花生InDel標(biāo)記開發(fā)及其在含油量QTL定位中的應(yīng)用

陶順玉 吳 貝 劉 念 羅懷勇 黃 莉 周小靜 陳偉剛 郭建斌 喻博倫 雷 永 廖伯壽 姜慧芳

花生InDel標(biāo)記開發(fā)及其在含油量QTL定位中的應(yīng)用

陶順玉 吳 貝 劉 念 羅懷勇 黃 莉 周小靜 陳偉剛 郭建斌 喻博倫 雷 永 廖伯壽 姜慧芳*

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所 / 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖北武漢 430062

培育高含油量品種是花生重要的育種目標(biāo), 開發(fā)穩(wěn)定高效的分子標(biāo)記對(duì)于標(biāo)記輔助選擇花生高含油量品種具有重要價(jià)值。本研究針對(duì)2個(gè)含油量差異顯著的親本徐花13 (高含油量)和中花6號(hào)(低含油量), 利用PacBio三代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)基因組結(jié)構(gòu)變異, 分別從徐花13和中花6號(hào)中檢測(cè)到35,794個(gè)和74,703個(gè)結(jié)構(gòu)變異。根據(jù)雙親結(jié)構(gòu)變異信息, 針對(duì)前期定位的含油量區(qū)間開發(fā)InDel (插入/缺失)標(biāo)記84個(gè), 其中9個(gè)InDel標(biāo)記的擴(kuò)增片段證實(shí)在雙親間具有多態(tài)性?；赗IL (重組自交系)群體中的雜合殘余獲得的NIL (近等基因系)構(gòu)建的一個(gè)包含1160個(gè)單株的F2群體, 使用9個(gè)多態(tài)性InDel標(biāo)記鑒定其基因型, 構(gòu)建了總長(zhǎng)度為149.84 cM的局部遺傳連鎖圖譜。結(jié)合F2群體的含油量表型數(shù)據(jù), 將該含油量QTL定位在標(biāo)記M23至M11之間, 位于A08染色體1.2 Mb區(qū)段內(nèi)。本試驗(yàn)證實(shí)了InDel標(biāo)記開展花生含油量QTL定位的可行性, 其定位的含油量位點(diǎn)及其緊密連鎖的InDel標(biāo)記能夠?yàn)榛ㄉ肿訕?biāo)記輔助育種提供理論和技術(shù)指導(dǎo)。

花生; 基因組測(cè)序; InDel; 含油量

花生(L.)作為植物油脂和蛋白的重要來源, 是全球重要的油料、經(jīng)濟(jì)作物。我國(guó)是世界上花生總產(chǎn)量和消費(fèi)量最大的國(guó)家, 花生單產(chǎn)量和總產(chǎn)量均居我國(guó)油料作物首位。在所有油料作物中花生單位產(chǎn)油量最高, 是僅次于油菜的第二大植物油來源[1], 具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值, 對(duì)我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展和食用油供給安全具有重要意義。目前我國(guó)食用油的自給率低, 對(duì)外依存度大, 約70%的食用油供給依賴進(jìn)口[2]。為保障食用油供給安全, 提高花生含油量成為花生育種工作者的首要目標(biāo)。

研究花生含油量的遺傳規(guī)律對(duì)促進(jìn)花生基因型改良的發(fā)展至關(guān)重要, 花生含油量變異豐富, 范圍為31.07%～60.26%[3-4], 遺傳改良潛力較大。目前花生育種主要根據(jù)多個(gè)環(huán)境下鑒定的表型數(shù)據(jù)對(duì)高含油量花生品種進(jìn)行選擇, 培育周期長(zhǎng)[5], 利用分子標(biāo)記輔助選擇目標(biāo)性狀能夠提高選擇效率, 加快育種進(jìn)程。然而異源四倍體栽培花生基因組大且結(jié)構(gòu)復(fù)雜[6], 全基因多態(tài)性分子標(biāo)記開發(fā)難度大。目前報(bào)道的花生含油量穩(wěn)定主效QTL位點(diǎn)不多, Shasidhar等[7]利用F2群體鑒定到8個(gè)與含油量相關(guān)的QTL, 其中2個(gè)主效QTL (和), 分別位于標(biāo)記Ah5507-Ah5719和Ah3864-Ah2573之間; Wilson等[8]利用SSR標(biāo)記定位到3個(gè)穩(wěn)定的含油量QTL,獲得與含油量緊密相關(guān)的標(biāo)記2個(gè); Guo等[9]在不同環(huán)境下鑒定到2個(gè)穩(wěn)定主效的QTL (和), 證實(shí)了緊密連鎖的標(biāo)記Ai06B29452和AGGS2133-1與花生含油量相關(guān)。這些含油量QTL主效位點(diǎn)定位區(qū)間較大, 可利用的信息少, 難以指導(dǎo)含油量分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)的開發(fā)。因此有必要加強(qiáng)含油量分子標(biāo)記開發(fā)研究, 為深化花生分子遺傳改良提供技術(shù)支撐。

InDel作為基因組主要的變異形式之一, 是遺傳標(biāo)記的豐富來源。InDel標(biāo)記屬于共顯性標(biāo)記[10], 廣泛分布于全基因組, 可根據(jù)目標(biāo)區(qū)域設(shè)計(jì)分子標(biāo)記[11],其檢測(cè)手段簡(jiǎn)單且擴(kuò)增效率高。近年來, 由于高通量測(cè)序成本低、周期短和效率高的特點(diǎn), 利用全基因組測(cè)序?qū)τH本進(jìn)行重測(cè)序, 與參考基因組序列進(jìn)行比對(duì), 檢測(cè)序列差異, 再根據(jù)基因組間結(jié)構(gòu)差異開發(fā)InDel多態(tài)性標(biāo)記[12], 對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行定位的研究已在玉米[13]、大白菜[14]、甜椒[15]、陸地棉[16]等報(bào)道。目前花生上已有InDel標(biāo)記開發(fā)的報(bào)道, 但僅應(yīng)用于抗病[17]和產(chǎn)量[18]相關(guān)研究, 在花生含油量性狀的應(yīng)用尚未見報(bào)道。

本課題組前期利用2個(gè)含油量差異明顯的高含油量徐花13和低含油量中花6號(hào)雜交構(gòu)建RIL群體, 對(duì)群體的含油量進(jìn)行檢測(cè), 結(jié)果顯示群體內(nèi)含油量性狀連續(xù)變異且出現(xiàn)超親分離, 連續(xù)2年鑒定到花生含油量QTL (), 能夠解釋9.76%～22.00%的表型變異, 初步定位在A08染色體的1.8 Mb區(qū)間內(nèi), 標(biāo)記區(qū)間為TClE5–AHZ851[19]。本研究在此基礎(chǔ)上對(duì)親本徐花13和中花6號(hào)進(jìn)行測(cè)序, 挖掘基因組結(jié)構(gòu)變異, 與參考基因組進(jìn)行比對(duì), 開發(fā)在目標(biāo)區(qū)段內(nèi)與含油量相關(guān)的InDel標(biāo)記, 在雙親中篩選出具有多態(tài)性的InDel標(biāo)記, 將鑒定出的多態(tài)性標(biāo)記對(duì)F2群體進(jìn)行基因分型, 同時(shí)結(jié)合表型數(shù)據(jù)定位花生含油量QTL (), 旨在為提高花生含油量及分子標(biāo)記育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

在前期通過RIL群體“徐花13 (含油量52.21%)×中花6號(hào)(含油量48.96%)”獲得含油量QTL位點(diǎn)基礎(chǔ)上, 篩選目標(biāo)位點(diǎn)為雜合基因型的單株自交獲得NIL, 通過NIL雜交構(gòu)建F2次級(jí)分離群體并種植于試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng), 每行12株, 行長(zhǎng)2 m, 行距0.33 m, 常規(guī)田間管理。

1.2 方法

1.2.1 InDel標(biāo)記開發(fā)及多態(tài)性篩選 選取親本苗期健康幼嫩的葉片, 利用DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司, DP305)提取花生基因組DNA, 送至北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司進(jìn)行PacBio三代測(cè)序, 利用Bwa-0.7.12軟件將測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組進(jìn)行比對(duì), 挖掘序列變異, 篩選在親本間具有差異的InDel位點(diǎn), 根據(jù)比對(duì)結(jié)果找出親本在A08染色體上QTL ()目標(biāo)區(qū)段內(nèi)存在的InDel差異位點(diǎn)。利用Primer 5.0軟件將這些差異位點(diǎn)設(shè)計(jì)成引物, 引物長(zhǎng)度范圍為151～610 bp, 提取InDel上下游各500 bp的序列, 并根據(jù)上下游序列設(shè)計(jì)引物, 退火溫度范圍為50～62℃, 引物由北京擎科生物科技(武漢)有限公司合成, 將開發(fā)的InDel標(biāo)記在親本中進(jìn)行多態(tài)性篩選。

1.2.2 DNA的提取、PCR擴(kuò)增以及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 選取花生苗期健康幼嫩的葉片3～4片, 利用改良的CTAB法[19]提取基因組DNA, 分別采用1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, 美國(guó))檢測(cè)DNA的質(zhì)量和含量。利用開發(fā)的InDel引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 反應(yīng)體系10 μL, 包括全式金2× EcoPCR SuperMix (+dye) 5 μL, 基因組DNA模板l μL (20～30 ng μL–1), 引物對(duì)0.4 μmol L–1, ddH2O補(bǔ)至10 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)? 95℃預(yù)變性3 min; 然后95℃變性30 s、50～59℃復(fù)性30 s、72℃延伸1 min kb–1, 共40個(gè)循環(huán); 最后72℃延伸5 min, 4℃保存。使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物, 凝膠成像系統(tǒng)下照相記錄, 統(tǒng)計(jì)分析條帶類型, 利用Microsoft Excel整理數(shù)據(jù)并分析對(duì)應(yīng)基因型。

1.2.3 表型數(shù)據(jù)測(cè)定 收獲后的種子自然條件下風(fēng)干(含水率控制在10%以下), 取3～4 g完整飽滿的種子采用核磁共振分析儀(PQ001)快速測(cè)定種子含油量, 為確保表型結(jié)果的準(zhǔn)確性, 測(cè)定結(jié)果取3次重復(fù)的平均值, 利用Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與計(jì)算。

1.2.4 構(gòu)建局部遺傳連鎖圖譜及QTL定位 利用篩選出的InDel多態(tài)性標(biāo)記對(duì)F2群體(=1160)進(jìn)行基因型分析, 對(duì)于共顯性InDel標(biāo)記, 與徐花13帶型相同的記為“1”, 與中花6號(hào)帶型相同的記為“2”, 具有雙親雜合帶型的記為“3”; 對(duì)于顯性InDel標(biāo)記, 與徐花13帶型相同的記為“1”, 與中花6號(hào)帶型相同的記為“2”, 帶型缺失或模糊的樣品基因型記為“-”。結(jié)合F2群體單株表型數(shù)據(jù)和基因型分析數(shù)據(jù), 利用QTL IciMapping V4.0軟件構(gòu)建局部遺傳連鎖圖譜, 映射參數(shù)設(shè)置為1.0 cM步長(zhǎng), 概率0.001, LOD閾值為3, 采用ICIM-ADD (完備區(qū)間作圖法)[20]對(duì)花生含油量進(jìn)行QTL定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 PacBio測(cè)序鑒定基因組結(jié)構(gòu)變異

利用PacBio三代測(cè)序技術(shù)對(duì)親本徐花13和中花6號(hào)進(jìn)行測(cè)序, 所得的測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)控(表1), 將雙親過濾后的數(shù)據(jù)比對(duì)到花生參考基因組, 在基因組中的比對(duì)率分別為98.03% (徐花13)和97.58% (中花6號(hào)), 覆蓋度均高于96.59%, 表明測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量良好, 可以用于后續(xù)分析。結(jié)構(gòu)變異類型包括基因組水平上大片段的插入、缺失、倒位、易位和重復(fù), 將鑒定到的結(jié)構(gòu)變異進(jìn)行統(tǒng)計(jì), 徐花13共鑒定到35,794個(gè)結(jié)構(gòu)變異(表1), 其中插入片段12,293個(gè), 缺失片段4496個(gè), 倒位片段14個(gè), 易位片段16,305個(gè), 重復(fù)片段2868個(gè); 中花6號(hào)共鑒定到74,703個(gè)結(jié)構(gòu)變異, 插入片段26,833個(gè), 缺失片段12,906個(gè), 倒位片段24個(gè), 易位片段31,412個(gè), 重復(fù)片段3528個(gè)。

對(duì)InDel的長(zhǎng)度分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 發(fā)現(xiàn)其長(zhǎng)度分布較廣, 插入突變的片段長(zhǎng)度主要分布在0～100 bp, 其次是100～1000 bp, 而超過1000 bp的很少; 缺失突變的片段長(zhǎng)度主要在100～1000 bp, 其次是0～100 bp (圖1)。根據(jù)參考基因組, 使用ANNOVAR軟件對(duì)DEL、INS、INV進(jìn)行變異注釋。根據(jù)基因組注釋, 將InDel注釋到基因上游或下游(轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游/轉(zhuǎn)錄末端位點(diǎn)下游1 kb區(qū)域)、外顯子、內(nèi)含子、基因間區(qū)、剪切位點(diǎn)(內(nèi)含子中靠近外顯子/內(nèi)含子邊界的2 bp)、5′非編碼區(qū)和3′非編碼區(qū)。分析InDel注釋結(jié)果, 發(fā)現(xiàn)識(shí)別到的InDel多態(tài)性位點(diǎn)大部分位于基因間區(qū), 徐花13和中花6號(hào)分別檢測(cè)到30,158個(gè)(占84.25%)和60,637個(gè)(占81.17%), 而發(fā)生在基因外顯子的InDel多態(tài)性位點(diǎn)分別為901個(gè)(徐花13)和1595個(gè)(中花6號(hào)) (圖2)。

2.2 InDel標(biāo)記的開發(fā)及篩選

針對(duì)初定位的含油量QTL (), 該目標(biāo)區(qū)間位于A08染色體1.8 Mb (45,605,931～47,465,778)區(qū)間內(nèi), 基于親本結(jié)構(gòu)變異信息, 在目標(biāo)區(qū)間內(nèi)根據(jù)變異位點(diǎn)的物理位置, 將這些變異位點(diǎn)全部設(shè)計(jì)成引物, 共開發(fā)出84個(gè)InDel標(biāo)記, 將開發(fā)的InDel標(biāo)記以親本徐花13和中花6號(hào)的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 經(jīng)過PCR和產(chǎn)物檢測(cè)發(fā)現(xiàn)共9個(gè)InDel標(biāo)記在親本中均能擴(kuò)增出差異條帶(圖3), 擴(kuò)增條帶的大小與預(yù)測(cè)產(chǎn)物大小吻合, 多態(tài)性頻率為10.7%, 與目標(biāo)性狀連鎖的InDel標(biāo)記相關(guān)信息見表2。

表1 親本測(cè)序信息

圖1 親本中插入、缺失長(zhǎng)度分布

A: 徐花13插入變異的長(zhǎng)度分布; B: 徐花13缺失變異的長(zhǎng)度分布; C: 中花6號(hào)插入變異的長(zhǎng)度分布; D: 中花6號(hào)缺失變異的長(zhǎng)度分布。

A: length distribution of insertion variation in Xuhua 13; B: length distribution of deletion variation in Xuhua 13; C: length distribution of insertion variation in Zhonghua 6; D: length distribution of deletion variation in Zhonghua 6.

圖2 結(jié)構(gòu)變異發(fā)生在基因組不同區(qū)域的比例

A: 徐花13的結(jié)構(gòu)變異在基因組不同區(qū)域的比例; B: 中花6號(hào)的結(jié)構(gòu)變異在基因組不同區(qū)域的比例。

A: the ratio of different genomic region with structural variations in Xuhua 13; B: the ratio of different genomic region with structural variations in Zhonghua 6.

2.3 含油量表型測(cè)定與分析

從徐花13和中花6號(hào)雜交組合的RIL群體中(F8), 以目標(biāo)QTL側(cè)翼的SSR分子標(biāo)記作為前景選擇, 篩選出QTL ()位點(diǎn)為雜合基因型的單株。挑選出均勻分布在各條染色體上的分子標(biāo)記作為背景選擇, 結(jié)合前景選擇從該單株自交后代篩選獲得NIL。利用NIL雜交后代構(gòu)建1個(gè)包含1160個(gè)單株的F2次級(jí)分離群體用于含油量QTL的定位。測(cè)定F2群體花生植株的含油量表型, 統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)含油量變化范圍為43.52%～57.96%, 平均值為50.42%±1.56%, 繪制含油量表型頻率分布直方圖(圖4)。含油量范圍分布符合正態(tài)分布, 表現(xiàn)為數(shù)量性狀的遺傳特點(diǎn), 表明該含油量表型數(shù)據(jù)可靠, 可用于QTL定位研究。

2.4 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及含油量QTL定位分析

利用篩選獲得的9個(gè)多態(tài)性InDel標(biāo)記結(jié)合F2群體基因型數(shù)據(jù)分析, 其中共顯性標(biāo)記8個(gè), 分別為M9、M21、M6、M22、M23、M11、M14、M8, M13為顯性標(biāo)記, 去除1個(gè)不穩(wěn)定的共顯性標(biāo)記M14, 獲得共包含8個(gè)多態(tài)性InDel標(biāo)記, 圖譜總長(zhǎng)度為149.84 cM的遺傳圖譜。根據(jù)構(gòu)建的遺傳連鎖圖, 結(jié)合F2群體1160個(gè)單株的表型數(shù)據(jù)和基因型分析數(shù)據(jù), 對(duì)花生含油量QTL ()進(jìn)行定位, 最終將該含油量QTL定位在標(biāo)記M23至M11之間, 位于A08染色體1.2 Mb區(qū)段內(nèi)(圖5), LOD值為25.21, 能夠解釋11.21%的表型變異, 加性效應(yīng)為0.77, 表明與含油量相關(guān)的基因來自高含油量親本徐花13。

圖3 親本中9個(gè)多態(tài)性InDel標(biāo)記PCR擴(kuò)增結(jié)果

M1: 2000 bp; M2: 5000 bp. M9: InDel-A08-37791529; M21: InDel-A08-42578036; M6: InDel-A08-44213248; M22: InDel-A08-44339712; M23: InDel-A08-44988232; M11: InDel-A08-46212241; M13: InDel-A08-46400655; M14: InDel-A08-46555343; M8: InDel-A08-49660135.

表2 親本中具有多態(tài)性的InDel標(biāo)記信息

圖4 F2群體含油量表型的頻率分布

圖5 F2群體定位結(jié)果

通過對(duì)QTL峰值處的標(biāo)記M11在F2群體中進(jìn)行分析, 挑出該標(biāo)記在F2群體中的與親本基因型相一致的單株, 同時(shí)將對(duì)應(yīng)株系的表型數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì), 具有徐花13基因型(AA)的后代有298株, 含油量變化范圍為46.87%～56.00%, 平均值為52.60%±1.55%; 具有中花6號(hào)基因型(aa)的后代有206株, 含油量變化范圍為46.41%～53.83%, 平均值為49.71%±1.41%; 不同基因型間株系含油量相差2.89個(gè)百分點(diǎn), 且在0.01的水平下差異極顯著(圖6), 表明該InDel標(biāo)記可用于花生含油量分子標(biāo)記輔助育種。

圖6 M11位點(diǎn)等位基因型含油量的表型效應(yīng)

**代表在0.01概率水平著差異(檢驗(yàn))。

**represents significant difference at the 0.01 probability level by-test.

3 討論

隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展, 分子標(biāo)記輔助花生育種的應(yīng)用越來越多。InDel標(biāo)記在基因組中分布廣, 密度大, 是豐富性僅次于SNP、遠(yuǎn)高于SSR的一種標(biāo)記類型, 作為重要的分子標(biāo)記來源, 因其多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、不受環(huán)境影響, 分型系統(tǒng)簡(jiǎn)單[21]而得到廣泛應(yīng)用。與SNP標(biāo)記相比, 雖然InDel標(biāo)記在基因組中分布密度和多態(tài)性頻率低于SNP標(biāo)記, 但其引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單, 多態(tài)性檢測(cè)便捷高效, 只需要普通PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳等簡(jiǎn)單步驟即可達(dá)到基因分型的目的。此外InDel標(biāo)記比需要聚丙烯凝膠電泳檢測(cè)的SSR標(biāo)記更節(jié)省人力和物力。前人在選擇InDel差異位點(diǎn)時(shí), 通常優(yōu)先選擇多態(tài)性差異為5～20 bp差異的InDel位點(diǎn)[22-24], 很少關(guān)注大片段InDel標(biāo)記, 擴(kuò)增產(chǎn)物大多數(shù)需要通過聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè), 操作步驟繁瑣。本研究中基于三代測(cè)序鑒定到的長(zhǎng)片段InDel位點(diǎn)開發(fā)引物, 擴(kuò)增后的產(chǎn)物條帶差異效果明顯, 在電泳檢測(cè)中便于區(qū)分, 基因分型清晰簡(jiǎn)單, 用瓊脂糖凝膠電泳即可檢測(cè)。

前人研究中, 通?；诙販y(cè)序技術(shù)開發(fā)相關(guān)性狀的分子標(biāo)記, 而本研究利用PacBio三代測(cè)序技術(shù)構(gòu)建超長(zhǎng)片段文庫(kù), 得到超長(zhǎng)的讀長(zhǎng), 從而提高大片段變異位點(diǎn)的檢出率, 能夠解決二代測(cè)序中無法跨越高重復(fù)和低復(fù)雜度區(qū)域等問題。通過對(duì)序列的結(jié)構(gòu)變異分析可以為InDel分子標(biāo)記的開發(fā)奠定基礎(chǔ), 本研究基于測(cè)序數(shù)據(jù), 在位點(diǎn)區(qū)間內(nèi)根據(jù)InDel差異位點(diǎn)開發(fā)出84個(gè)InDel標(biāo)記, 將開發(fā)的InDel標(biāo)記在親本中進(jìn)行多態(tài)性篩選, 篩選獲得具有多態(tài)性的InDel標(biāo)記9個(gè), 多態(tài)性頻率為10.71%, 擴(kuò)增產(chǎn)物特異性好且條帶清晰。在F2群體中進(jìn)行基因分析時(shí), 擴(kuò)增產(chǎn)物帶型在株系之間的條帶差異效果明顯, 便于記錄和分析。雖然本研究開發(fā)出84個(gè)InDel標(biāo)記, 但只有9個(gè)InDel標(biāo)記具有多態(tài)性, 其余標(biāo)記沒有擴(kuò)增出目的片段或者在親本間沒有表現(xiàn)出多態(tài)性, 可能是因?yàn)樵耘喾N花生是異源四倍體, 基因組龐大, A亞組和B亞組間同源性程度較高[6], 在檢測(cè)插入和缺失突變時(shí)會(huì)受到亞組之間差異的影響, 導(dǎo)致序列同基因組序列比對(duì)時(shí)可能將來自不同亞組的序列比對(duì)到同一位置, 造成假陽性, 因而檢測(cè)到標(biāo)記的多態(tài)性較低。

由于含油量遺傳研究基礎(chǔ)薄弱, 使得我國(guó)花生高含油量育種進(jìn)展緩慢。通過檢測(cè)與含油量相關(guān)的QTL位點(diǎn)可以快速有效地指導(dǎo)育種工作, 采用含油量差異明顯的親本雜交組合, 借助分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)多基因聚合, 在早期世代進(jìn)行選擇, 加快育種效率[25]。目前報(bào)道的與花生含油量穩(wěn)定主效QTL位點(diǎn)緊密連鎖的標(biāo)記數(shù)量有限, 黃莉等[26]利用遠(yuǎn)雜9102和中花5號(hào)為親本構(gòu)建RIL群體, 獲得2個(gè)與花生含油量相關(guān)的SSR標(biāo)記, 其中標(biāo)記2A5- 240與高含油量相關(guān), 標(biāo)記2A5-250與低含油量相關(guān); Wilson等[8]利用野生種衍生的雙二倍體TxAG-6與栽培基因型Florunner雜交構(gòu)建高級(jí)回交群體, 獲得2個(gè)緊密連鎖的標(biāo)記PM36和TC7A02能夠提高花生含油量; 郭建斌等[5]利用多態(tài)性SSR標(biāo)記對(duì)60份花生材料的含油量進(jìn)行相關(guān)性分析, 獲得與含油量極顯著相關(guān)的標(biāo)記11個(gè), 其中7個(gè)標(biāo)記與高含油量相關(guān); 劉念等[27]對(duì)292份中國(guó)花生品種組成的自然群體進(jìn)行了含油量的表型鑒定, 運(yùn)用SSR標(biāo)記鑒定出12個(gè)關(guān)聯(lián)標(biāo)記, 證實(shí)標(biāo)記AGGS1014_2和AHGS0798可以提高RIL群體的含油量; 徐平等[28]對(duì)49個(gè)花生栽培品種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析獲得的InDel位點(diǎn), 通過關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)29個(gè)InDel位點(diǎn)與花生含油量相關(guān), 開發(fā)出1個(gè)可用于分子標(biāo)記輔助高含油量育種的InDel標(biāo)記。本研究利用開發(fā)的多態(tài)性InDel標(biāo)記對(duì)F2群體含油量進(jìn)行相關(guān)性分析, 發(fā)現(xiàn)標(biāo)記M11的InDel位點(diǎn)與含油量極顯著相關(guān), 表明該位點(diǎn)可用于高含油量聚合雜交育種。

另外, 為了降低或消除遺傳背景對(duì)定位結(jié)果的影響, 本研究利用目標(biāo)位點(diǎn)的側(cè)翼標(biāo)記作為前景選擇, 篩選出群體(F8)中雜合基因型的單株, 從其自交后代獲得背景一致且在位點(diǎn)等位純合的NIL。利用NILs雜交后代構(gòu)建F2群體, 基于測(cè)序開發(fā)InDel標(biāo)記對(duì)花生含油量復(fù)雜性狀進(jìn)行遺傳分析, 屏蔽了非重組交換單株的影響, 定位結(jié)果更加準(zhǔn)確。利用獲得的9個(gè)InDel多態(tài)性標(biāo)記, 對(duì)F2群體的1160個(gè)單株進(jìn)行基因型分析, 獲得總長(zhǎng)度為149.84 cM的局部遺傳連鎖圖譜, 結(jié)合F2群體的表型數(shù)據(jù)進(jìn)行QTL定位, 可以解釋11.21%的表型變異,表明位點(diǎn)是一個(gè)主效的QTL位點(diǎn), 具有研究和利用的潛力, 這與前人的研究一致[19,29], 最終將QTL ()縮小至A08染色體1.2 Mb區(qū)段內(nèi)。因此, 在本研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步開展對(duì)含油量主效位點(diǎn)QTL ()的精細(xì)定位和相關(guān)基因的挖掘?qū)⑹且院笱芯康囊粋€(gè)重點(diǎn)方向。

4 結(jié)論

本研究利用PacBio三代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)基因組大片段的InDel變異, 在目標(biāo)區(qū)間QTL ()內(nèi)基于其緊密連鎖標(biāo)記開發(fā)了1個(gè)可用于分子標(biāo)記輔助育種與種質(zhì)評(píng)價(jià)的InDel標(biāo)記, 并在F2群體中證實(shí)其具有提高花生含油量的作用, 可為花生含油量分子標(biāo)記輔助育種提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐, 最終將QTL ()縮小至A08染色體1.2 Mb區(qū)段內(nèi)。

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Development and employment of InDel marker in peanut QTL mapping of oil content

TAO Shun-Yu, WU Bei, LIU Nian, LUO Huai-Yong, HUANG Li, ZHOU Xiao-Jing, CHEN Wei-Gang, GUO Jian-Bin, YU Bo-Lun, LEI Yong, LIAO Bo-Shou, and JIANG Hui-Fang*

Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Oil Crops, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Wuhan 430062, Hubei, China

The developing of stable and efficient molecular markers is of great value for marker-assisted selection of peanut varieties with highoil content. In this study, two parents with significant differences in oil content, Xuhua 13 (high oil content) and Zhonghua 6 (low oil content), were used to detect genomic structural variation by PacBio third-generation sequencing technology, and 35,794 and 74,703 structural variations were detected in Xuhua 13 andZhonghua 6, respectively. 84 InDel markers in the target region were detected based on the parents’ structural variations and the previous QTL mapping information. And 9 InDel markers were found to be polymorphic between the parents. Meanwhile, F2population with 1160 individual plants was constructed based on near isogenic lines (NILs) derived from heterozygous residuals in the recombined inbred line (RIL) population. The polymorphic markers were used to genotype the population and to construct the genetic linkage map with 149.84 cM. Combining with phenotype data of population for oil content, QTL () was fine mapped between marker M23 and marker M11, which was located on 1.2 Mb interval of chromosome A08. This study demonstrated the feasibility of InDel marker for peanut QTL mapping. The locus of oil content and closely linked InDel markers can provide the theoretical and technical guidance for peanut molecular marker-assisted breeding.

peanut; genome resequencing; InDel; oil content

10.3724/SP.J.1006.2023.24140

本研究由廣東省重點(diǎn)領(lǐng)域研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2020B020219003), 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31801403, 31871666), 農(nóng)作物種質(zhì)資源保護(hù)項(xiàng)目(2017NWB033), 國(guó)家農(nóng)作物種質(zhì)資源共享服務(wù)平臺(tái)(NICGR2017-36), 財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-13-花生種質(zhì)資源評(píng)價(jià))和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程項(xiàng)目(2022-2060299-089-031)資助。

This study was supported by the Key Area Research and Development Program of Guangdong Province (2020B020219003), the National Natural Science Foundation of China (31801403, 31871666), the Crop Germplasm Resources Protection Project (2017NWB033), the Plant Germplasm Resources Sharing Platform (NICGR2017-36), the China Agriculture Research System of MOF and MARA (CARS13), and the Innovation Project of Chinese Academy of Agricultural Sciences (2022-2060299-089-031).

姜慧芳, E-mail: peanutlab@oilcrops.cn

E-mail: ynautsy@163.com

2022-06-10;

2022-07-21;

2022-09-23.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220922.1605.004.html

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