剩下的73,988條Unigenes均未獲得注釋, 占總數(shù)的47.05%。其中, 注釋到NR數(shù)據(jù)庫(kù)的Unigenes數(shù)量最多, 有76,583條, 占注釋成功Unigenes總數(shù)的91.98%。

通過(guò)與NR數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)(圖2)發(fā)現(xiàn), 在牽?；?)中比對(duì)到同源序列的Unigenes最多, 共43,620條, 占總數(shù)的57.05%。其次為擬除蟲(chóng)菊, 共2786條, 占總數(shù)的3.64%, 而與其他物種的相似性均較低(0.82%～2.05%)。

為了進(jìn)一步分析Unigene的功能, 將甘薯Unigene庫(kù)與KOG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示, 42,285個(gè)Unigenes共獲得47,213個(gè)KOG注釋, 主要富集在普通功能預(yù)測(cè)(general functional prediction only, 8752個(gè))、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制(signal transduction mechanisms, 5067個(gè))以及翻譯后修飾、蛋白轉(zhuǎn)換、分子伴侶(posttranslational modification, protein turnover, chaperones)共計(jì)4471個(gè)(圖3)。

表2 Unigene注釋統(tǒng)計(jì)表

圖2 NR注釋物種分類(lèi)圖

圖3 KOG功能注釋分類(lèi)圖

2.3 差異表達(dá)基因的篩選

利用DESeq進(jìn)行差異表達(dá)基因的分析(表3)發(fā)現(xiàn), 在耐鹽品種‘榕薯819’中, 與對(duì)照相比, 鹽處理3 d和6 d的樣品差異表達(dá)基因數(shù)分別為個(gè)323個(gè)和3752個(gè), 且差異表達(dá)基因的上調(diào)數(shù)量均略高于下調(diào)數(shù)量。在不耐鹽品種‘榕薯910’中, 鹽處理3 d、6 d后的樣品與對(duì)照相比, 差異表達(dá)基因分別有5554個(gè)和7395個(gè), 上調(diào)表達(dá)基因數(shù)量明顯低于下調(diào)表達(dá)基因數(shù)量。說(shuō)明, 在鹽脅迫條件下, 甘薯不耐鹽品種中的差異表達(dá)基因遠(yuǎn)多于甘薯耐鹽品種, 且多數(shù)為下調(diào)表達(dá)差異基因。在品種間差異表達(dá)分析結(jié)果中可以看出, 鹽處理6 d后的樣品差異表達(dá)基因數(shù)量要高于對(duì)照及鹽處理3 d后的樣品, 且除對(duì)照組外, 不同基因型甘薯在相同的鹽處理?xiàng)l件下, 下調(diào)表達(dá)的差異基因明顯多于上調(diào)表達(dá)差異基因。

表3 差異表達(dá)基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)表

R1-1_R1-2_R1-3_vs_R2-1_R2-2_R2-3和R1-1_R1-2_R1-3_vs_R3-1_R3-2_R3-3分別表示‘榕薯819’對(duì)照組與鹽脅迫3 d、6 d處理組之間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的比對(duì)組合; T1-1_T1-2_T1-3_vs_T2-1_T2-2_T2-3和T1-1_T1-2_T1-3_vs_T3-1_T3-2_T3-3分別表示‘榕薯910’對(duì)照組與鹽脅迫3 d、6 d處理組之間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的比對(duì)組合; R1-1_R1-2_R1-3_vs_T1-1_T1-2_T1-3、R2-1_R2-2_R2-3_vs_T2-1_T2-2_T2-3和R3-1_R3-2_R3-3_vs_T3-1_T3-2_T3-3分別表示‘榕薯819’與‘榕薯910’對(duì)照組之間、鹽脅迫3 d處理組之間和鹽脅迫6 d處理組之間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的比對(duì)組合。

R1-1_R1-2_R1-3_vs_R2-1_R2-2_R2-3 and R1-1_R1-2_R1-3_vs_R3-1_R3-2_R3-3 represent the combination between ‘Rongshu 819’ control group and treated group under salt stress for 3 days and 6 days, respectively. T1-1_T1-2_T1-3_vs_T2-1_T2-2_T2-3 and T1-1_T1-2_ T1-3_vs_T3-1_T3-2_T3-3 represent the combination between ‘Rongshu 910’ control group and treated group under salt stress for 3 days and 6 days, respectively. R1-1_R1-2_R1-3_vs_T1-1_T1-2_T1-3 represent the combination between ‘Rongshu 819’ control group and ‘Rongshu 910’ control group. R2-1_R2-2_R2-3_vs_T2-1_T2-2_T2-3 represent the combination between ‘Rongshu 819’ treated group and ‘Rongshu 910’ treated group under salt stress for 3 days. R3-1_R3-2_R3-3_vs_T3-1_T3-2_T3-33 represent the combination between ‘Rongshu 819’ treated group and ‘Rongshu 910’ treated group under salt stress for 6 days.

2.4 差異表達(dá)基因功能注釋和富集分析

2.4.1 差異表達(dá)基因GO分類(lèi) 對(duì)耐鹽品種‘榕薯819’不同處理組間的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析發(fā)現(xiàn), 鹽脅迫3 d的處理組有154個(gè)差異表達(dá)基因參與了33個(gè)GO功能分類(lèi)項(xiàng), 主要富集在分子功能(molecular function)大類(lèi)中的催化活性(catalytic activity, 92個(gè))和結(jié)合(binding, 73個(gè)), 以及生物過(guò)程(biological process)大類(lèi)中的代謝過(guò)程(metabolic process, 84個(gè)) (圖4-A)。鹽脅迫6 d的處理組有1807個(gè)差異表達(dá)基因參與了33個(gè)GO功能分類(lèi)項(xiàng), 其中有949個(gè)同時(shí)參與了催化活性和代謝過(guò)程(圖4-B)。

對(duì)不耐鹽品種‘榕薯910’不同處理組間差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析發(fā)現(xiàn), 鹽脅迫3 d的處理組有2797個(gè)差異表達(dá)基因參與了49個(gè)GO功能分類(lèi)項(xiàng)(圖4-C), 鹽脅迫6 d的處理組則有3601個(gè)差異表達(dá)基因參與了50個(gè)GO功能分類(lèi)項(xiàng)(圖4-D)。2個(gè)處理組中, 富集程度最高的3個(gè)分類(lèi)項(xiàng)均為催化活性、代謝過(guò)程以及結(jié)合, 差異表達(dá)基因數(shù)分別為催化活性(1520個(gè), 1897個(gè))、代謝過(guò)程(1423個(gè), 1846個(gè))以及結(jié)合(1293個(gè), 1631個(gè))。

2.4.2 差異表達(dá)基因KEGG注釋 KEGG分析結(jié)果表明, 鹽脅迫后‘榕薯819’的差異表達(dá)基因共涉及了302條通路, 其中鹽脅迫3 d處理組涉及了82條通路, 6 d處理組涉及了302條通路。將富集程度最顯著的20條通路進(jìn)行散點(diǎn)圖繪制。結(jié)果顯示, 當(dāng)Corrected-value < 0.05時(shí), ‘榕薯819’鹽脅迫3 d處理組僅分析到4條代謝通路, 主要有: 單菌素生物合成(ko00261)、光合作用天線蛋白(ko00196)、硫代謝(ko00920)以及硒化合物代謝(ko00450), 均屬于代謝途徑大類(lèi)(圖5-A); 鹽脅迫6 d處理組則分析到22條, 主要有光合作用天線蛋白、單菌素生物合成、糖胺聚糖生物合成-硫酸乙酰肝素/肝素(ko00534)、維生素消化吸收(ko04977)和類(lèi)黃酮生物合成(ko00941)等, 分屬于代謝、有機(jī)體系統(tǒng)、環(huán)境信息處理和人類(lèi)疾病四大類(lèi)(圖5-B)。

在‘榕薯910’中, 差異表達(dá)基因共涉及了329條通路, 其中鹽脅迫3 d和6 d處理組分別涉及了314和327條通路。當(dāng)Corrected-value < 0.05時(shí), 鹽脅迫3 d處理組共分析到29條代謝通路, 主要有: 光合作用天線蛋白、光合作用(ko00195)、苯乙烯降解(ko00643)、二萜生物合成(ko00904)、單萜生物合成(ko00902)、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)ko04075)、NF-kappa B信號(hào)通路(ko04064)、Toll樣受體信號(hào)通路(ko04620)等, 分屬于代謝、有機(jī)體系統(tǒng)、環(huán)境信息處理和人類(lèi)疾病四大類(lèi)(圖5-C); 鹽脅迫6 d處理組則分析到28條通路, 主要有: 光合作用天線蛋白、光合作用、苯乙烯降解、類(lèi)胡蘿卜素生物合成(ko00906)、異喹啉生物堿生物合成(ko00950)、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、NF-kappa B信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路等, 分屬于代謝、細(xì)胞過(guò)程、有機(jī)體系統(tǒng)、環(huán)境信息處理和人類(lèi)疾病五大類(lèi)(圖5-D)。

2.5 部分差異表達(dá)基因的表達(dá)量分析

在對(duì)差異表達(dá)基因KEGG的分析中, 選取了2條代謝通路中的關(guān)鍵基因進(jìn)行表達(dá)量熱圖的繪制(圖6)。結(jié)果顯示, 注釋到淀粉和蔗糖代謝途徑的7個(gè)差異表達(dá)β-葡萄糖苷酶基因(TRINITY_DN28654_c0_g1、TRINITY_ DN12057_c2_g1、TRINITY_DN3985_c0_g1、TRINITY_ DN35527_c0_g1、TRINITY_DN9914_c0_g1、TRINITY_ DN9535_c0_g1、TRINITY_DN1683_c0_g1)均表現(xiàn)為在耐鹽品種中上調(diào), 在不耐鹽品種中下調(diào); 注釋到Ca2+信號(hào)途徑的7個(gè)類(lèi)鈣調(diào)素基因在2個(gè)品種中均發(fā)生特異性表達(dá),其中2個(gè)(TRINITY_DN2515_c0_g1、TRINITY_DN6673_ c0_g1)在耐鹽品種中特異上調(diào), 5個(gè)(TRINITY_DN30953_ c0_g1、TRINITY_DN21585_c0_g1、TRINITY_DN23699_ c0_g1、TRINITY_DN2168_c0_g1、TRINITY_DN18268_ c0_g1)在不耐鹽品種中特異下調(diào)。根據(jù)以上結(jié)果推測(cè), 這幾個(gè)基因能夠響應(yīng)鹽脅迫并且參與了甘薯抵御鹽脅迫的代謝過(guò)程。

(圖4)

樣品名稱縮寫(xiě)同表3。1: 代謝過(guò)程; 2: 細(xì)胞過(guò)程; 3: 生物調(diào)節(jié): 4: 定位; 5: 響應(yīng)刺激; 6: 細(xì)胞成分組織或生物發(fā)生; 7; 信號(hào); 8: 發(fā)展過(guò)程; 9: 多細(xì)胞生物過(guò)程; 10: 繁殖; 11: 生殖過(guò)程; 12: 解毒; 13: 多生物過(guò)程; 14: 生長(zhǎng); 15: 免疫系統(tǒng)過(guò)程; 16: 移動(dòng); 17: 細(xì)胞殺傷; 18: 節(jié)律過(guò)程; 19: 氮肥利用; 20: 細(xì)胞群增殖; 21: 色素沉著; 22: 碳利用; 23: 生物粘附; 24: 細(xì)胞; 25: 細(xì)胞部分; 26: 膜; 27: 細(xì)胞器; 28: 膜部分; 29: 細(xì)胞器部分; 30: 含蛋白質(zhì)復(fù)合物; 31: 膜腔; 32: 胞外區(qū); 33: 細(xì)胞連接; 34: 超分子絡(luò)合物; 35: 病毒粒子; 36: 病毒粒子部分; 37: 細(xì)胞核; 38: 胞外區(qū)部分; 39: 催化活性; 40: 結(jié)合; 41: 轉(zhuǎn)運(yùn)活性; 42: 結(jié)構(gòu)分子活性; 43: 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性; 44: 分子功能調(diào)節(jié); 45: 翻譯調(diào)節(jié)活性; 46: 抗氧化活性; 47: 分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性; 48: 小分子傳感器活性; 49: 營(yíng)養(yǎng)貯存活性; 50: 分子載體活性; 51: 蛋白質(zhì)標(biāo)簽; 52: 貨物受體活性; 53: 蛋白質(zhì)折疊伴侶; 54: 貨物適配器活性。

Abbreviations of sample names are the same as those given in Table 3. 1: metabolic process; 2: cellular process; 3: biological regulation; 4: localization; 5: response to stimulus; 6: cellular component organization or biogenesis; 7: signaling; 8: developmental process; 9: multicellular organismal process; 10: reproduction; 11: reproductive process; 12: detoxification; 13: multi-organism process; 14: growth; 15: immune system process; 16: locomotion; 17: cell killing; 18: rhythmic process; 19: nitrogen utilization; 20: cell population proliferation; 21: pigmentation; 22: carbon utilization; 23: biological adhesion; 24: cell; 25: cell part; 26: membrane; 27: organelle; 28: membrane part; 29: organelle part; 30: protein-containing complex; 31: membrane-enclosed lumen; 32: extracellular region; 33: cell junction; 34: supramolecular complex; 35: virion; 36: virion part; 37: Nucleoid; 38: extracellular region part; 39: catalytic activity; 40: binding; 41: transporter activity; 42: structural molecule activity; 43: transcription regulator activity; 44: molecular function regulator; 45: translation regulator activity; 46: antioxidant activity; 47: molecular transducer activity; 48: small molecule sensor activity; 49: nutrient reservoir activity; 50: molecular carrier activity; 51: protein tag; 52: cargo receptor activity; 53: protein folding chaperone; 54: cargo adaptor activity.

(圖5)

樣品名稱縮寫(xiě)同表3。Abbreviations of sample names are the same as those given in Table 3.

圖6 甘薯部分差異表達(dá)基因表達(dá)量熱圖

樣品名稱縮寫(xiě)同表3。Abbreviations of sample names are the same as those given in Table 3.

2.6 差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子的分析

鹽脅迫處理后有很多響應(yīng)鹽脅迫的轉(zhuǎn)錄因子家族基因發(fā)生了特異性表達(dá)(表4)?！攀?19’鹽脅迫3 d處理組有166個(gè)差異表達(dá)基因涉及了45類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子家族, 其中C3H 14個(gè)、NAC 12個(gè)、mTERF 12個(gè)、MYB 9個(gè)、WRKY 8個(gè)、GRAS 6個(gè)、C2H2 6個(gè)、GNAT 5個(gè)、SNF2 5個(gè)、AP2/ERF 3個(gè)。鹽脅迫6 d處理組則有1630個(gè)差異表達(dá)基因涉及了66類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子家族, 其中MYB 131個(gè)、C3H 97個(gè)、AP2/ERF 88個(gè)、C2H2 75個(gè)、NAC 69個(gè)、B3 63個(gè)、GNAT 62個(gè)、HB 60個(gè)、C2C2 49個(gè)、WRKY 38個(gè)。

‘榕薯910’鹽脅迫3 d、6 d處理組分別鑒定到轉(zhuǎn)錄因子家族67個(gè)和69個(gè), 包括了2677個(gè)和3303個(gè)差異表達(dá)基因, 其中數(shù)量最多的10個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族分別為MYB (177個(gè), 244個(gè))、AP2/ERF (152個(gè), 182個(gè))、C3H (128個(gè), 166個(gè))、WRKY (113個(gè), 149個(gè))、NAC (117個(gè), 133個(gè))、B3 (114個(gè), 131個(gè))、bHLH (111個(gè), 138個(gè))、HB (98個(gè), 108個(gè))、GNAT (97個(gè), 144個(gè))、C2H2 (96個(gè), 126個(gè))。

2.7 部分差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量分析

本研究從69類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子家族中篩選出2類(lèi)家族(NAC和AP2/ERF)的6個(gè)家族成員進(jìn)行表達(dá)量熱圖繪制(圖7)。從圖中可以看出, 在NAC家族中,(TRINITY_ DN5042_c0_g1)和(TRINITY_DN6922_c0_g1)僅在不耐鹽品種中特異表達(dá), 而(TRINITY_ DN82578_c0_g1)在耐鹽品種中下調(diào)表達(dá), 在不耐鹽品種中上調(diào)表達(dá), 且僅在鹽處理6 d時(shí)有表達(dá), 表明在鹽處理前期并不受誘導(dǎo)表達(dá), 隨著鹽處理時(shí)間的延長(zhǎng), 基因得到表達(dá)。

在AP2/ERF家族中,(TRINITY_DN113_ c1_g1)僅在耐鹽品種中特異下調(diào)表達(dá), 而(TRINITY_DN7097_c0_g2)和(TRINITY_DN11829_ c0_g1)則僅在不耐鹽品種中特異下調(diào)表達(dá), 推測(cè)這幾個(gè)特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子有可能在甘薯抵御鹽脅迫過(guò)程中發(fā)揮了作用。

表4 差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子數(shù)目統(tǒng)計(jì)表

樣品名稱縮寫(xiě)同表3。Abbreviations of sample names are the same as those given in Table 3.

圖7 甘薯部分差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量熱圖

樣品名稱縮寫(xiě)同表3。Abbreviations of sample names are the same as those given in Table 3.

3 討論

利用高通量測(cè)序手段對(duì)不同耐鹽基因型甘薯品種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn), 2個(gè)甘薯品種共獲得211,688條轉(zhuǎn)錄本和157,252條Unigenes, 平均組裝長(zhǎng)度分別為759 bp和576 bp, 較前人對(duì)甘薯轉(zhuǎn)錄組的研究而言[15,18,20,26], 獲得的Unigenes數(shù)量更大, 信息數(shù)據(jù)更加豐富, 表明本研究測(cè)序質(zhì)量更高、組裝效果更好。有83,264條Unigenes在七大數(shù)據(jù)庫(kù)中得到注釋, 占總數(shù)的52.95%, 且注釋到NR數(shù)據(jù)庫(kù)的Unigenes數(shù)量最多, 此結(jié)果也超出Arisha等[20]研究中的NR注釋數(shù)據(jù)。在成功注釋到NR數(shù)據(jù)庫(kù)的Unigenes中, 有57.05%的Unigenes與牽?；ǖ耐葱宰罡? 與物種間的親緣關(guān)系以及傳統(tǒng)的生物學(xué)分類(lèi)結(jié)果完全相符[22]。但研究仍有47.05%的Unigenes未能獲得注釋信息, 表明仍有大量新的轉(zhuǎn)錄本有待進(jìn)一步挖掘與鑒定。

差異表達(dá)基因的GO富集分析結(jié)果顯示, 富集程度最高的3個(gè)GO功能分類(lèi)項(xiàng)為催化活性、代謝過(guò)程和結(jié)合, 此結(jié)果與Wang等[14]和Luo等[18]的研究一致, 而差異表達(dá)基因在催化活性和結(jié)合中的高富集能力也證明了植物分子功能是造成植物耐鹽性差異的主要原因之一[28]。通過(guò)KEGG注釋分析可知, 在所有的代謝通路中, 參與代謝大類(lèi)的基因占比最多。其中, 淀粉和蔗糖代謝途徑是代謝大類(lèi)中注釋基因最多的一條途徑。

在糖代謝過(guò)程中, β-葡萄糖苷酶作為參與代謝過(guò)程最關(guān)鍵的糖苷水解酶, 對(duì)纖維素糖化水解具有重要作用。纖維素在降解過(guò)程中經(jīng)由內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶水解會(huì)產(chǎn)生纖維二糖, 纖維二糖在β-葡萄糖苷酶的作用下則會(huì)水解形成葡萄糖, 以此釋放能量, 用于抵御外界脅迫[29-30]。本研究中, 注釋到該途徑的7個(gè)差異表達(dá)β-葡萄糖苷酶基因均表現(xiàn)為在耐鹽品種中上調(diào), 在不耐鹽品種中下調(diào), 可以推測(cè)這幾個(gè)β-葡萄糖苷酶基因在鹽脅迫后的上調(diào)作用促進(jìn)了耐鹽品種中葡萄糖的形成, 可能為甘薯抵御鹽脅迫過(guò)程提供了能量。

此外, 還在Ca2+信號(hào)途徑中挖掘到7個(gè)類(lèi)鈣調(diào)素蛋白基因。類(lèi)鈣調(diào)素蛋白作為植物中普遍存在的一類(lèi)Ca2+結(jié)合蛋白, 能夠介導(dǎo)Ca2+信號(hào)與下游基因間的相互作用, 從而響應(yīng)植物逆境脅迫[31]。Xu等[32]將水稻類(lèi)鈣調(diào)素蛋白基因轉(zhuǎn)入擬南芥后, 發(fā)現(xiàn)擬南芥的耐鹽性明顯增加。本研究中, 挖掘到的7個(gè)類(lèi)鈣調(diào)素蛋白基因在2個(gè)品種中均發(fā)生了特異性表達(dá), 其中2個(gè)在耐鹽品種中特異上調(diào), 5個(gè)在不耐鹽品種中特異下調(diào)。因此, 推測(cè)這7個(gè)類(lèi)鈣調(diào)素蛋白基因的特異性表達(dá)很可能涉及了甘薯的耐鹽生物過(guò)程, 在甘薯對(duì)鹽脅迫的耐受性方面起了重要作用。

多項(xiàng)研究表明, 轉(zhuǎn)錄因子MYB[33]、AP2/ERF[34]、C3H[35]、WRKY[36]、NAC[37]和C2H2[38]能夠通過(guò)對(duì)下游基因的調(diào)控作用響應(yīng)鹽脅迫, 在植物抵御鹽脅迫過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

NAC家族是一類(lèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子家族, 廣泛參與了植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及生物和非生物脅迫應(yīng)答[37]。有研究發(fā)現(xiàn), 在鹽脅迫條件下, 轉(zhuǎn)日本結(jié)縷草的酵母菌株長(zhǎng)勢(shì)明顯弱于對(duì)照, 推測(cè)在鹽脅迫下起負(fù)調(diào)控作用。隨后, 該研究對(duì)過(guò)表達(dá)的擬南芥植株進(jìn)行鹽處理, 發(fā)現(xiàn)其生長(zhǎng)情況明顯弱于野生型植株, 表明降低了擬南芥的耐鹽性, 進(jìn)一步證明了是一個(gè)負(fù)調(diào)控基因[39]。本研究中,僅在不耐鹽品種中上調(diào)表達(dá), 推測(cè)其有可能在鹽脅迫條件下通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)抑制了甘薯的耐鹽性, 使得該品種呈現(xiàn)出鹽敏感特性。Wang等[40]從番茄中分離出一個(gè)基因, 并利用RNAi干擾技術(shù)對(duì)其進(jìn)行沉默, 發(fā)現(xiàn)相較于野生型植株,突變株的耐鹽性明顯降低, 表明該基因在鹽脅迫下起到正調(diào)控作用。本研究中,僅在不耐鹽品種中下調(diào)表達(dá), 推測(cè)其有可能與起到了類(lèi)似的功能, 調(diào)控了該品種耐鹽性。是水稻中纖維素合成酶基因(cellulose synthase,)的調(diào)節(jié)因子, 能夠直接結(jié)合并上調(diào)下游的, 從而激活的表達(dá)[41]。是纖維素合成的關(guān)鍵基因, 植物中纖維素含量的變化則會(huì)引起植物對(duì)非生物和生物脅迫的響應(yīng)[42]。此外, Han等[43]研究發(fā)現(xiàn), 轉(zhuǎn)擬南芥植株在高鹽下的存活率明顯高于野生型植株, 且轉(zhuǎn)基因植株呈現(xiàn)出更高的抗氧化酶活性, 推測(cè)可能通過(guò)增強(qiáng)活性氧的清除能力在抗鹽脅迫中發(fā)揮了重要作用。本研究中,在不同耐鹽品種中呈現(xiàn)差異表達(dá), 且僅在鹽處理6 d時(shí)有表達(dá), 表明在鹽處理前期并不受誘導(dǎo)表達(dá), 隨著鹽處理時(shí)間的延長(zhǎng), 基因得到表達(dá), 推測(cè)其在甘薯抵御鹽脅迫后期發(fā)揮了作用。

AP2/ERF家族是植物中特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子家族, 可以通過(guò)結(jié)合啟動(dòng)子中的特定基序來(lái)調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)[44]。在鹽脅迫下, 擬南芥可以與啟動(dòng)子中的DRE元件特異結(jié)合從而調(diào)控下游基因的表達(dá), 使轉(zhuǎn)基因擬南芥獲得更高的抗性, 表明在植物的抗逆性上具有積極正向的調(diào)控作用[45]。本研究中,僅在耐鹽品種中特異表達(dá), 推測(cè)其有可能發(fā)揮了自身調(diào)節(jié)功能, 增強(qiáng)甘薯的耐鹽性。盡管大多數(shù)AP2/ERF家族成員被當(dāng)作轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮作用, 但仍有一部分ERF-B1亞族的成員由于包含EAR基序, 被作為轉(zhuǎn)錄抑制因子, 通過(guò)下調(diào)下游基因或其他轉(zhuǎn)錄因子的活性發(fā)揮作用[46-47]。和都被證實(shí)能夠受到高鹽誘導(dǎo), 轉(zhuǎn)和轉(zhuǎn)的擬南芥植株相較野生型都呈現(xiàn)出更高的鹽敏感性, 表明其在植物抵御逆境過(guò)程中起到了抑制作用[46-49]。本研究中,和僅在不耐鹽品種中特異表達(dá), 推測(cè)這2個(gè)基因的特異表達(dá)有可能抑制了下游目標(biāo)基因的表達(dá), 削弱了該甘薯品種的耐鹽性。

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Transcriptome sequencing analysis of different sweet potato varieties under salt stress

ZHANG Xiao-Hong, PENG Qiong, and YAN Zheng*

Fuzhou Institute of Agricultural Sciences, Fuzhou 350018, Fujian, China

The objective of this study is to obtain the salt tolerant transcriptome sequence information of sweet potato, mine and identify the differentially expressed genes and their related metabolic pathways. Rongshu 819 (salt-tolerant variety) and Rongshu 910 (salt-sensitive variety) under salt treatment for 0, 3, and 6 days were conducted for the transcriptome by high-throughput sequencing. The results showed that a total of 157,252 Unigenes with an average length of 576 bp were obtained from the two varieties. The 83,264 Unigenes, accounting for 52.95% of the total Unigenes, were annotated in the 7 functional databases. NR annotation revealed that sweet potato Unigenes had the most homologous sequences inwith a total of 43,620 accounting for 57.05%. The annotation of Unigenes in the KOG database is mainly concentrated in general functional prediction only (8752), signal transformation mechanisms (5067), and post translation modification, protein transformation, molecular chaperones (4471). The qRT-PCR indicated that, in Rongshu 819, the number of differentially expressed genes in 3 days and 6 days of salt treatment was 3752 and 807, respectively, which classified into 33 GO functional categories and 302 KEGG metabolic pathways. In Rongshu 910, the number of differentially expressed genes in 3 days and 6 days of salt treatment was 5554 and 7395, respectively, which classified into 50 GO functional categories and 329 KEGG metabolic pathways. The heat map was drawn based on the transcriptome data of partial differentially expressed genes. The result showed that 7 differentially expressed β-Glucosidase genes annotated into starch and sucrose metabolic pathway were up-regulated in salt-tolerant variety while down-regulated in salt-sensitive variety. Seven calmodulin-like genes annotated into Ca2+signaling pathway were specifically expressed in two varieties, among which 2 were specifically up-regulated in salt-tolerant variety and 5 were specifically down-regulated in salt-sensitive variety. The expression heat map of differentially expressed transcription factors indicated thatwas only specifically expressed in salt-tolerant varieties,,,, andwere only specifically expressed in salt-sensitive varieties, whilewas down-regulated in salt-tolerant varieties and up-regulated in salt-sensitive varieties. In conclusion, the number of Unigenes obtained from transcriptome of sweet potato under salt stress was large and the sequence information was rich. The differentially expressed genes and high abundance transcription factors may play an important role in sweet potato response to salt stress.

sweet potato; salt stress; transcriptome; high-throughput sequencing

10.3724/SP.J.1006.2023.24143

本研究由福建省科技廳引導(dǎo)性項(xiàng)目(2019N0037)資助。

This study was supported by the Guiding Project of Science and Technology Department of Fujian Province (2019N0037).

鄢錚, E-mail: moosey@163.com

E-mail: ahjane@163.com

2022-06-16;

2022-10-11;

2022-10-17.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20221017.1428.008.html

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