CBL互作蛋白激酶GmCIPK10增強大豆耐鹽性

李 慧 路依萍 汪小凱 王璐瑤 邱婷婷 張雪婷 黃海燕 崔曉玉,*

CBL互作蛋白激酶GmCIPK10增強大豆耐鹽性

李 慧1,2路依萍1汪小凱1王璐瑤1邱婷婷1張雪婷1黃海燕1崔曉玉1,*

1臨沂大學農(nóng)林科學學院, 中國山東臨沂 276000;2菲律賓克里斯汀大學國際學院, 菲律賓 1004

鹽脅迫嚴重威脅大豆產(chǎn)量和品質。類鈣調磷酸酶B亞基互作蛋白激酶(CIPKs)在植物應對環(huán)境脅迫過程中發(fā)揮重要作用。但是, 目前對大豆CIPKs的生物學功能知之甚少。本研究從大豆基因組克隆到。生物信息學分析結果表明,屬于不含內(nèi)含子型CIPKs, 包含一個絲氨酸(Ser)/蘇氨酸(Thr)蛋白激酶結構域和NAF/FISL基序。表達模式分析結果表明, 在鹽(NaCl)、甲基紫精(MV)和過氧化氫(H2O2)處理下,的轉錄水平升高。在擬南芥和大豆毛狀根中過表達能夠提高轉基因植株的抗鹽性。進一步的生理指標測定發(fā)現(xiàn), 在鹽脅迫下, 過表達能夠降低轉基因植株中丙二醛(MDA)和H2O2積累, 增強抗氧化酶活性以及降低鈉離子(Na+)/鉀離子(K+)比值。此外, qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)促進抗氧化和耐鹽相關基因表達響應鹽脅迫。酵母雙雜交、Pull-down和雙分子熒光互補試驗結果證明GmCIPK10與鈣離子(Ca2+)感應器GmCBL4相互作用。這些結果為解析CBL-CIPK信號通路在大豆鹽脅迫應答的作用提供了參考。

; 耐鹽性; ROS清除; Na+/K+穩(wěn)態(tài); 大豆

陸生植物是固著生物, 經(jīng)常遇到各種逆境, 包括鹽、干旱和極端溫度等。在進化過程中, 植物進化出復雜的策略以適應不利的環(huán)境條件[1]。鈣離子(calcium, Ca2+)是植物體內(nèi)一種普遍存在的次級信使,參與調節(jié)植物的生長發(fā)育、營養(yǎng)吸收和脅迫響應等諸多生理過程[2]。不良環(huán)境刺激觸發(fā)胞質Ca2+濃度的時空變化[3]。Ca2+依賴蛋白激酶、類鈣調磷酸酶B亞基(calcineurin B subunits, CBLs)和鈣調素等Ca2+傳感器感知Ca2+濃度變化, 隨后與其下游靶蛋白相互作用, 引發(fā)植物一系列生理代謝變化, 應對外界環(huán)境的改變[1-4]。

CBLs本身沒有激酶活性, 通過特異性的與其互作蛋白激酶(CBL-interacting protein kinases, CIPKs)結合, 形成一套植物特有的Ca2+信號轉導系統(tǒng)[2-3]。CIPKs編碼絲氨酸(serine, Ser)/蘇氨酸(threonine, Thr)蛋白激酶, 與蔗糖非酵解型蛋白激酶3亞族成員結構和功能高度相似[5]。CIPKs的激酶催化結構域位于N端, 具有一個激活環(huán)和一個ATP結合位點。毗鄰連接域, 在CIPKs的C端鑒定到一個NAF/FISL基序, 該基序與CBLs結合時不可或缺[3-4]。CBL-CIPK信號通路在篩選擬南芥鹽敏感突變體過程中初次被發(fā)現(xiàn)[6]。AtCBL4與AtCIPK24互作, 激活鈉離子(sodium, Na+)/氫離子(hydrogen, H+)轉運蛋白AtNHX7, 維持擬南芥根部組織的Na+穩(wěn)態(tài), 而AtCBL10-AtCIPK24復合物主要提高莖部組織的耐鹽性[6-8]。AtCBL2和AtCBL3與AtCIPK21互作, 增強擬南芥對鹽脅迫和滲透脅迫的耐受性[9]。在低鉀(K+, potassium)脅迫下, AtCBL1/9-AtCIPK23復合物激活K+通道蛋白AKT1, 促進植物吸收K+[10]。AtCIPK1分別與AtCBL1和AtCBL9結合, 通過ABA依賴途徑和ABA非依賴途徑響應干旱脅迫[11]。已被證明正向調控擬南芥的耐鹽性和氮元素的吸收[12-13]。

隨后的基因組學和生物信息學研究陸續(xù)在水稻()[14]、辣椒()[15]、煙草()[16]、油菜()[17]和小麥()[18]等植物基因組中鑒定到CIPKs的同源基因。Ma等[19]研究發(fā)現(xiàn), CaCBL2與CaCIPK3互作, 調節(jié)茉莉酸信號傳遞和抗氧化系統(tǒng)在辣椒應答干旱脅迫過程中發(fā)揮重要作用。在煙草應對干旱和鹽脅迫中發(fā)揮關鍵作用, 能夠調控脯氨酸合成響應干旱和鹽脅迫[20]。參與調節(jié)野生大麥對干旱、鹽和ABA脅迫的響應,過表達可以抑制擬南芥的鹽敏感表型[21]。低溫脅迫促使的轉錄水平增加, 水稻植株過表達表現(xiàn)出耐寒表型[14]。研究表明通過調節(jié)氣孔運動和增強抗氧化酶活性參與小麥干旱脅迫應答[22]。GmCBL1與GmCIPK2互作, 通過調節(jié)氣孔開閉和滲透物質合成, 降低干旱對大豆植株的損傷[23]。BnCBL1-BnCIPK6復合體在調節(jié)油菜高鹽、低磷和ABA應答反應中發(fā)揮重要作用[17]。

大豆是一種重要的經(jīng)濟作物, 也是食用油、優(yōu)質蛋白質和工業(yè)產(chǎn)品的重要來源[24]。鹽脅迫嚴重限制了全球大豆的產(chǎn)量提高和品質改善[25]。眾多研究表明, CIPKs在增強植物環(huán)境脅迫的耐受性方面具有重要作用[1-4], 但其在大豆適應鹽脅迫中的生物學作用尚不清楚。本研究在大豆基因組鑒定到鹽脅迫誘導基因。轉基因植株抗鹽鑒定和生理指標測結果表明,過表達增強了擬南芥和大豆毛狀根的耐鹽性, 并且在鹽處理條件下具有清除活性氧(reactive oxygen species, ROS)和降低Na+/K+比值的積極作用。綜上所述,具有在大豆對鹽脅迫的響應中具有調節(jié)ROS穩(wěn)態(tài)和Na+/K+平衡的作用。

1 材料與方法

1.1 植物材料和生長條件

本研究以大豆品種Williams 82為研究材料。將10粒大小一致的大豆種子均勻播種在濕潤的蛭石中, 并放置于光照16 h/黑暗8 h、25℃、相對濕度70%的人工智能培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。14 d后, 選取相同大小的大豆植株分別轉入含有200 mmol L–1NaCl、20 μmol L–1甲基紫精(methyl viologen, MV)和10 mmol L–1過氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)的1/2 Hoagland溶液中進行脅迫處理。在0、1、3、6、12和24 h分別采集大豆葉片, 用于提取大豆總RNA。

本研究使用的擬南芥材料為Col-0。種皮表面殺菌后的擬南芥種子播種在1/2 MS培養(yǎng)基上, 4℃黑暗春化3 d。然后, 將這些種子放置于在光照16 h/黑暗8 h、23℃、相對濕度70%的人工智能培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2 實時定量

利用植物總RNA提取試劑盒(Zomanbio)提取采集的植物材料總RNA。然后, 以這些RNA為模板合成后續(xù)實時定量(quantative real time-PCR, qRT-PCR)分析所需的cDNA。qRT-PCR反應按照SYBR Premix ExRT-PCR試劑盒(TaKaRa)的使用方法, 在7500 Real-time PCR System (Applied Biosystems)上進行, 引物見表1。qRT-PCR試驗反應程序為94℃預變性3 min; 94℃變性5 s, 58℃退火15 s, 72℃延伸10 s, 共計42個循環(huán)。以大豆(Glyma. 08G014200)作為內(nèi)參, 參照2–ΔΔCt法計算目的基因的表達水平。

表1 本研究所使用的引物

1.3 轉基因材料構建

轉基因擬南芥采用農(nóng)桿菌浸染擬南芥花序的方法。參照Wang等[24]報道的方法, 利用農(nóng)桿菌介導的大豆發(fā)狀根構建系統(tǒng)構建轉基因大豆株系, 將基因編碼區(qū)序列插入pCAMBIA3301大豆遺傳轉化載體, 轉入根癌農(nóng)桿菌, 用于侵染大豆下胚軸。待下胚軸生出發(fā)狀根, 去除原生根, 采集發(fā)狀根檢測基因表達量, 完成- overexpression(OE)過表達大豆植株制作。

1.4 耐鹽鑒定

T3代-OE擬南芥的種子用于研究響應鹽脅迫的功能。消毒殺菌后的擬南芥種子播種在1/2 MS培養(yǎng)基上。正常生長7 d后, 將大小一致的幼苗轉移到含有75 mmol L–1NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。10 d后測定主根長、H2O2含量以及丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量。用游標卡尺測定主根長。使用MDA含量檢測試劑盒(BC0025, Solarbio)測定MDA含量, 參照說明書進行試驗。使用H2O2含量檢測試劑盒(BC3595, Solarbio)測定H2O2含量。在大豆植株耐鹽鑒定試驗中, 大豆種子播種在裝有營養(yǎng)土壤和蛭石(1∶1)的花盆中, 每盆10棵, 設置3個重復。在大豆正常生長2周后, 將200 mmol L–1NaCl溶液澆灌到托盤底部, 對大豆進行鹽脅迫處理。處理10 d后, 過表達和對照植株的萎蔫程度出現(xiàn)明顯差異, 統(tǒng)計存活率。MDA含量、H2O2含量、抗氧化酶活性、Na+含量和K+含量測定使用鹽處理7 d后的大豆發(fā)狀根。使用CAT活性檢測試劑盒(BC0205, Solarbio)測定CAT活性。使用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀法[32]測定Na+含量和K+含量。

1.5 酵母雙雜交

利用Matchmaker酵母雙雜交系統(tǒng), 按照醋酸鋰介導的酵母轉化方法將pGADT7 (AD)、pGBKT7 (BD)、-AD和-BD質粒分別組合, 然后轉入酵母感受態(tài)細胞中進行培養(yǎng)。將轉化后的酵母菌株涂抹先后涂抹在二缺(-Leu/-Trp)培養(yǎng)基和四缺培養(yǎng)基(-Ade/-His/-Leu/-Trp), 在30℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng), 最后用X-α-gal檢測報告基因活性。

1.6 Pull-down試驗

將pCold-和pGEX-4T-1-分別轉化到大腸桿菌感受態(tài)中, 誘導表達GmCIPK10-His和GmCBL4-GST融合蛋白。然后使用Ni-NTA樹脂純化GmCIPK10-His融合蛋白, 然后使用200 mmol L-1的咪唑緩沖液進行洗脫, 獲得可溶性的GmCIPK10-His融合蛋白。GST樹脂純化GmCBL4-GST融合蛋白和GST對照蛋白, 分別與可溶性的GmCIPK10-His融合蛋白進行結合試驗。最后通過聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜以及免疫印跡試驗檢測GmCIPK10是否能結合GmCBL4。

1.7 雙分子熒光互補試驗

采用PEG介導的原生質體轉化方法, 分別將-pSPYCE(cYFP) + pSPYNE (nYFP)、cYFP +-nYFP和-cYFP +- nYFP轉化到同一個原生質體細胞中共表達, 進行雙分子熒光互補(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)試驗。轉化后原生質體在23℃的黑暗環(huán)境中培養(yǎng)12 h, 然后在激光共聚焦顯微鏡(LSM700)下觀察黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein, YFP)信號。

1.8 統(tǒng)計分析

每個試驗設3個重復, 使用SPSS數(shù)據(jù)分析軟件,采用單因素方差分析(ANOVA)分析不同基因型植株間的差異。

2 結果與分析

2.1 GmCIPK10基因序列和蛋白結構

CIPKs在植物逆境適應過程中起著至關重要的作用。迄今為止, 已經(jīng)從大豆基因組中鑒定到52個基因, 但它們在鹽脅迫應答中的功能仍在很大程度上未知。在大豆的這些基因中, Glyma.

18G055000編碼一個Ser/Thr蛋白激酶, 在其C端含有一個NAF/FISL基序, 屬于CIPK家族蛋白激酶(圖1-A)。BLASTP和多序列比對分析表明, Glyma. 18G055000編碼的氨基酸序列與AtCIPK10、VvCIPK10和OsCIPK10有很高的序列相似性, 因此將該基因命名為(圖1-A)。此外, 系統(tǒng)發(fā)育樹分析GmCIPK10和26個AtCIPKs的結果表明, GmCIPK10和AtCIPK10親緣關系最近, 屬于不含內(nèi)含子型CIPK蛋白激酶(圖1-B)。

2.2 GmCIPK10基因響應鹽和氧化脅迫的表達模式

鑒于CIPKs在植物逆境應答中的重要作用, 本研究采用qRT-PCR的方法測定在鹽脅迫和氧化脅迫處理下的表達特征進行檢測。當大豆植株經(jīng)受鹽脅迫時,基因轉錄本增加, 在3 h積累量達到最高值, 隨后逐漸恢復至正常水平(圖2-A)。此外,對氧化脅迫有響應。MV和H2O2均能提高的轉錄水平, 分別在3 h和6 h達到最大值(圖2-B, C)。

圖1 GmCIPK10的蛋白結構和進化關系分析

圖2 GmCIPK10響應鹽脅迫和氧化脅迫的表達模式

以為內(nèi)參基因, 每組3棵, 3次生物學重復。MV: 甲基紫精。*:< 0.05。

is used as an internal control; each group contains three seedlings for three biological replicates. MV: methyl viologen. *:< 0.05.

2.3 GmCIPK10過表達提高轉基因擬南芥的耐鹽性

為探究在鹽脅迫應答反應中的作用, 采用農(nóng)桿菌浸染花序的方法構建了過表達的轉基因擬南芥(OE2、OE3和OE7), 并且通過RT-PCR的方法對陽性擬南芥植株進行鑒定(圖3-C)。在正常生長條件下,-OE和野生型(wild-type, WT)擬南芥植株生長狀況類似。然而, 在鹽處理條件下,-OE和WT的植株表型和生理性狀存在顯著差異。與WT相比,- OE擬南芥植株耐鹽性更好, 主根長明顯增加(圖3-A, B)。鹽脅迫促進丙二醛(malondialdenhyde, MDA)和H2O2的過量積累, 對細胞膜造成氧化脅迫[18-19]。在本研究中, 鹽處理-OE植株的MDA和H2O2積累量顯著低于對照植株(圖3-D, E)。

2.4 GmCIPK10過表達促進轉基因大豆發(fā)狀根的耐鹽性

為進一步驗證在增強大豆耐鹽性方面的作用, 通過農(nóng)桿菌介導的大豆發(fā)狀根轉化系統(tǒng), 本研究構建了-OE大豆發(fā)狀根。qRT-PCR檢測結果顯示, 與載體對照(vector control, VC)相比,-OE大豆發(fā)狀根中的轉錄水平顯著提高(圖4-C)。在正常情況下,-OE和VC幼苗在表型和生理代謝上均無差異。經(jīng)過鹽脅迫處理后,-OE幼苗在鹽脅迫下表現(xiàn)明顯優(yōu)于對照植株, 存活率顯著提高(圖4-A, B)。此外, 鹽脅迫增加了MDA和H2O2在大豆發(fā)狀根的積累, 但鹽處理的-OE發(fā)狀根中累積的MDA和H2O2水平低于VC發(fā)狀根(圖4-D, E)。抗氧化酶擔負著清除ROS, 維持細胞氧化還原平衡的關鍵作用[19]。定量檢測抗氧化酶活性發(fā)現(xiàn), 與VC相比, 鹽脅迫處理的-OE發(fā)根中的過氧化氫酶(catalase, CAT)活性和過氧化物酶活性(peroxidase, POD)活性顯著增強(圖4-F, G)。此外, Na+/K+比值與植物的耐鹽性呈正負關。在鹽脅迫處理條件下,- OE發(fā)狀根中的K+含量高于VC發(fā)狀根(圖4-H)。鹽脅迫處理的-OE發(fā)狀根中的Na+含量低于VC發(fā)狀根(圖4-I)。因此, 在鹽脅迫處理條件下,-OE發(fā)狀根的Na+/K+比率低于VC發(fā)狀根(圖4-J)。

2.5 GmCIPK10激活鹽脅迫和氧化脅迫相關基因的表達響應鹽脅迫

為闡明介導的鹽脅迫適應機制, 采用qRT-PCR方法測定了正常和鹽脅迫處理后毛-OE和VC大豆發(fā)狀根中脅迫應答基因的轉錄水平。在正常環(huán)境條件下,-OE和VC發(fā)狀根中的脅迫應答基因表達水平?jīng)]有顯著差異。然而, 鹽處理顯著促進鹽脅迫和氧化脅迫相關基因的表達。在鹽脅迫處理條件下,-OE發(fā)狀根中的氧化脅迫應答基因(和)和鹽脅迫響應基因(、、、、和)的轉錄水平均高于對照發(fā)狀根(圖5)。

圖3 過表達GmCIPK10提高轉基因擬南芥的耐鹽性

A和B:-OE和WT擬南芥植株經(jīng)鹽脅迫(75 mmol L-1NaCl)處理10 d后的表型和主根長; C:基因表達量; D: MDA含量; E: H2O2含量; 每組4棵, 3次生物學重復; WT: 野生型; OE: 過表達。*:< 0.05。

A, B: the phenotypes and primary root length of-OE and WTplants with salt treatment (75 mmol L-1NaCl) for 10 days; C: the expression level ofgenes; D: MDA content; E: H2O2content; Each group contained four seedlings for three biological replicates; WT: wild type; OE: overexpression. *:< 0.05.

圖4 過表達GmCIPK10提高轉基因大豆發(fā)狀根的耐鹽性

A和B:-OE和VC大豆植株的表型經(jīng)鹽脅迫(200 mmol L–1NaCl)處理10 d后的表型和成活率; C:基因表達量;-OE和VC大豆植株經(jīng)鹽脅迫處理7 d后的; D: MDA含量; E: H2O2含量; F: CAT活性; G: POD活性; H: K+離子含量; I: Na+離子含量; J: Na+/K+比值; 每組10 棵, 3次生物學重復; VC: 載體對照; OE: 過表達; FW: 鮮重; DW: 干重。*:< 0.05。

A, B: the phenotype and survival rate of-OE and VC soybean plants with salt treatment (200 mmol L–1NaCl) for 10 days; C: the expression level ofgenes; D: MDA content; E: H2O2content; F: CAT activity; G: POD activity; H: K+content; I: Na+content; J: Na+/K+ratio of-OE and VC soybean plants with salt treatment for 7 days; VC: vector control; OE: overexpression; FW: fresh weight; DW: drought weight. *:< 0.05.

(圖5)

每組3棵, 3次生物學重復。VC: 載體對照; OE: 過表達。*:< 0.05。

Each group contained four seedlings for three biological replicates. VC: vector control; OE: overexpression. *:< 0.05.

2.6 GmCBL4是GmCIPK10的互作蛋白

CBLs通常與特定的CIPKs結合形成復合體, 影響植物對逆境環(huán)境的耐受性。本研究使用酵母雙雜交系統(tǒng), 鑒定與GmCIPK10相互作用的候選CBL蛋白。當對照載體AD和BD、-AD和BD、AD和-BD在酵母菌株中共表達時, 報告基因未被激活。而當-AD和-BD載體共表達, 能夠激活報告基因(圖6-A)。因此, 初步斷定GmCBL4是GmCIPK10候選互作蛋白。

接下來, 本研究采用Pull-down系統(tǒng)確定GmCBL4和GmCIPK10之間的互作關系, 在大腸桿菌中誘導表達GmCBL4-GST和GmCIPK10- His融合蛋白, 分別用Ni-NTA樹脂和GST樹脂進行純化。在結合反應實驗中, 分別使用吸附在樹脂上的GmCBL4-GST和對照GST蛋白去吸附可溶性的CIPK10-His蛋白。然后收集和清洗反應后的蛋白復合物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳和轉膜, 并使用His抗體進行免疫印跡實驗。結果表明, GmCBL4-GST能夠結合GmCIPK10-His融合蛋白, 而GST對照蛋白則不能(圖6-B)。此結果證明GmCIPK10能夠特異性結合GmCBL4。

為進一步確定GmCBL4和GmCIPK10之間的互作關系, 本研究進行了BiFC試驗。采用PEG介導的轉化方法, 分別將-cYFP + nYFP、cYFP +-nYFP和-cYFP +- nYFP質粒轉化到同一個原生質體細胞中共表達。結果表明, 當-cYFP +-nYFP在原生質體中共表達時, 能夠在原生質體中觀察到YFP信號。然而, 共表達-cYFP + nYFP或者cYFP +-nYFP的原生質體無法觀察到YFP信號(圖6-C)。此結果進一步證實明GmCIPK10能夠與GmCBL4特異性結合。

圖6 GmCBL4與GmCIPK10互作

A: 酵母雙雜交檢測GmCBL4和GmCIPK10互作; B: Pull-down檢測GmCBL4和GmCIPK10互作; C: BiFC檢測GmCBL4和GmCIPK10互作。BiFC: 雙分子熒光互補; YFP: 黃色熒光蛋白。標尺為12 μm。

A: yeast two-hybrid analysis of GmCBL4 interaction with GmCIPK10; B:pull-down assays of the interaction of GmCBL4 with GmCIPK10; C:BiFC assays of the interaction of GmCBL4 with GmCIPK10. BiFC: bimolecular fluorescence complementation; YFP: yellow fluorescent protein. Bar: 12 μm.

3 討論

眾多研究表明CIPKs在植物適應鹽脅迫的過程中發(fā)揮了關鍵作用[26-27]。近年來, 大豆全基因組已經(jīng)完成測序, 但是關于大豆基因在鹽脅迫反應中的作用仍不清楚[28]。在試驗中, 分離到了鹽誘導基因(圖2-A), 其編碼蛋白包含一個NAF/FISL結構域, 屬于不含內(nèi)含子型CIPK蛋白激酶(圖1)。轉基因植株耐鹽鑒定試驗進一步證實, 在鹽脅迫處理下,過表達能夠促進擬南芥主根伸長和提高發(fā)狀根大豆植株的存活率(圖3和圖4)。因此,是緩解大豆鹽脅迫的正向調控因子。

鹽脅迫等逆境因素會激發(fā)ROS過度積累, 導致細胞氧化損傷, 甚造成細胞死亡[29-30]。H2O2是一種公認的中等活性的ROS, 可誘發(fā)氧化應激反應[27]。有研究表明CIPKs參與調節(jié)ROS清除緩解鹽誘導的氧化脅迫。和具有降低鹽誘導ROS積累的作用[29-30]。MDA含量通常用于反映ROS在應激條件下對細胞膜的破壞作用[30]。在本研究中, MV和H2O2處理促進了表達。進一步的生理性狀分析發(fā)現(xiàn), 鹽處理-OE擬南芥和發(fā)狀根的H2O2和MDA含量均顯著低于對照(圖3和圖4)。因此,參與減輕大豆氧化損傷以增強其耐鹽性的過程。

抗氧化酶是抗氧化防御系統(tǒng)的重要組成部分, 在維持ROS穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[30-31]。CIPKs已經(jīng)被證明可以調節(jié)抗氧化酶的活性以應對鹽脅迫。例如, Sun等[27]報道可以增強SOD、CAT和POD抗氧化酶的活性來清除鹽誘導的H2O2積累。過表達能夠提高轉基因植株中SOD和POD抗氧化酶活性, 以促進鹽誘導的H2O2清除[31]。在本研究中, 過表達增加了抗氧化相關基因和表達量(圖5-A, B)。進一步的抗氧化酶活性分析結果表明, 在鹽處理條件下, 與對照相比,-OE發(fā)狀根具有更強的POD和CAT抗氧化酶活性(圖4-F, G)。綜上所述,參與增強抗氧化酶活性, 促進清除鹽誘導的ROS。

K+是植物正常生長發(fā)育所必需的常量營養(yǎng)元素,參與調節(jié)酶促反應和滲透調節(jié)等生理過程[32-33]。在鹽脅迫條件下, 植物細胞內(nèi)過量積累的Na+會阻礙K+吸收, 破壞Na+/K+平衡, 引發(fā)細胞代謝紊亂[32-33]。研究表明CIPKs參與調節(jié)植物體內(nèi)Na+/K+平衡。通過激活轉基因煙草中和等基因表達, 降低細胞內(nèi)Na+的累積, 增加K+含量, 增強植株耐鹽性[16]。過表達能夠提高轉基因植株中、和表達, 提高細胞K+/Na+比值, 減少鹽脅迫對細胞的損傷[26]。編碼Na+/H+逆向轉運蛋白,通過將胞內(nèi)的Na+外排到胞外或將Na+區(qū)隔化到液泡中,來提高植株的抗鹽性[34]。能夠降低鹽處理的大豆莖葉內(nèi)的Na+積累量, 提高大豆幼苗的耐鹽性[35]。本研究發(fā)現(xiàn), 在鹽脅迫處理條件下,能夠增加大豆植株根部和莖部組織K+含量, 降低Na+含量和Na+/K+比值(圖4-H～J)。與此結果相對應, 鹽脅迫處理的大豆發(fā)狀根中的、和的表達量高于對照發(fā)狀根(圖5-D, G, H)。因此能夠增強Na+/K+穩(wěn)態(tài), 提高大豆的耐鹽性。

諸多研究表明CBLs與特定的CIPKs結合, 調控植物對環(huán)境刺激的適應[1-3]。例如, TaCBL1和TaCIPK23相互作用, 增加滲透物質積累和干旱應答基因表達來緩解干旱脅迫[18]; CaCBL1/6/7/8與CaCIPK13結合, 通過增加花青素積累和提高抗氧化酶活性來提高番茄的耐寒性[15]; 此外, GhCBL2與GhCIPK6在液泡膜結合, 激活糖轉運蛋白GhTST2表達, 進而調節(jié)棉花體內(nèi)糖代謝平衡[36]。在本研究中通過酵母雙雜交系統(tǒng)鑒定到GmCIPK10互作Ca2+感受器GmCBL4(圖6-A)。通過Pull-down技術和BiFC試驗進一步確認GmCIPK10與GmCBL4特異性結合(圖6-B, C)。表明, GmCIPK10可能通過與GmCBL4形成復合物, 影響生理代謝過程, 從而調節(jié)大豆的鹽脅迫應答反應。

4 結論

GmCIPK10是大豆鹽脅迫應答的正向調節(jié)因子。進一步的生理指標測定結果表明參與調控大豆抗氧化酶系統(tǒng)和Na+/K+穩(wěn)態(tài)提高大豆耐鹽性。此外, GmCIPK10與Ca2+信號感受器GmCBL4互作。這些結果為探究CBL-CIPK信號通路在大豆鹽脅迫應答中的作用提供了參考。

[1] Tang R J, Wang C, Li K, Luan S. The CBL-CIPK calcium signaling network: unified paradigm from 20 years of discoveries., 2020, 25: 604–617.

[2] Yu Q, An L, Li W. The CBL-CIPK network mediates different signaling pathways in plants., 2014, 33: 203–214.

[3] Ma X, Li Q H, Yu Y N, Qiao Y M, Haq S U, Gong Z H. The CBL-CIPK pathway in plant response to stress signals., 2020, 21: 5668.

[4] Luan S. The CBL-CIPK network in plant calcium signaling., 2009, 14: 37–42.

[5] Albrecht V, Ritz O, Linder S, Harter K, Kudla J. The NAF domain defines a novel protein-protein interaction module conserved in Ca2+-regulated kinases., 2001, 20: 1051–1063.

[6] Kudla J, Xu Q, Harter K, Gruissem W, Luan S. Genes for calcineurin B-like proteins inare differentially regulated by stress signals., 1999, 96: 4718–4723.

[7] Kudla J, Batistic O, Hashimoto K. Calcium signals: the lead currency of plant information processing., 2010, 22: 541–563.

[8] Quan R, Lin H, Mendoza I, Zhang Y, Cao W, Yang Y, Shang M, Chen S, Pardo J M, Guo Y. SCABP8/CBL10, a putative calcium sensor, interacts with the protein kinase SOS2 to protectshoots from salt stress., 2007, 19: 1415–1431.

[9] Pandey G K, Kanwar P, Singh A, Steinhorst L, Pandey A, Yadav A K, Tokas I, Sanyal S K, Kim B G, Lee S C, Cheong Y H, Kudla J, Luan S. Calcineurin B-like protein-interacting protein kinase CIPK21 regulates osmotic and salt stress responses in., 2015, 169: 780–792.

[10] Cheong Y H, Pandey G K, Grant J J, Batistic O, Li L, Kim B G, Lee S C, Kudla J, Luan S. Two calcineurin B-like calcium sensors, interacting with protein kinase CIPK23, regulate leaf transpiration and root potassium uptake in., 2007, 52: 223–239.

[11] D’Angelo C, Weinl S, Batistic O, Pandey G K, Cheong Y H, Schültke S, Albrecht V, Ehlert B, Schulz B, Harter K, Luan S, Bock R, Kudla J. Alternative complex formation of the Ca2+- regulated protein kinase CIPK1 controls abscisic acid dependent and independent stress responses in., 2006, 48: 857–872.

[12] Yin X, Xia Y, Xie Q, Cao Y, Wang Z, Hao G, Song J, Zhou Y, Jiang X. The protein kinase complex CBL10-CIPK8-SOS1 functions into regulate salt tolerance., 2020, 71: 1801–1814.

[13] Yasuda S, Aoyama S, Hasegawa Y, Sato T, Yamaguchi J.CBL-interacting protein kinases regulate carbon/nitrogen- nutrient response by phosphorylating ubiquitin ligase ATL31., 2017, 10: 605–618.

[14] Xiang Y, Huang Y, Xiong L. Characterization of stress-responsive CIPK genes in rice for stress tolerance improvement., 2007, 144: 1416–1428.

[15] M, X, Gai W X, Li Y, Yu Y N, Ali M, Gong Z H. The CBL-interacting protein kinase CaCIPK13 positively regulates defense mechanisms against cold stress in pepper., 2022, 73: 1655–1667.

[16] Lu L, Chen X, Zhu L, Li M, Zhang J, Yang X, Wang P, Lu Y, Cheng T, Shi J, Yi Y, Chen J. NtCIPK9: a calcineurin B-like protein-interacting protein kinase from the halophyte, enhancessalt tolerance., 2020, 11: 1112.

[17] Chen L, Ren F, Zhou L, Wang Q Q, Zhong H, Li X B. Thecalcineurin B-like 1/CBL-interacting protein kinase 6 (CBL1/CIPK6) component is involved in the plant response to abiotic stress and ABA signaling., 2012, 63: 6211–6222.

[18] Cui X Y, Du Y T, Fu J D, Yu T F, Wang C T, Chen M, Chen J, Ma Y Z, Xu Z S. Wheat CBL-interacting protein kinase 23 positively regulates drought stress and ABA responses., 2018, 18: 93.

[19] Ma X, Li Y, Gai W X, Li C, Gong Z H. Thegene positively regulates drought tolerance in pepper., 2021, 8: 216.

[20] Lu L, Chen X, Wang P, Lu Y, Zhang J, Yang X, Cheng T, Shi J, Chen J. CIPK11: a calcineurin B-like protein-interacting protein kinase from, confers tolerance to salt and drought in., 2021, 21: 123.

[21] Li R, Zhang J, Wu G, Wang H, Chen Y, Wei J. HbCIPK2, a novel CBL-interacting protein kinase from halophyte, confers salt and osmotic stress tolerance., 2012, 35: 1582–1600.

[22] Wang Y, Li T, John S J, Chen M, Chang J, Yang G, He G. A CBL-interacting protein kinase TaCIPK27 confers drought tolerance and exogenous ABA sensitivity in transgenic., 2018, 123: 103–113.

[23] Xu M, Li H, Liu Z N, Wang X H, Xu P, Dai S J, Cao X, Cui X Y. The soybean CBL-interacting protein kinase, GmCIPK2, positively regulates drought tolerance and ABA signaling., 2021, 167: 980–989.

[24] Wang F, Chen H W, Li Q T, Wei W, Li W, Zhang W K, Ma B, Bi Y D, Lai Y C, Liu X L, Man W Q, Zhang J S, Chen S Y. GmWRKY27 interacts with GmMYB174 to reduce expression of GmNAC29 for stress tolerance in soybean plants., 2015, 83: 224–236.

[25] Yu T F, Liu Y, Fu J D, Ma J, Fang Z W, Chen J, Zheng L, Lu Z W, Zhou Y B, Chen M, Xu Z S, Ma Y Z. The NF-Y-PYR module integrates the abscisic acid signal pathway to regulate plant stress tolerance., 2021, 19: 2589–2605.

[26] Deng X, Hu W, Wei S, Zhou S, Zhang F, Han J, Chen L, Li Y, Feng J, Fang B, Luo Q, Li S, Liu Y, Yang G, He G., a CBL-interacting protein kinase gene from wheat, confers salt stress tolerance in transgenic tobacco., 2013, 8: e69881.

[27] Sun T, Wang Y, Wang M, Li T, Zhou Y, Wang X, Wei S, He G, Yang G. Identification and comprehensive analyses of the CBL and CIPK gene families in wheat (L)., 2015, 15: 269.

[28] Zhu K, Chen F, Liu J, Chen X, He T, Cheng Z M. Evolution of an intron-poor cluster of the CIPK gene family and expression in response to drought stress in soybean., 2016, 6: 28225.

[29] Luo Q, Wei Q, Wang R, Zhang Y, Zhang F, He Y, Zhou S, Feng J, Yang G, He G. BdCIPK31, a calcineurin B-like protein- interacting protein kinase, regulates plant response to drought and salt stress.,2017, 8: 1184.

[30] Chen X, Huang Q, Zhang F, Wang B, Wang J, Zheng J. ZmCIPK21, a maize CBL-interacting kinase, enhances salt stress tolerance in., 2014, 15: 14819–14834.

[31] Su Y, Guo A, Huang Y, Wang Y, Hua J. GhCIPK6a increases salt tolerance in transgenic upland cotton by involving in ROS scavenging and MAPK signaling pathways., 2020, 20: 421.

[32] Li M, Chen R, Jiang Q, Sun X, Zhang H, Hu Z. GmNAC06, a NAC domain transcription factor enhances salt stress tolerance in soybean., 2021, 105: 333–345.

[33] Chen Y, Han Y, Kong X, Kang H, Ren Y, Wang W. Ectopic expression of wheat expansin gene TaEXPA2 improved the salt tolerance of transgenic tobacco by regulating Na+/K+and antioxidant competence., 2017, 159: 161–177.

[34] Yang L, Han Y, Wu D, Yong W, Liu M, Wang S, Liu W, Lu M, Wei Y, Sun J. Salt and cadmium stress tolerance caused by overexpression of theNa+/H+antiporter (GmNHX1) gene in duckweed (5511)., 2017, 192, 127–135.

[35] Qu Y, Guan R, Bose J, Henderson S W, Wege S, Qiu L, Gilliham M. Soybean CHX-type ion transport protein GmSALT3 confers leaf Na+exclusiona root derived mechanism, and Cl–exclusion via a shoot derived process., 2021, 44: 856–869.

[36] Deng J, Yang X, Sun W, Miao Y, He L, Zhang X. The calcium sensor CBL2 and its interacting kinase CIPK6 are involved in plant sugar homeostasisinteracting with tonoplast sugar transporter TST2., 2020, 183: 236–249.

GmCIPK10, a CBL-interacting protein kinase promotes salt tolerance in soybean

LI Hui1,2, LU Yi-Ping1, WANG Xiao-Kai1, WANG Lu-Yao1, QIU Ting-Ting1, ZHANG Xue-Ting1, HUANG Hai-Yan1, and CUI Xiao-Yu1,*

1College of Agriculture and Forestry Sciences, Linyi University, Linyi 276000, Shandong, China;2Center for International Education, Philippine Christian University, 1004, the Philippines

Salt stress seriously restricts the yield and quality of soybean. Calcineurin B subunit-interacting protein kinases (CIPKs) play a vital role in response to environmental stresses in plant. However, few study is known about the biological function of soybean CIPKs. In this study,was cloned from soybean genome. Bioinformatics analysis exhibited thatencoded an intron-poor type CIPKs with a serine (Ser)/threonine (Thr) protein kinase domain and a NAF/FISL motif. The relative expression pattern levels showed that the transcript level ofwas increased under NaCl, MV, and H2O2treatments. Overexpression ofinand soybean hairy roots improved salt tolerance of transgenic plants. Further physiological indicator assays demonstrated thatoverexpression could decrease the accumulation of MDA and H2O2, enhance the activity of antioxidant enzymes, and reduce sodium (Na+)/potassium (K+) in transgenic plants under salt stress. In addition, qRT-PCR illustrated thatpromoted the relative expression level of antioxidant- and salt tolerance-related gene in salt stress. The yeast two-hybrid, pull-down, and bimolecular fluorescence complementation experiments confirmed that GmCIPK10 interacts with the Ca2+sensor GmCBL4. These results provide a reference for investigating the role of the CBL-CIPK signaling pathway in response to salt stress in soybean.

; salt tolerance; ROS scavenging; Na+/K+homeostasis; soybean

10.3724/SP.J.1006.2023.24070

本研究由國家自然科學基金項目(32001459)和山東省自然科學基金項目(ZR2020QC123)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (32001459) and the Natural Science Foundation of Shandong Province (ZR2020QC123).

崔曉玉, E-mail: cuixiaoyu@lyu.edu.cn

E-mail: lihuiqau@163.com

2022-03-29;

2022-07-21;

2022-08-18.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220817.1454.002.html

This is an open access article under the CC BY-NC-ND license (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).