石見穿治療小鼠腎結(jié)石的活性部位篩選及其化學(xué)成分分析*

劉漫 ，蒲蓮蓮 ，楊穎 ，劉陶世 ，嵇晶 ，程建明

1 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 江蘇南京 210023

2 江蘇省經(jīng)典名方工程研究中心 江蘇南京 210023

腎結(jié)石是腎臟中沉積的礦物質(zhì)結(jié)晶，臨床上最常見的是草酸鈣結(jié)石，約80%的腎結(jié)石是由草酸鈣晶體發(fā)展而成[1]。腎結(jié)石會造成排尿困難，引起劇烈腰痛甚至血尿。其在全世界的患病率呈上升趨勢，嚴重威脅患者的健康和生活質(zhì)量。

目前，腎結(jié)石的主要治療方式包括手術(shù)治療和服用解痙、抗炎藥物[2]。但患者術(shù)后結(jié)石殘留率及復(fù)發(fā)率仍居高不下。有研究表明用藥不當也會引發(fā)腎結(jié)石[3]會不同程度的對腎組織造成損傷。中醫(yī)藥療法通過對因療法和對癥療法相結(jié)合，通過改善機體體質(zhì)的同時促進結(jié)石排出體外，不會對腎組織造成不良反應(yīng)，與西醫(yī)治療相比具有一定優(yōu)勢和開發(fā)潛力。

石見穿又名華鼠尾草、小丹參、紫參。為唇形科植物鼠尾草（Salvia chinensis benth） 的干燥地上部分，味辛；苦；性微寒。具有清熱利濕，消腫利水的作用?，F(xiàn)有研究表明石見穿含有酚酸類[4]、三萜類[5]、黃酮類[6]等活性成分。近年來石見穿作為治療結(jié)石中藥被廣泛應(yīng)用于各組方中，但目前其抗結(jié)石作用筆者尚未見國內(nèi)外相關(guān)文獻報道。因此，本研究采用乙醛酸鹽誘導(dǎo)腎結(jié)石法建立小鼠腎結(jié)石模型[7]，系統(tǒng)溶劑提取法制備石見穿不同活性部位。運用化學(xué)分析與藥理相結(jié)合的方法篩選石見穿治療腎結(jié)石的活性部位。擴大石見穿的藥效范圍，為后續(xù)新藥開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1 儀器設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海 EYELA OSB-2200），酶標分析儀（Infinite F50）；高速離心機（上海安亭 TGL-16G）；切片機（LEiCA RM2016上海徠卡儀器有限公司），包埋機（JB-L5，武漢俊杰電子有限公司），Kromasil-5C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），Ultimate 3000高效液相色譜儀（1000 mm×1000mmm×1000 mm）、SIL-20A XR UFLC 儀（日本 島津 公 司）、Triple TOF 5600System MS/MS高分辨三重四極桿飛行時間質(zhì)譜儀（美國 AB Sciex公司）。

2 化學(xué)試劑

甲醇（TEDIA，批號 21080394）、甲酸（阿拉丁，批號 20160412）、乙腈（TEDIA，批號 21070272），95% 乙醇（無錫市亞盛化工有限公司 20220120），石油醚（廣東光華，20130909）乙醛酸溶液（50%水溶液，阿拉丁K2002091），氫氧化鈉（滬試，國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：10019762）生化分析試劑盒：肌酐（Cr）試劑盒，血清尿素氮（BUN） 測試盒。乙醇（國藥集團化學(xué)試劑有限公司100092683）、二甲苯（10023418國藥集團化學(xué)試劑有限公司）、HE染液（71014460上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司）。

3 實驗動物

ICR小鼠（18～22g）60只雄性，SPF級由杭州醫(yī)學(xué)院提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2019-0002。動物合格證編號：20211026Abzz0100000231動物倫理申請單號：202108A009。小鼠飼養(yǎng)于20～25℃、相對濕度40%環(huán)境中，自然晝夜節(jié)律光照，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。自由飲水、進食，實驗前及實驗過程中小鼠均以全價顆粒飼料喂養(yǎng)。

4 藥材

石見穿藥材飲片購自安徽亳州市康易飲片有限公司，批號：20210711，產(chǎn)地：江蘇，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉訓(xùn)紅教授鑒定為為唇形科植物華鼠尾草Salvia chinensis Benth 的地上部分。

5 方法

5.1 石見穿各部位樣品的制備 ①石油醚部位的制備：取石見穿飲片適量，用10倍量的石油醚（60～ 90℃）加熱回流提取2次，1 h/次，過濾，合并濾液；濾液減壓濃縮回收溶劑得到浸膏，即為石油醚部位，藥渣備用。②醇部位的制備：將上述藥渣揮去殘留石油醚，用10倍量的95%乙醇加熱回流提取2次，1 h/次，過濾，合并濾液。濾液減壓濃縮回收溶劑得到浸膏即為95%乙醇部位，藥渣備用。③水部位的制備：?、跉埩羲幵瑩]去殘留乙醇，用10倍量的水加熱回流提取2次，1 h/次，過濾，合并濾液。濾液減壓濃縮回收溶劑得到浸膏即為水部位，制備工藝流程圖見圖1。

圖1 石見穿各部位提取工藝流程圖

5.2 成石液的配制 參考文獻[7]，取50%的乙醛酸溶液1mL加注射用水稀釋至100mL，用適量的NaOH調(diào)pH至7.4，得5mg/mL的乙醛酸鹽溶液，即為成石液。

5.3 小鼠腎結(jié)石模型的建立及給藥方案 健康小鼠60只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分成6組，每組10只，即空白組，模型對照組，陽性藥物對照組，石見穿石油醚提取物部位組，石見穿95%乙醇提取物部位組，石見穿水提取物部位組。除空白對照組每天注射生理鹽水外，其余各組均注射成石液，以給藥劑量100mg/Kg、給藥體積0.1mL/10g，連續(xù)腹腔注射2周。造模期間觀察小鼠形態(tài)變化和監(jiān)測體重。建模2周后隨機取3只小鼠麻醉后處死解剖，取雙腎浸泡于4%的多聚甲醛溶液，腎組織切片，觀察。

實驗期間各組小鼠自由攝食飲水，采取先造模后給藥的方法。造模2周后，灌胃給予陽性藥物組和石見穿各部位藥物組小鼠相同劑量的相應(yīng)藥物（石見穿[8]：18.02 g/kg，臨床 4 倍有效量；腎石通顆粒：4.51g/kg），空白組與模型組則灌胃蒸餾水，1次/d，給藥體積均為10ml/kg，連續(xù)給藥2周。

6 檢測指標和方法

6.1 腎臟系數(shù) 腎臟系數(shù)=腎質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%，腎質(zhì)量為小鼠腎臟的質(zhì)量；體質(zhì)量為小鼠的質(zhì)量。

6.2 血清BUN（血清尿素氮）、Cr（血肌酐）水平 實驗結(jié)束后，小鼠眼眶取血，靜置1h后離心取血清，-20℃保存。使用全自動生化分析儀測定BUN（血清尿素氮）、Cr（血肌酐）水平。

6.3 腎組織病理學(xué)形態(tài)觀察 取右側(cè)腎臟4%用多聚甲醛固定，切片染色顯微鏡觀察，病理切片組織學(xué)[9]觀察實驗小鼠腎皮質(zhì)、髓質(zhì)分界是否清晰，腎小球、腎小管等有無異常改變，腎間質(zhì)內(nèi)有無炎癥細胞浸潤及變性、出血等癥狀。通過鈣結(jié)晶特異性染色Von Kossa[10]對小鼠腎臟石蠟切片進行染色，電子顯微鏡觀察腎臟組織草酸鈣結(jié)晶的分布與數(shù)量。

7 石見穿活性部位化學(xué)成分的鑒定分析

7.1 供試品溶液的制備 將上述“5.1”項下的浸膏用甲醇稀釋成適宜濃度，10000 r/min 離心 10 min，取上清液，0.22um濾膜濾過，即得供試品溶液。

7.2 色 譜 條 件 Kromasil-5C18色 譜 柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相 0.1% 甲酸（A）- 乙腈（B），梯度洗脫（0～ 6min，5% ～ 10%B；6～ 25min，10%～ 14%B；25～55min，14%～28%；55～70min，28% ～ 38%B；70 ～ 80min，38% ～ 95%B），體積流量1.0 mL/min；柱溫 30℃；進樣量 10 μL，PDA 檢測波長為330nm。

7.3 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源正負離子模式；質(zhì)量掃描范圍m/z 50～1500；高純度氮氣，離子源溫度600°C；氣簾氣流速40L/min；霧化氣流速55L/min；輔助氣流速55L/min；碰撞能量35V。

7.4 總離子流圖的采集 取“7.1”項下經(jīng)處理后的石見穿95%乙醇提取部位供試品溶液適量，按“7.2”項下色譜與“7.3”項下質(zhì)譜條件進樣分析，采集正、負離子模式下的石見穿有效部位總離子流圖。

7.5 化學(xué)成分的鑒定分析 使用Peakview 2.0軟件（美國AB SCIEX公司），對采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)中的一級質(zhì)譜碎片信息及精確準分子離子峰進行分析，計算其未知化合物的元素組成和可能的分子式（誤差±5.0×106），對各色譜峰進行初步鑒定。再通過比對SciFinder數(shù)據(jù)庫、二級質(zhì)譜碎片信息，結(jié)合參考文獻[11-12]進一步確認化學(xué)成分及結(jié)構(gòu)。

8 統(tǒng)計學(xué)方法

通過 GraphPad Prism 8.3.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間比較采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 腎臟系數(shù)

與空白組比較，模型組小鼠體質(zhì)量減輕，腎質(zhì)量、腎臟系數(shù)均增加，具有統(tǒng)計學(xué)差異（t=4.15，P=0.0010）提示造模成功。與模型組比較，陽性藥物組、石見穿95%乙醇部位組、水部位組腎臟系數(shù)均顯著性降低，表明石見穿對腎結(jié)石小鼠的體質(zhì)量、腎質(zhì)量、腎臟系數(shù)具有一定改善作用，對腎結(jié)石小鼠具有一定治療作用。見表1。

表1 石見穿不同部位的ICR小鼠腎臟系數(shù)變化（±s，n=8）

表1 石見穿不同部位的ICR小鼠腎臟系數(shù)變化（±s，n=8）

注：與空白組比較#P<0.001，與模型組比較，*P<0.05，**P<0.001

組別 劑量/g·kg-1 腎臟重量/g 體重量/g 腎臟系數(shù)空白組 － 0.5268±0.0641 40.1445±4.8224 0.0131±0.0005模型組 － 0.4941±0.0312 33.9171±2.4196 0.0146±0.0009#腎石通顆粒組 0.451 0.4564±0.0362 41.0872±0.3504 0.0135±0.0004**石見穿石油醚部位組 1.802 0.4535±0.0236 34.4717±0.9313 0.0143±0.0010石見穿乙醇部位組 1.802 0.4580±0.0535 34.4732±5.1977 0.0134±0.0008*石見穿水部位組 1.802 0.4855±0.0515 35.9375±4.9198 0.0136±0.0006*

2 血清BUN（血清肌酐）、Cr（血肌酐）水平變化

與空白組相比較，模型組小鼠Cr（血肌酐）和BUN（血清肌酐）明顯升高，具有顯著性差異（P<0.001）；與模型組相比較，石見穿95%乙醇部位組和水部位組小鼠血清Cr（血肌酐）和BUN（血清肌酐）水平顯著性降低。表明石見穿95%乙醇部位組和水部位組均有對草酸鈣結(jié)石所致受損腎臟修復(fù)的作用；其中石見穿95%乙醇組的效果最好，能明顯改善乙醛酸鹽所致小鼠腎損傷。見表2。

表2 石見穿不同部位的ICR小鼠血清Cr、BUN（±s，n=8）

表2 石見穿不同部位的ICR小鼠血清Cr、BUN（±s，n=8）

注：與空白組比較#P<0.001 與模型組比較，*P<0.001

組別 劑量/g·kg-1 Cr/umol·L-1 BUN/pmol·L-1空白組 － 8.91±2.00 672.18±126.35模型組 － 26.86±1.27# 2024.21±127.39#腎石通組 0.451 13.13±1.52* 1126.60±103.25*石見穿石油醚部位組 1.802 23.90±2.14 1515.46±112.01石見穿乙醇部位組 1.802 17.62±1.52* 1102.35±145.24*石見穿水部位組 1.802 18.32±2.66* 1235.72±130.93*

3 腎組織病理學(xué)形態(tài)觀察

以蘇木精-伊紅（HE）進行小鼠腎組織染色，如圖2所示，顯微鏡下觀察：空白組和腎石通顆粒組小鼠腎臟組織未見異常，腎小球內(nèi)的毛細血管未見擴張，未見腎小管上皮細胞變性、壞死，未見炎細胞浸潤。模型組小鼠腎組織整體結(jié)構(gòu)異常，可見腎小球明顯萎縮壞死，大量腎小管明顯擴張，組織間質(zhì)可見大量纖維結(jié)締組織異常增生，明顯纖維化，可見明顯炎癥細胞浸潤。石油醚部位組小鼠腎組織整體結(jié)構(gòu)異常，可見腎小管上皮細胞疏松水腫脫落壞死，組織可見炎癥細胞浸潤。乙醇部位組小鼠腎組織整體結(jié)構(gòu)基本正常。腎小管、腎小球未有明顯壞死等變性。水部位組小鼠腎組織整體結(jié)構(gòu)輕度異常，腎小球組織可見少量腎小管上皮細胞脂肪變性。

圖2 腎組織病理學(xué)形態(tài)（×200）

4 腎組織內(nèi)病理性鈣沉積情況

圖3所示，顯微鏡下觀察：空白組和陽性藥物組小鼠腎臟組織未見草酸鈣結(jié)晶。模型組小鼠腎組織整體結(jié)構(gòu)異常，有大量草酸鈣結(jié)晶存在。石油醚部位組小鼠腎組織整體結(jié)構(gòu)異常，存在一定數(shù)量草酸鈣結(jié)晶。乙醇部位組小鼠腎組織整體結(jié)構(gòu)正常，無草酸鈣結(jié)晶。水部位組小鼠腎組織整體結(jié)構(gòu)基本正常，無草酸鈣結(jié)晶。見圖3（圖中黑色箭頭為草酸鈣結(jié)晶）。

圖3 腎組織內(nèi)病理性鈣沉積情況（×200）

5 95%乙醇部位化學(xué)成分鑒定

采用UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術(shù)對石見穿95%乙醇部位進行全掃，其負離子模式下總離子流圖如圖4所示。根據(jù)數(shù)據(jù)處理方法，進行鑒定分析。在石見穿95%乙醇提取部位中，共鑒定出28個化合物，包括13個有機酸類，如：迷迭香酸、丹參酚酸等；5個三萜類化合物：山楂酸、積雪草酸等；4個黃酮類化合物，如蘆丁、槲皮素；6個其他類成分。各化合物的保留時間（tR）等信息，見表3。

表3 石見穿95%乙醇部位化學(xué)成分解析

圖4 石見穿95%乙醇提取部位總離子流

小結(jié)與討論

目前認為，腎結(jié)石屬上尿路結(jié)石，在中醫(yī)學(xué)中屬“石淋”“砂淋”“血尿”“腰痛”等范疇，其臨床以腰痛尿道刺痛，排砂石為主癥。草酸鈣結(jié)石是泌尿系結(jié)石中最常見的類型，腎草酸鈣結(jié)石患者的草酸鈣結(jié)晶在腎小管上皮細胞中黏附形成結(jié)石顆粒，所造成的腎小管上皮損傷可進一步導(dǎo)致腎功能損傷，草酸鈣結(jié)晶易在受損部位沉積加劇腎臟損傷，如此往復(fù)給患者帶來較大困擾和痛苦，嚴重威脅患者的生命健康。因此，對草酸鈣結(jié)石進行及時有效的治療顯得十分重要。本研究采用乙醛酸注射法誘導(dǎo)創(chuàng)立腎草酸鈣結(jié)石小鼠模型并進行相關(guān)研究，研究中發(fā)現(xiàn)腎草酸鈣結(jié)石小鼠血肌酐、血尿素氮水平升高，提示腎草酸鈣結(jié)石可對腎功能造成較為明顯的影響。草酸鈣堆積在腎小管及腎小球中，形成結(jié)晶體，阻塞腎小管，并且通過炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細胞凋亡與壞死和纖維化等途徑，造成腎臟損傷。

本研究從石見穿對腎草酸鈣結(jié)石引起的腎臟損傷具有“溶石”和修復(fù)作用為切入點，對石見穿石油醚部位、95%乙醇部位、水部位進行藥效篩選，得出石見穿95%乙醇部位能夠顯著降低腎草酸鈣結(jié)石小鼠血清肌酐、尿素氮水平，并且能夠溶解小鼠腎臟草酸鈣結(jié)石。提示該部位有良好的腎損傷修復(fù)和溶石作用為擴大石見穿藥效范圍提供了依據(jù)。中藥所含成分較多且較為復(fù)雜，因而其具體藥效物質(zhì)基礎(chǔ)以及作用機制不甚明確。口服的中藥可通過吸收入血的成分發(fā)揮藥效，因此這些入血成分可能是中藥發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)。基于此，后期將對石見穿入血成分進行分析，探討石見穿的入血成分，為更進一步闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考。