景鶴養(yǎng)心舒治療慢性心力衰竭的作用機(jī)制*

胡華鵬，朱金燕，李杰平，趙星，劉明

1 云南中醫(yī)藥大學(xué) 云南昆明 650500

2 昆明市中醫(yī)醫(yī)院 云南昆明 650051

3 昭通衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院 云南昭通 657099

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是因心肌細(xì)胞缺血缺氧及血流動(dòng)力學(xué)負(fù)荷過重等引起心肌細(xì)胞損害而導(dǎo)致心臟功能異常的一種心血管疾病，對(duì)患者生理、心理健康造成了很大影響[1]。據(jù)相關(guān)研究[2-5]，中國(guó)、美國(guó)、歐洲等各國(guó)CHF患者基數(shù)大，預(yù)后差，具有較高的致殘率及致死率。目前治療CHF取得了很大的進(jìn)展，在改善CHF患者再住院率、死亡率及生活質(zhì)量等方面有了很大的突破，但其臨床療效不能達(dá)到人們的預(yù)期[6]。

景鶴養(yǎng)心舒是云南省名中醫(yī)劉明教授基于中醫(yī)辨證論治的理論體系，結(jié)合多年的臨床經(jīng)驗(yàn)，在長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐中反復(fù)驗(yàn)證擬定，在治療慢性心力衰竭取得了較好的臨床療效。為了深入探究景鶴養(yǎng)心舒治療慢性心力衰竭的作用機(jī)制，擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接從細(xì)胞及分子層面對(duì)該藥進(jìn)行剖析，為進(jìn)一步開展具體的藥理及機(jī)制研究提供一定的理論依據(jù)。

資料與方法

1 方藥組成

景鶴養(yǎng)心舒組方：紅景天、仙鶴草、葶藶子、桂枝、茯苓、丹參、甘草。

2 數(shù)據(jù)庫與軟件

TCMSP 數(shù) 據(jù) 庫（https：//old.tcmsp-e.com/）；TCMID 數(shù)據(jù)庫（http：//47.100.169.139/tcmid/）；Gene-Cards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）；Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）；SwissTargetPrediction數(shù) 據(jù) 庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）；Dis-GeNET 數(shù) 據(jù) 庫（https：//www.disgenet.org/）；venny圖（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）；STRING 數(shù) 據(jù) 庫（https：//cn.string-db.org/）；DAVID Bioinformatics Resources數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）；PDB 數(shù) 據(jù) 庫（https： / /www.rcsb.org /）； Cytoscape3.9.1軟 件；Pymol軟 件；Autodock軟 件；Excel 2014軟件。

3 方法

3.1 景鶴養(yǎng)心舒相關(guān)靶點(diǎn)篩選 檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫，分別以“仙鶴草、葶藶子、桂枝、茯苓、丹參、甘草”為關(guān)鍵詞，以藥物類藥性（DL）≥0.18和口服生物利用度（OB）≥30%為篩選條件[7]，得到景鶴養(yǎng)心舒中上述6味中藥的有效成分及相關(guān)靶點(diǎn)的蛋白名稱，再通過Uniprot數(shù)據(jù)庫查找相應(yīng)的“Homo sapiens”基因名稱。以“HONG JING TIAN”為關(guān)鍵詞在TCMID數(shù)據(jù)庫中查找紅景天的有效成分，再通過SwissTarget-Prediction數(shù)據(jù)庫以Probability>0.02為篩選條件檢索出相對(duì)的基因靶點(diǎn)。

3.2 CHF相關(guān)靶點(diǎn)篩選 檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫，以“chronic heart failure”為關(guān)鍵詞搜索相關(guān)基因靶點(diǎn)，并通過venny圖篩選出兩個(gè)數(shù)據(jù)庫中的相同基因靶點(diǎn)。

3.3 “藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 使用venny圖查找景鶴養(yǎng)心舒靶點(diǎn)與CHF靶點(diǎn)的交集，并篩選出景鶴養(yǎng)心舒中作用于該交集靶點(diǎn)的成分。將篩選出的成分與交集靶點(diǎn)一一對(duì)應(yīng)并導(dǎo)入Cytoscape3.9.1軟件中，構(gòu)建景鶴養(yǎng)心舒有效成分與CHF靶點(diǎn)的關(guān)系圖。

3.4 成分-疾病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為進(jìn)一步研究景鶴養(yǎng)心舒治療CHF的藥理機(jī)制，本研究通過STRING在線平臺(tái)輸入景鶴養(yǎng)心舒和CHF的交集靶點(diǎn)，進(jìn)行蛋白—蛋白相互作用分析，選取互作分?jǐn)?shù)≥0.4。

3.5 景鶴養(yǎng)心舒成分-CHF靶點(diǎn)功能與通路的富集分析 為了說明靶蛋白在治療CHF中的生物學(xué)過程、分子功能、細(xì)胞組成、通路分析及富集情況，進(jìn)行GO富集分析和KEGG富集分析。將景鶴養(yǎng)心舒和CHF的交集靶點(diǎn)輸入DAVID數(shù)據(jù)庫，選擇物種“Homo Sapiens”（P<0.05），進(jìn)行富集分析。

3.6 核心活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證 為驗(yàn)證篩選出的核心成分作用于CHF潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)的準(zhǔn)確性，將“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖篩選出的核心成分與PPI網(wǎng)絡(luò)中得到的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。在 TCMSP 數(shù)據(jù)庫中下載核心成分的2D 分子結(jié)構(gòu)，從PDB數(shù)據(jù)庫下載關(guān)鍵靶點(diǎn)3D結(jié)構(gòu)，所得成分與靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)均導(dǎo)入Pymol軟件進(jìn)行脫水，并保存為pdb格式，再通過 Autodock 軟件進(jìn)行預(yù)處理及分子對(duì)接，運(yùn)用Pymol軟件進(jìn)行輸出優(yōu)化。

結(jié) 果

1 景鶴養(yǎng)心舒有效成分的篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

共篩選出景鶴養(yǎng)心舒中有效成分182個(gè)（其中紅景天26個(gè)，去除無靶點(diǎn)以及無人源靶點(diǎn)化合物后21個(gè)；仙鶴草5個(gè)，去除無靶點(diǎn)以及無人源靶點(diǎn)化合物后5個(gè)；葶藶子12個(gè)，去除無靶點(diǎn)以及無人源靶點(diǎn)化合物后9個(gè)；桂枝7個(gè)，去除無靶點(diǎn)以及無人源靶點(diǎn)化合物后6個(gè)；茯苓15個(gè)，去除無靶點(diǎn)以及無人源靶點(diǎn)化合物后6個(gè)；丹參65個(gè)，去除無靶點(diǎn)以及無人源靶點(diǎn)化合物后59個(gè)；甘草92個(gè)，去除無靶點(diǎn)以及無人源靶點(diǎn)化合物后85個(gè)。共191個(gè)，刪除重復(fù)項(xiàng)后共182個(gè)），對(duì)應(yīng)基因靶點(diǎn)共3380個(gè)，刪除重復(fù)項(xiàng)后共499個(gè)。

2 CHF相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

GeneCards數(shù)據(jù)庫中共檢索出CHF基因靶點(diǎn)10596個(gè)，DisGeNET數(shù)據(jù)庫中共檢索出CHF靶點(diǎn)223個(gè)，通過venny圖篩選出相同靶點(diǎn)199個(gè)。

3 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

通過venny圖，景鶴養(yǎng)心舒作用靶點(diǎn)與CHF相關(guān)靶點(diǎn)交集42個(gè)，見圖1，可視化分析見表1，這些即為景鶴養(yǎng)心舒作用于CHF所涉及的靶點(diǎn)。選出景鶴養(yǎng)心舒中能夠作用于這42個(gè)靶點(diǎn)的有效成分，共有紅景天16種、仙鶴草4種、葶藶子7種、茯苓4種、桂枝3種、丹參44種，甘草73種，景鶴養(yǎng)心舒治療CHF的有效成分共142種。景鶴養(yǎng)心舒“藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病”關(guān)系見圖2，可視化結(jié)果顯示，景鶴養(yǎng)心舒有效成分中Quercetin（槲皮苷）和Kaempferol（山奈酚）的出度較高，見表2，作用靶點(diǎn)中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和二肽基肽酶4的入度較高，見表2，表3。

表1 景鶴養(yǎng)心舒化合物靶點(diǎn)與CHF相關(guān)靶點(diǎn)共有交集

表2 出度最高的5種有效成分

表3 入度最高的5個(gè)靶點(diǎn)基因

圖1 景鶴養(yǎng)心舒靶點(diǎn)與CHF靶點(diǎn)關(guān)系

圖2 “中藥-疾病-有效成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

4 蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)

通過STRING數(shù)據(jù)庫，得到景鶴養(yǎng)心舒42個(gè)靶點(diǎn)基因間相互作用，利用Cytoscape繪制蛋白—蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3，可視化分析后自由度最高的5種分別為 IL6、TNF、NOS3、VEGFA、ACE，見表4。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)Cytoscape

表4 自由度最高的5種靶基因

5 靶點(diǎn)功能與通路的富集分析

GO功能富集分析得到768個(gè)條目（P<0.05），其中生物過程273個(gè)、分子功能35個(gè)、細(xì)胞成分22個(gè)，3個(gè)部分各取前10個(gè)條目建立柱狀圖，見圖4。柱狀圖顯示，生物學(xué)過程包括細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路、缺氧反應(yīng)、基因表達(dá)的正調(diào)控、炎癥反應(yīng)、G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路、藥物反應(yīng)、凋亡過程的正調(diào)控、RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞增殖的正調(diào)控。細(xì)胞組分有質(zhì)膜、膜的組成部分、質(zhì)膜的組成部分、細(xì)胞外間隙、細(xì)胞外區(qū)、膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、厄爾表面、突觸前膜的內(nèi)胚層成分。分子功能涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、相同蛋白結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚化活性、蛋白質(zhì)異二聚活性、酶結(jié)合、G蛋白偶聯(lián)受體活性、鋅離子結(jié)合、細(xì)胞因子活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、大分子復(fù)合物結(jié)合。

圖4 景鶴養(yǎng)心舒治療CHF GO富集分析

KEGG通路富集分析得到60個(gè)條目（P<0.05），選擇前20個(gè)條目建立氣泡圖，見圖5。這些通路包括流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化通路、AGE-RAGE信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化通路、HIF-1信號(hào)通路、代謝途徑、cGMP-PKG信號(hào)通路、糖尿病心肌病、PI3K-Akt信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、AGERAGE信號(hào)通路、松弛素信號(hào)通路等，通過氣泡圖也可以看出流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化通路、AGERAGE信號(hào)通路為最重要兩條通路。

圖5 景鶴養(yǎng)心舒治療CHF KEGG富集分析氣泡

6 核心活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證

以篩選出的5種核心成分與5種關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果分子對(duì)接所得結(jié)合能均小于-5，提示核心活性成分與靶點(diǎn)均具有較好的結(jié)合活性，分子對(duì)接結(jié)果見表4，其中β-谷甾醇與NOS3、β-谷甾醇與ACE、山奈酚與ACE結(jié)合力較為顯著，見圖6。

圖6 對(duì)接結(jié)果示意

表4 核心活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)合能

討 論

本研究系統(tǒng)分析了景鶴養(yǎng)心舒的活性成分及其治療CHF的作用靶點(diǎn)，通過構(gòu)建“中藥－疾病－有效成分－靶點(diǎn)”關(guān)系圖，可推測(cè)槲皮苷、山奈酚、木犀草素、β-谷甾醇、異鼠李素這5種成分可能是景鶴養(yǎng)心舒治療CHF的最重要化學(xué)物質(zhì)，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（NOS2）、二肽基肽酶 4（DPP4）、β-2 腎上腺素受體（ADRB2）、毒蕈堿乙酰膽堿受體M3（CHRM3）、Mu型阿片受體（OPRM1）靶點(diǎn)是景鶴養(yǎng)心舒作用于CHF最主要的靶點(diǎn)。槲皮苷是一種黃酮類單體化合物，可抑制促進(jìn)細(xì)胞凋亡和心臟肥大的鈣調(diào)蛋白磷酸酶的活性，可抑制炎癥反應(yīng)，抵制細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激[8-9]。山奈酚屬于黃酮類化合物，能促進(jìn)缺氧心肌細(xì)胞增殖、降低活性氧水平、抑制缺氧心肌細(xì)胞凋亡和抑制自噬，也有抗炎的作用[10]。木犀草素是屬于黃酮類化合物，能抗氧化應(yīng)激及抑制炎癥反應(yīng)，抑制心肌細(xì)胞線粒體損傷，抑制外周血淋巴細(xì)胞DNA損傷[11-12]。β-谷甾醇是一種天然多酚羥酸類化合物，能緩解氧化應(yīng)激損傷，改善炎癥反應(yīng)，也可通過下調(diào)ERK1/2信號(hào)通路，上調(diào)Bcl-2/Bax信號(hào)通路，抑制心肌細(xì)胞凋亡[13]。異鼠李素是一種植物類黃酮，通過抑制心肌細(xì)胞線粒體的調(diào)亡，從而阻止細(xì)胞自噬的發(fā)生[14]。DPP4可作用于干細(xì)胞，調(diào)控心肌細(xì)胞的再生；可作用于心肌膠原纖維表達(dá)；與炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞因子產(chǎn)生相關(guān)[15-16]。ADRB2對(duì)正常心肌細(xì)胞無太大影響，心衰細(xì)胞中的ADRB2的增加導(dǎo)致環(huán)磷酸腺苷的區(qū)域化，來促進(jìn)心肌細(xì)胞的存活，增強(qiáng)心肌細(xì)胞抗損傷、抗缺血和缺氧能力，除此以外，ADRB2在確保心衰細(xì)胞存活率的基礎(chǔ)上增加心肌細(xì)胞的收縮幅度[17]。NOS2、CHRM3、OPRM1作為CHF的靶點(diǎn)，也是景鶴養(yǎng)心舒治療CHF的主要靶點(diǎn)之一，目前文獻(xiàn)中暫未發(fā)現(xiàn)對(duì)心血管方面的確切研究。

通過PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果可看出白細(xì)胞介素-6（IL6）、腫瘤壞死因子（TNF）、內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（NOS3）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）、血清血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）是景鶴養(yǎng)心舒作用于CHF的關(guān)鍵靶點(diǎn)。TNF、IL6均作為重要的炎癥因子，通過刺激促炎白細(xì)胞的募集，促進(jìn)心肌損傷、纖維化重塑和功能障礙已廣泛參與心力衰竭的發(fā)病機(jī)制[18]。NOS3主要存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞，在催化劑的催化下可生成內(nèi)皮細(xì)胞衍生性一氧化氮，進(jìn)而引起鳥苷酸環(huán)化酶激活積聚，游離Ca2+減少，最終導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞松弛、血管擴(kuò)張[19]。VEGFA是調(diào)節(jié)血管功能的關(guān)鍵因子，能夠與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的相關(guān)受體結(jié)合，發(fā)揮促進(jìn)新生血管形成等功能[20]。ACE與血管的收縮擴(kuò)張功能密切相關(guān)，2018中國(guó)心力衰竭診斷和治療指南提出所有射血分?jǐn)?shù)降低型心力衰竭患者均應(yīng)使用ACE拮抗劑[21]。

從GO富集分析得出景鶴養(yǎng)心舒作用于CHF的生物學(xué)過程主要涉及炎癥反應(yīng)、缺氧反應(yīng)、基因表達(dá)的正負(fù)調(diào)控、細(xì)胞增殖的正調(diào)控、調(diào)亡過程的正調(diào)控、藥物反應(yīng)等。細(xì)胞組分包括質(zhì)膜、膜的組成部分、質(zhì)膜的組成部分、細(xì)胞外間隙、細(xì)胞外區(qū)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、厄爾表面、突觸前膜的內(nèi)胚層成分等。分子功能涉及相同蛋白結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚化活性、蛋白質(zhì)異二聚活性、酶結(jié)合、G蛋白偶聯(lián)受體活性、鋅離子結(jié)合、細(xì)胞因子活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、大分子復(fù)合物結(jié)合等。

通過KEGG富集分析可知景鶴養(yǎng)心舒治療CHF的信號(hào)通路主要涉及以上所述20種通路，流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化通路、AGE-RAGE信號(hào)通路為景鶴養(yǎng)心舒治療CHF的主要通路。其中流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化均可影響血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，進(jìn)而影響到NO的產(chǎn)生及炎癥因子的釋放[22]。AGERAGE信號(hào)通路可通過其對(duì)動(dòng)脈僵硬度、動(dòng)脈粥樣硬化、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、鈣穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞骨架功能的影響來調(diào)節(jié)CHF的發(fā)病機(jī)制[23]。此外，HIF-1信號(hào)通路主要涉及涉及活性氧的產(chǎn)生[24]。cGMPPKG信號(hào)通路可控制各種心肌特性，包括細(xì)胞生長(zhǎng)和存活、間質(zhì)纖維化、內(nèi)皮通透性、心肌收縮力和心血管重塑[25]。糖尿病心肌病的途徑主要表現(xiàn)在心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激、炎癥、調(diào)亡和神經(jīng)體液機(jī)制等方面[26]。PI3K-Akt信號(hào)通路通過改變呼吸鏈終端酶細(xì)胞色素C氧化酶的活性來保護(hù)線粒體的功能，進(jìn)而阻止細(xì)胞調(diào)亡[27]。壓力超負(fù)荷可引起心肌細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度升高，同時(shí)，cAMP表達(dá)減少會(huì)導(dǎo)致Ca2+的轉(zhuǎn)運(yùn)異常，從而導(dǎo)致心肌的舒縮功能障礙[28-29]。

最后，分子對(duì)接結(jié)果顯示了景鶴養(yǎng)心舒中的核心成分與該藥治療CHF的關(guān)鍵靶點(diǎn)之間有良好的對(duì)接，其中β-谷甾醇與NOS3、β-谷甾醇與ACE、山奈酚與ACE結(jié)合力較為顯著。

結(jié) 論

綜上所述，景鶴養(yǎng)心舒治療CHF作用機(jī)制可能是該藥中槲皮苷、山奈酚、木犀草素、β-谷甾醇、異鼠李素這5種核心成分作用于IL6、TNF、NOS3、VEGFA、ACE等關(guān)鍵靶點(diǎn)，通過流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化通路、AGE-RAGE信號(hào)通路等通路發(fā)揮抑制心臟重塑、延緩心肌細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、影響炎性因子、改善心臟收縮舒張功能、減輕心臟后負(fù)荷等作用。但由于中藥組方的復(fù)雜性，景鶴養(yǎng)心舒治療CHF是否通過上述機(jī)制發(fā)揮作用還需后續(xù)的基礎(chǔ)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。