響應(yīng)面法優(yōu)化植物乳桿菌發(fā)酵板栗復(fù)合飲料

靳羽慧，曹 蒙，劉東咪，周 楓，張靜華，李建芳

（1. 信陽農(nóng)林學(xué)院 食品學(xué)院，河南 信陽 464000；2. 信陽名宴實(shí)業(yè)有限公司，河南 信陽 464000）

板栗是我國有名的傳統(tǒng)農(nóng)副產(chǎn)品，風(fēng)味獨(dú)特、營養(yǎng)價值豐富[1]。河南省信陽地區(qū)是我國板栗之鄉(xiāng)，每年所生產(chǎn)板栗種類和數(shù)量高達(dá)幾十萬公斤，形成東雙河板栗貿(mào)易市場等多個主要的大型板栗貿(mào)易市場，有關(guān)板栗種類和產(chǎn)品的研發(fā)、加工也日趨完善[2]。板栗中含有大量的可溶性糖、蛋白質(zhì)、多種礦物質(zhì)和維生素，具有養(yǎng)胃健脾、止血消腫、強(qiáng)筋健骨的功效，對高血壓、冠心病等疾病具有較好的防治作用[3-4]。

紅棗作為特色果實(shí)，其營養(yǎng)價值豐富，含有較多的生物活性物質(zhì)，可以提高人體免疫力，含有的多糖和多酚物質(zhì)，均為抗氧化劑，可清除自由基，達(dá)到延緩衰老的作用[5]。紅棗含有的蘆丁可以軟化血管、降低血壓，提高血清蛋白、降低膽固醇[6]。含有的鈣和鐵對預(yù)防骨質(zhì)疏松及貧血具有很重要的作用[7]。

植物乳桿菌屬于革蘭氏陽性菌株，是不產(chǎn)生芽孢的兼性厭氧性乳酸菌，30~35 ℃是最佳生長溫度[8]。植物乳桿菌可以利用葡萄糖、果糖及乳糖等為原料進(jìn)行新陳代謝而產(chǎn)酸。在發(fā)酵食品分布更廣，常被用于改進(jìn)食品營養(yǎng)價值，如香腸、面包、葡萄酒和酸奶等[9]。同時，也是人體腸道內(nèi)的益生菌群，改善人們的腸胃環(huán)境，對人體健康有很大促進(jìn)作用[10]。有關(guān)研究表明，當(dāng)攝入一定量的植物乳桿菌或其發(fā)酵食品，對人體有特定的益生保健功能[11-12]。植物乳桿菌ST-Ⅲ是一株從泡菜中篩選出來的益生菌，可調(diào)節(jié)腸道微生物菌群的平衡，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，降低膽固醇和調(diào)節(jié)血脂、降脂等益生功能[13]。植物乳桿菌ST-Ⅲ有較強(qiáng)耐受低pH 值能力，在較高pH 值的條件下存活能力更強(qiáng)[14]。此菌株發(fā)酵使產(chǎn)品在具備板栗和紅棗特有香味的基礎(chǔ)上，提高營養(yǎng)價值，口感更加獨(dú)特的一款功能性飲料[15-16]。

以板栗和紅棗為試材，添加檸檬酸、白砂糖等輔料，接入植物乳桿菌ST-Ⅲ進(jìn)行發(fā)酵，利用響應(yīng)面法對接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。以期為我國植物乳桿菌發(fā)酵飲料方面提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

板栗，信陽市潤海板栗貿(mào)易有限公司提供；和田大棗，山西昌吉市金品誠商貿(mào)有限公司提供；白砂糖，購自信陽西亞超市；檸檬酸（無水），鄭州億之源化工產(chǎn)品有限公司提供；植物乳桿菌ST- Ⅲ（Lactobacillus plantarum） 凍干粉，鄭州百益寶生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 主要設(shè)備

LDZM-60KCS 型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；DHP-260 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海梅香儀器有限公司產(chǎn)品；JY10002 型電子分析天平，上海良平儀器儀表有限公司產(chǎn)品；YL-Y912 型高速破壁調(diào)理機(jī)，九陽股份有限公司產(chǎn)品；WYT-J 型手持折光儀，成都豪創(chuàng)光電儀器有限公司產(chǎn)品；PHSJ-3F 型pH 測量儀，濟(jì)南歐萊博技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

①挑選→脫殼→加入0.11%檸檬酸溶液打漿→煮漿→過濾→板栗汁；

②紅棗汁制備。挑選→水煮→打漿→過濾→紅棗汁；

①+②→混合→復(fù)配→殺菌→冷卻→灌裝→接種→發(fā)酵→121 ℃保持15 min 滅菌→冷卻至80 ℃→封蓋成品。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

（1） 植物乳桿菌接種量對復(fù)合飲料感官品質(zhì)的影響。以板栗汁∶紅棗汁= 3∶1 混合，然后加入7%白砂糖，0.06%酸味劑充分?jǐn)嚢杈鶆?，植物乳桿菌ST-Ⅲ接種量分別為1.0%，2.0%，3.0%，4.0%，5.0%，在35 ℃下發(fā)酵48 h，對發(fā)酵后的飲料進(jìn)行感官評價。

（2） 植物乳桿菌發(fā)酵溫度對復(fù)合飲料感官品質(zhì)的影響。以板栗汁∶紅棗汁= 3∶1 混合，然后加入7%白砂糖，0.06%酸味劑充分?jǐn)嚢杈鶆颍尤?.0%植物乳桿菌ST-Ⅲ，分別在發(fā)酵溫度25，30，35，40，45 ℃下發(fā)酵48 h，對發(fā)酵后的飲料進(jìn)行感官評價。

（3） 植物乳桿菌發(fā)酵時間對復(fù)合飲料感官品質(zhì)的影響。以板栗汁∶紅棗汁= 3∶1 混合，然后加入7%白砂糖，0.06%酸味劑充分?jǐn)嚢杈鶆?，接?.0%植物乳桿菌ST-Ⅲ，控制發(fā)酵溫度35 ℃，分別發(fā)酵24，36，48，60，72 h，對發(fā)酵后的飲料進(jìn)行感官評價。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇植物乳桿菌ST-Ⅲ接種量、發(fā)酵溫度和時間3 個考查因素，以感官評分為響應(yīng)值，根據(jù)Box-behnken 設(shè)計(jì)中心試驗(yàn)原理，采用Design Expert10.0 響應(yīng)面設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)。

Box-behnken 試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 Box-behnken 試驗(yàn)因素與水平

1.3.4 感官評定方法

選擇10 名食品相關(guān)專業(yè)有品評經(jīng)驗(yàn)人員組成評定小組，依據(jù)板栗復(fù)合飲料感官評分標(biāo)準(zhǔn)[17]（見表2），從板栗復(fù)合飲料的外觀色澤、組織結(jié)構(gòu)、滋味及風(fēng)味4 個方面進(jìn)行綜合感官評分，滿分為100 分，取平均值。

板栗復(fù)合飲料感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 板栗復(fù)合飲料感官評分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.5 理化指標(biāo)測定

（1） 總酸。符合GB/T 12456—2008 標(biāo)準(zhǔn)，采用指示劑法檢測樣品中的總酸含量。

（2） pH 值。符合GB 19297—2003 標(biāo)準(zhǔn)，采用pH 測定儀。

（3） 可溶性固形物。符合GB/T 12143—2008 標(biāo)準(zhǔn)，采用手持式折光儀（20 ℃）。

（4） 菌落總數(shù)。符合GB 4789.2—2016 標(biāo)準(zhǔn)，采用平板計(jì)數(shù)法。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析使用Origin 9.0 軟件和Design Expert 10.0 響應(yīng)面分析軟件，對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 接種量對板栗復(fù)合飲料發(fā)酵的影響

在板栗紅棗汁中，分別接入不同添加量1.0%，2.0%，3.0%，4.0%，5.0%的植物乳桿菌ST-Ⅲ，在35 ℃下恒溫發(fā)酵48 h，對其進(jìn)行感官評分。

接種量對飲料感官評分的影響見圖1。

圖1 接種量對飲料感官評分的影響

由圖1 可知，隨著植物乳桿菌ST-Ⅲ接種量的增加，板栗復(fù)合發(fā)酵飲料的感官評分先上升后下降。當(dāng)植物乳桿菌ST-Ⅲ接種量小于3%時，板栗復(fù)合發(fā)酵飲料口感風(fēng)味偏甜，組織狀態(tài)不均勻，且有分層現(xiàn)象。當(dāng)接種量達(dá)到3%時，感官評分最高，為85 分。此時飲料色澤呈咖啡色，口感較為細(xì)膩、酸甜適中。當(dāng)接種量高于3%時飲料口感偏酸，發(fā)酵風(fēng)味過于濃厚，板栗紅棗香味風(fēng)味不協(xié)調(diào)。汪云陽等人[18]以枸杞原漿為原料，研究出當(dāng)植物乳桿菌CGMCC8198 接種量為2%枸杞發(fā)酵飲料風(fēng)味最佳。綜合考查，試驗(yàn)選取接種量2%~4%為進(jìn)一步優(yōu)化范圍。

2.1.2 發(fā)酵溫度對板栗復(fù)合飲料發(fā)酵的影響

將3%植物乳桿菌ST-Ⅲ接入于板栗紅棗汁中，分別在25，30，35，40，45 ℃條件下發(fā)酵48 h，對其進(jìn)行感官評分。

發(fā)酵溫度對飲料感官評分的影響見圖2。

圖2 發(fā)酵溫度對飲料感官評分的影響

由圖2 可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，板栗復(fù)合飲料的感官評分呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。當(dāng)發(fā)酵溫度低于30 ℃時，板栗復(fù)合飲料組織狀態(tài)基本穩(wěn)定，板栗紅棗香氣混合均勻，口感略微粗糙，不順滑；當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時，飲料中紅棗和板栗的混合香味最佳，色澤較為均勻，口感細(xì)膩，酸甜可口，且感官評分最高，為91 分。發(fā)酵溫度過低或過高均不利于植物乳桿菌ST-Ⅲ的生長，會導(dǎo)致發(fā)酵風(fēng)味欠佳，色澤較淺，酸甜略有不適。綜合考查，試驗(yàn)選取發(fā)酵溫度25~33℃為進(jìn)一步優(yōu)化范圍。

2.1.3 發(fā)酵時間對板栗復(fù)合飲料發(fā)酵的影響

將3%植物乳桿菌ST-Ⅲ接入于板栗紅棗汁中，在30 ℃恒溫條件下，分別發(fā)酵24，36，48，60，72 h，對其進(jìn)行感官評分。

發(fā)酵時間對飲料感官評分的影響見圖3。

圖3 發(fā)酵時間對飲料感官評分的影響

由圖3 可知，隨著發(fā)酵時間繼續(xù)延長，板栗復(fù)合飲料的感官評分出現(xiàn)先上升后急速下降。當(dāng)發(fā)酵時間低于48 h 時，由于發(fā)酵時間不充分，飲料口感略甜，混合香氣不協(xié)調(diào)，組織狀態(tài)基本均勻；發(fā)酵時間為48 h 時感官評分高達(dá)93 分，此時產(chǎn)品口感細(xì)膩順滑，板栗紅棗的香氣混和均勻，無異味，顏色均勻一致。當(dāng)發(fā)酵時間大于48 h 時，發(fā)酵的飲料口感過酸，發(fā)酵味道過濃，產(chǎn)生不良的風(fēng)味，色澤暗沉、組織狀態(tài)不均勻。綜合考查，試驗(yàn)選取發(fā)酵時間40~56 h 為進(jìn)一步優(yōu)化范圍。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 Box- behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以植物乳桿菌ST-Ⅲ的接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時間（C）為自變量，感官評分R為響應(yīng)值，運(yùn)用Design Expert 10.0 軟件對板栗紅棗飲料發(fā)酵工藝進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化。

響應(yīng)面試驗(yàn)的設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3，回歸方程方差分析見表4。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)的設(shè)計(jì)與結(jié)果

對表4 進(jìn)行回歸分析，得到的回歸方程為[19-20]：

2.2.2 回歸模型有效性及顯著性

由表4 可知，回歸模型F=69.10，模型極顯著p<0.000 1，失擬項(xiàng)不顯著p=0.062 4>0.050 0，模型合理。決定因素R2=0.988 9，模型能夠反應(yīng)響應(yīng)值的變化，回歸方程擬合良好。回歸模型中的一次項(xiàng)與二次項(xiàng)極顯著p<0.000 1，其對感官評分均有極顯著影響。由F值可以判斷出3 個考查因素對植物乳桿菌ST-Ⅲ板栗復(fù)合飲料感官評分結(jié)果影響的大小依次為發(fā)酵溫度＞接種量＞發(fā)酵時間。

表4 回歸方程方差分析

2.2.3 響應(yīng)面因素交互作用分析

綜合考查交互項(xiàng)對感官評分的影響，使3 個因素里的其中一個因素固定不變，選擇其中任意2 個因素，觀察對感官評分的影響。通過Design Expert 10.0 軟件對表3 的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析得到等高線圖和響應(yīng)曲面。

接種量和發(fā)酵溫度對感官值影響的響應(yīng)曲面及等高線圖見圖4。

圖4 接種量和發(fā)酵溫度對感官值影響的響應(yīng)曲面及等高線圖

由圖4 可看出，植物乳桿菌ST-Ⅲ的發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間等高線圖形為橢圓狀，表明接種量和發(fā)酵溫度2 個因素之間存在的交互作用較為顯著，感官評分隨著接種量和發(fā)酵溫度的增大呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。結(jié)合此響應(yīng)面可以看出，發(fā)酵溫度上升的幅度明顯大于接種量的上升幅度，說明發(fā)酵溫度對感官評分影響較大。

發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對感官值影響的響應(yīng)曲面及等高線圖見圖5。

圖5 發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對感官值影響的響應(yīng)曲面及等高線圖

由圖5 可知，植物乳桿菌ST-Ⅲ的發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間等高線圖形呈橢圓形狀較明顯，則發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度兩因素之間存在著一定的交互作用。隨著發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度的增加，感官評分呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，但發(fā)酵溫度上升幅度明顯大于發(fā)酵時間的上升幅度，說明發(fā)酵溫度對感官評分影響較大。

接種量和發(fā)酵時間對感官值影響的響應(yīng)曲面及等高線圖見圖6。

圖6 接種量和發(fā)酵時間對感官值影響的響應(yīng)曲面及等高線圖

由圖6 可知，植物乳桿菌ST-Ⅲ的接種量和發(fā)酵時間的等高線圖呈橢圓狀圖形不明顯，說明發(fā)酵時間和接種量兩因素交互作用不顯著。隨著植物乳桿菌ST-Ⅲ接種量和發(fā)酵時間的增加感官評分先上升后下降，結(jié)合此響應(yīng)面可看出，兩因素上升的幅度相近，對感官評分影響相當(dāng)。

由等高線圖可明顯看出，兩因素之間的交互作用強(qiáng)弱，呈橢圓狀表明兩因素交互作用是否顯著。

3 個因素之間的交互作用及對感官評分的影響和方差分析的結(jié)果一致，運(yùn)用Design Expert10.0 軟件得到該模型的極大值點(diǎn)，即植物乳桿菌ST-Ⅲ發(fā)酵板栗復(fù)合飲料的最佳工藝條件為接種量2.690%，發(fā)酵溫度28.757 ℃，發(fā)酵時間48.446 h，得到最大感官評分?jǐn)?shù)為95.077 分。為試驗(yàn)操作過程中的方便，調(diào)整優(yōu)化發(fā)酵條件為接種量2.7%，發(fā)酵溫度29 ℃，發(fā)酵時間48 h。將優(yōu)化后的試驗(yàn)條件進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，對其進(jìn)行感官評價，得到的感官評分的平均值為94.4 分，與模型預(yù)測值誤差0.71%，說明試驗(yàn)值與預(yù)測值吻和良好。因此，Box-behnken 設(shè)計(jì)的各個因素添加量的方案準(zhǔn)確可靠，具有可操作性[21]。

2.3 理化指標(biāo)與微生物指標(biāo)

最佳發(fā)酵條件下得到的板栗紅棗復(fù)合飲料中可溶性固形物含量12.5%，pH 值3.7，總酸質(zhì)量濃度為10.236 g/L，菌落總數(shù)≤100 CFU/mL。

3 結(jié)論

以3∶1 的比例復(fù)配板栗汁和紅棗汁，接入植物乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵，通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面優(yōu)化法確定板栗復(fù)合飲料的最佳工藝條件為接種量2.7%，發(fā)酵溫度29 ℃，發(fā)酵時間48 h。經(jīng)過驗(yàn)證結(jié)果表明，在最優(yōu)發(fā)酵條件下的感官評分為94.4 分，與模型預(yù)測數(shù)據(jù)誤差值為0.71%。將飲料灌裝后在高溫條件下滅菌后冷卻至室溫，經(jīng)觀察無脹罐、無雜菌污染現(xiàn)象，即制得發(fā)酵板栗復(fù)合飲料成品。

試驗(yàn)的產(chǎn)品作為乳酸菌發(fā)酵型飲料的一種，其飲料特點(diǎn)是植物乳桿菌通過原料底物和發(fā)酵過程決定的。由于板栗淀粉含量較高，且不溶于水，試驗(yàn)在制作過程中沒有做到原料中淀粉較好的利用。板栗果中淀粉的完全利用有待進(jìn)一步研究。對于板栗發(fā)酵型飲料的穩(wěn)定性，試驗(yàn)在穩(wěn)定劑的選擇上采用了檸檬酸單一穩(wěn)定劑的添加，通過觀察，板栗復(fù)合發(fā)酵飲料在靜止放置24 h 后，沒有明顯的分層現(xiàn)象，但液面周圍會出現(xiàn)掛壁現(xiàn)象，因此板栗復(fù)合飲料的穩(wěn)定性還需進(jìn)一步研究。