HPLC 法同時測定紅棗中cAMP 和cGMP 含量

侯紅巖，童 心，杜飛云，侯旭杰，2，蒲云峰，2

（1. 塔里木大學 食品科學與工程學院，新疆阿拉爾 843300；2. 南疆特色農產品深加工兵團重點實驗室，新疆阿拉爾 843300；3. 新疆葉河源果業(yè)股份有限公司，新疆圖木舒克 843900）

環(huán)腺苷酸（cAMP） 和環(huán)鳥苷酸（cGMP） 屬于核苷酸的衍生物，作為細胞內常見的第二信使，共同參與細胞內的生理生化過程調節(jié)[1-2]，具有降血糖[3]、抗過敏[4]、保肝護肝[5]、抑制心血管疾病[6]、抑制癌細胞生長[7]等作用。自1980 年Cyong J C 等人[8]首次發(fā)現(xiàn)棗果中含有cAMP 后，大量學者開展了棗樹及棗果中cAMP 和cGMP 的研究，證實了cAMP 和cGMP是棗果中重要的生物活性物質，并且是已測高等植物中含量最高的[9-10]。

HPLC 法是紅棗中cAMP 和cGMP 測定的主要方法，目前文獻中測定cAMP 和cGMP 的方法，常常需要配制一定濃度的磷酸二氫鉀緩沖液和調pH 值[11]，流動相配制繁瑣，對儀器操作者的技術水平要求高，而不利于液相初學者掌握和使用。雖然也有少量文獻采用甲酸水替代磷酸二氫鉀緩沖液分析了紅棗樣品中cAMP 和cGMP，但其分析周期過長[12]，或只分析了紅棗中cAMP[13]。因此，以甲醇和甲酸水為流動相，優(yōu)化并建立同時測定紅棗中cAMP 和cGMP 的HPLC 方法，實現(xiàn)紅棗中cAMP 和cGMP 的快速、簡單和準確分析，為紅棗中cAMP 和cGMP 的開發(fā)利用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

紅棗樣品，采摘于塔里木大學棗資源圃及阿拉爾周邊果園。

1.2 試劑

cAMP 和cGMP 標準品（含量≥99.99%），阿拉丁試劑（上海） 有限公司提供；甲酸（色譜純），北京邁瑞達科技有限公司提供；甲醇（色譜純），上海安譜實驗科技股份有限公司提供；其他常規(guī)試劑，國藥集團化學試劑有限公司提供。

1.3 儀器

FD-1-50 型冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司產品； DZKW-D-2 型恒溫水浴鍋，北京市光明醫(yī)療儀器廠產品；TGL-20M 型臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀離心機儀器有限公司產品； LC-20A型液相色譜、SPD-M20A 型檢測器、RID20A 型檢測器，日本島津公司產品。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品預處理

將紅棗樣品清洗晾干后，去核切塊，然后在-20 ℃下預凍1 h，真空冷凍干燥36 h 獲得凍干棗塊，再將凍干棗塊用組織破碎機粉碎，于-20 ℃下貯藏備用。

稱取一定量樣品粉末，再用蒸餾水在室溫下超聲提取30 min，以轉速3 000 r/min 離心15 min，取上清液過0.22 μm 針式濾膜備用。

1.4.2 色譜條件

Spuirsil C18型色譜柱（250×4.6 mm，i.d.），天津迪馬公司產品；流動相為甲醇（A） ∶0.5%甲酸水（B）；進樣量10 μL，柱溫30 ℃；檢測波長256 nm。

1.4.3 標準曲線的建立

分別稱取約cAMP 和cGMP 標準品50 mg，用蒸餾水溶解，定容至50 mL，獲得質量濃度約為1 mg/mL 的cAMP 和cGMP 混合標準儲備液。移取cAMP 和cGMP 混 合 標 準 貯 備 液0.05，0.10，0.20，0.30，0.60，1.20， 2.50，5.00 mL 置于100 mL 量瓶中，用蒸餾水定容，得到cAMP 和cGMP 混合標準工作溶液。參照優(yōu)化后的色譜條件進樣分析，以峰面積（Y） 對質量濃度（C） 進行線性回歸。

1.5 數據處理

每個處理3 次重復，結果以平均值±標準偏差（平均值±SD） 表示，利用SPSS 17.0 進行方差分析，并進行Duncan's 多重比較（p<0.05）。

2 結果與分析

2.1 水相（0.5%甲酸水） 比例對cAMP 和cGMP 保留時間和峰面積的影響

參照1.4.2 的色譜條件，在流速為0.7 mL/min，設置不同的水相比例，然后以cAMP 和cGMP 混合標準品進行HPLC 分析。

水相比例對cAMP 和cGMP 的保留時間和峰面積的影響見表1。

表1 水相比例對cAMP 和cGMP 的保留時間和峰面積的影響

由表1 可知，水相（0.5%甲酸水） 比例對cAMP和cGMP 的峰面積影響較小，但對保留時間影響較大。隨著水相（0.5%甲酸水） 比例的增加，cAMP 和cGMP 的保留時間逐漸延后，cAMP 和cGMP 保留時間的間距逐漸拉大，從83%的0.56 min 增加到95%的1.9 min，說明增加水相比例有利于cAMP 和cGMP的分離。在液相色譜分析時，流動相中有機溶劑或水的比例要符合色譜柱所允許的使用范圍，如普通C18柱要求有機相比例≥5%[14]。因此，選擇95%的水相（0.5%甲酸水） 作為紅棗中cAMP 和cGMP 分析的流動相條件。

2.2 cAMP 和cGMP 的HPLC 色譜圖

參照1.4.2 的色譜條件，以甲醇- 0.5%甲酸水（5∶95，V/V） 為流動相，分別對混合標準品和棗樣進行分析，獲得cAMP 和cGMP 混合標準品與棗樣的色譜圖。

cAMP 和cGMP 混標和棗樣的HPLC 色譜圖見圖圖1。

圖1 cAMP 和cGMP 混標和棗樣的HPLC 色譜圖

由圖1 可知，在混合標準品中cAMP 和cGMP 的出峰時間分別為9.41 min 和11.31 min，棗樣色譜圖在相同的保留時間處均有色譜峰，且棗樣色譜圖基線平穩(wěn)，說明該色譜條件可以用于紅棗中cAMP 和cGMP 的分析。

2.3 紅棗中cAMP 和cGMP 的HPLC 檢測方法的建立

參照1.4.2 的色譜條件，以甲醇- 0.5%甲酸水（5 ∶95，V/V） 為流動相，對cAMP 和cGMP 的HPLC 檢測方法的線性、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、回收率、檢出限及定量限進行了分析。

cAMP 和cGMP 測定方法的參數見表2。

表2 cAMP 和cGMP 測定方法的參數

由表2 可知，在0.05~50.0 μg/mL 范圍內，cAMP和cGMP 的標準曲線分別為Y=30 282X+3 902.1 和Y=24 349X+7 122.7，回歸系數分別為R2=1.000 0 和R2=0.999 0。該方法中cAMP 和cGMP 的平均回收率分別為95.48%和94.76%，重現(xiàn)性的RSD 分別為2.28%（n=6） 和4.51%（n=6），室溫下放置72 h 穩(wěn)定性的RSD 分別為2.95%（n=12） 和4.18%（n=12）。檢測限（LOD） 和定量限（QOD） 按照Araujo P[15]的方法計算，即檢測限（LOD） 為3×SD/m和定量限（LOQ） 為10×SD/m，其中SD 為標準曲線的截距，m為標準曲線斜率。該方法中cAMP 和cGMP 的檢測限（LOD） 分別為0.39 μg/mL 和0.88 μg/mL，定量限（QOD） 分別為1.28 μg/mL和2.93 μg/mL。這說明該方法適合同時測定紅棗中cAMP 和cGMP 含量。

2.4 紅棗樣品中cAMP 和cGMP 含量的測定

參照1.4.2 的色譜條件，以甲醇- 0.5%甲酸水（5∶95，V/V） 為流動相，對紅棗樣品進行分析。

不同品種紅棗中cAMP 和cGMP 含量見表3。

表3 不同品種紅棗中cAMP 和cGMP 含量 / μg·g-1 DW

由表3 可知，10 個紅棗樣品中均含有cAMP 和cGMP，不同品種的cAMP 和cGMP 含量存在顯著差異（p<0.05）。cAMP 含量由高到低依次為駿優(yōu)、駿棗、灰棗、梨棗、伏脆蜜、冬棗、大白鈴、贊皇、阜帥、酸棗，駿優(yōu)的cAMP 是酸棗的35.26 倍；cGMP含量由高到低依次為駿優(yōu)、駿棗、灰棗、梨棗、伏脆蜜、冬棗、大白鈴、贊皇、酸棗、阜帥，駿優(yōu)的cGMP 是阜帥的113.72 倍；同一品種的cAMP 均高于cGMP 含量，與文獻[10]報道相似。

3 結論

通過對流動相與水相比例的優(yōu)化，建立了同時測定棗果中cAMP 和cGMP 的HPLC 方法，該方法具有流動相配制簡單、分析時間短、色譜峰分離度好、準確度高等特點。通過對10 個紅棗品種的分析，發(fā)現(xiàn)同一品種棗果中cAMP 含量均大于cGMP，不同品種間二者含量差異顯著（p<0.05）。駿優(yōu)、駿棗和灰棗的cAMP 和cGMP 含量較高，其中駿棗和灰棗是新疆主栽品種[16]，而駿優(yōu)是從駿棗芽變材料選育出的一個優(yōu)良品種，這3 個品種都屬于干制品種，說明cAMP 和cGMP 是新疆干制紅棗中重要的活性成分，可作為新疆干制紅棗品質的質量指標。