固相萃取—氣相色譜/質(zhì)譜法同時測定咖啡干果皮中24種農(nóng)藥殘留

劉 超 梅麗寶 尹海飛 李樹珍 龍宇宙

(1.保山市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測中心，云南 保山 678000；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所，海南 萬寧 571533)

咖啡與可可、茶葉并稱世界三大飲料，是僅次于石油的第二大世界貿(mào)易產(chǎn)品，全球咖啡及其制品的消費人數(shù)已超過15億[1]。作為咖啡副產(chǎn)物的咖啡果皮，質(zhì)量約占咖啡鮮果的43%～50%，每年中國咖啡生產(chǎn)過程中有40萬t鮮果皮產(chǎn)生，除少量用于漚肥外，大量被丟棄[2]。目前，有關(guān)咖啡果皮的研究較多，如咖啡果皮成分研究[3-5]、咖啡果皮活性物質(zhì)分析[6-9]、咖啡果皮茶[10-12]、咖啡果皮酒新產(chǎn)品研發(fā)[13-14]等。其中較為成熟的研究是將咖啡鮮果皮曬干后，制成干果皮泡水喝，其味道香甜，深受消費者喜愛。但是，咖啡作為農(nóng)作物，種植過程中會施用農(nóng)藥，因此咖啡果皮農(nóng)藥殘留問題是消費者關(guān)注的熱點。而有關(guān)農(nóng)藥殘留的檢測方法主要有快速試劑盒法[15]、分光光度法[16]、色譜法[17-18]、質(zhì)譜法[19-20]等?？焖僭噭┖蟹ㄖ荒艹醪胶Y查樣品中是否存在農(nóng)藥殘留，不能準確定量；分光光度法只適用于部分農(nóng)藥殘留的檢測；氣相色譜法對農(nóng)藥殘留假陽性峰不能準確識別，存在誤判；氣相色譜—質(zhì)譜法因具有分析準確、靈敏度高、線性范圍寬等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用[21-24]，已成為當(dāng)前農(nóng)殘檢測技術(shù)的重要手段[25-26]。

針對咖啡果皮基質(zhì)成分復(fù)雜：含糖類、脂肪、蛋白質(zhì)、粗纖維、咖啡因、花青素、綠原酸、葫蘆巴堿、生物堿等[27]，在農(nóng)殘檢測過程中存在基質(zhì)效應(yīng)高、回收率低、檢測結(jié)果不準確的問題。研究擬通過優(yōu)化提取溶劑、控制洗脫溶劑極性、選擇合適的固相萃取凈化填料，建立固相萃取凈化技術(shù)—氣相色譜/質(zhì)譜法同時測定咖啡干果皮中24種農(nóng)藥殘留的方法，為咖啡干果皮中多種農(nóng)藥殘留的檢測提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

咖啡干果皮：采自云南省保山市、普洱市、臨滄市、德宏州，共12份樣品，常溫密封貯藏；

農(nóng)藥標準物質(zhì)(敵敵畏、甲胺磷、異丙威、滅線磷、甲拌磷、二嗪磷、氯唑磷、久效磷、甲基毒死蜱、毒死蜱、甲基對硫磷、倍硫磷、馬拉硫磷、殺螟硫磷、對硫磷、二甲戊靈、喹硫磷、水胺硫磷、三唑醇、殺撲磷、溴蟲腈、丙環(huán)唑、三唑磷、戊唑醇、環(huán)氧七氯)：質(zhì)量濃度為100 μg/mL，1.2 mL/支，壇墨質(zhì)檢—標準物質(zhì)中心；

正己烷、乙腈、丙酮、甲苯：色譜純，美國Supelco公司；

水：UP超純水，實驗室自制；

ProElut Florisil固相萃取小柱：500 mg/6 mL，迪馬科技有限公司；

Mega BE Carb/NH2固相萃取小柱：500 mg/6 mL，美國Agilent Technologies公司；

ProElut TPC固相萃取小柱：3 g/12 mL，迪馬科技有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：7890A-5975C型，配有EI電子轟擊離子源，美國Agilent Technologies公司；

石英毛細管色譜柱：ZB-1701型，30 m×0.25 mm×0.25 μm，廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司；

電子分析天平：MS205DΜ型，瑞士Mettler Toledo公司；

超聲儀：AS3120型，北京華瑞博遠科技發(fā)展有限公司；

氮吹濃縮裝置：MTN-2800W型，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-3000型，上海亞榮生化儀器廠；

離心機：TDL-40B型，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 混合標準工作溶液的配制

(1)混合標準儲備液：以丙酮為溶劑，依次吸取24種農(nóng)藥標準物質(zhì)各1.00 mL于25.00 mL棕色容量瓶中，定容，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為4.00 μg/mL的儲備液。

(2)內(nèi)標溶液：準確移取質(zhì)量濃度為100 μg/mL的環(huán)氧七氯標準溶液1.00 mL，用丙酮定容至2.00 mL，配成質(zhì)量濃度為50.00 μg/mL的內(nèi)標溶液。

(3)混合標準工作液：分別移取0.00，0.20，0.50，1.00，2.50，5.00 mL混合標準儲備液于10.00 mL棕色容量瓶中，用空白基質(zhì)溶液定容，配制成質(zhì)量濃度分別為0.00，0.08，0.20，0.40，1.00，2.00 μg/mL的標準工作液，移取1.00 mL于1.5 mL進樣瓶中，加入20 μL內(nèi)標溶液，使內(nèi)標濃度為1.00 μg/mL。

1.2.2 試樣的制備 取咖啡干果皮400 g，按四分法取樣，粉碎，過0.22 mm孔徑篩網(wǎng)。

1.2.3 試樣的提取 稱取5.00 g試樣于50 mL塑料離心管中，加3.0 mL水潤濕，加入20 μL內(nèi)標和30 mL乙腈，蓋緊塞子，超聲提取30 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液，加入20 mL乙腈，重復(fù)上述操作，合并離心液于150 mL雞心瓶中，45 ℃水浴減壓蒸發(fā)近干，加入2.0 mL丙酮溶解，待凈化。

1.2.4 試樣的凈化 將ProElut TPC固相萃取小柱安裝于固相萃取裝置上，用5.0 mL乙腈—甲苯(V乙腈∶V甲苯=3∶1)預(yù)淋洗小柱，待淋洗液到達吸附層表面時，將濃縮液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中，下接10 mL比色管，用10 mL洗脫液洗脫，控制流速為2～3 mL/min，收集洗脫液于10 mL 比色管中，45 ℃水浴氮吹濃縮近干，用1.0 mL丙酮溶解，定容，過0.22 μm尼龍濾頭，供氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀測定。

1.2.5 分析條件

(1)色譜條件：升溫程序為80 ℃保持1 min，以20 ℃/min升至200 ℃，保持7 min，以20 ℃/min升溫至265 ℃，保持10 min；載氣(He)流速1.0 mL/min，壓力70.3 kPa，進樣口溫度260 ℃，進樣量1.0 μL，不分流進樣。

(2)質(zhì)譜條件：電子能量70 eV；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度200 ℃；選擇離子(SIM)監(jiān)測模式；掃描時間5～28 min。

1.2.6 方法的定量限、回收率和精密度測定 取咖啡干果皮空白樣品，按試驗方法處理后，測定被測樣品信號強度S與噪音強度N，按S/N=10計算定量限；另取兩份咖啡干果皮空白樣品，分別在0.03，0.30 mg/kg水平進行加標試驗，重復(fù)測定6次，計算加標回收率和日內(nèi)精密度，同時取相同含量的對照品，連續(xù)監(jiān)測6 d，計算方法的日間精密度。

1.2.7 試驗分析 依次準確吸取1.0 μL標準工作液及處理后的樣品溶液注入氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)，以保留時間和離子豐度比定性，以峰面積內(nèi)標法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

查閱相關(guān)資料[28-30]，農(nóng)藥殘留檢測常用的提取溶劑有石油醚、丙酮、乙腈。石油醚作為提取溶劑時，主要用于油脂含量高、極性小的有機氯類農(nóng)藥化合物的提取，如GB/T 5009.19—2008《食品中有機氯農(nóng)藥多組分殘留量的測定》，對極性較大的農(nóng)殘化合物提取效率低。丙酮作為提取溶劑，適用于大多數(shù)農(nóng)殘的提取，特別是極性較大的有機磷類農(nóng)藥的提取，如GB/T 5009.20—2003《食品中有機磷農(nóng)藥殘留量的測定》，但丙酮在提取過程中，植物組織中的油脂和色素也會被提取出來，嚴重影響后續(xù)的凈化處理[31]。乙腈作提取劑時，提取效率高、溶出雜質(zhì)少、后處理簡便[32]。因此，選擇乙腈作為提取溶劑。

2.2 洗脫溶劑和固相萃取小柱的選擇

3種不同的洗脫溶劑[正己烷—丙酮(V正己烷∶V丙酮=9∶1)、丙酮、乙腈—甲苯(V乙腈∶V甲苯=3∶1)]對3種不同填料固相萃取小柱(ProElut Florisil固相萃取小柱、Mega BE Carb/NH2固相萃取小柱、ProElut TPC固相萃取小柱)中農(nóng)殘的洗脫效率見表1。

由表1可知，吸附于ProElut Florisil固相萃取小柱中的農(nóng)藥殘留洗脫效果為乙腈—甲苯>丙酮>正己烷—丙酮；吸附于Mega BE Carb/NH2固相萃取小柱中的農(nóng)藥殘留洗脫效果為乙腈—甲苯>丙酮>正己烷—丙酮；吸附于ProElut TPC固相萃取小柱中的農(nóng)藥殘留洗脫效果為乙腈—甲苯>丙酮>正己烷—丙酮，說明選取正己烷—丙酮和丙酮作為洗脫溶劑時，24種農(nóng)藥洗脫效率值均低于乙腈—甲苯溶液，同時誤差也最大。當(dāng)用正己烷—丙酮作洗脫溶劑時，吸附在ProElut Florisil固相萃取小柱和Mega BE Carb/NH2固相萃取小柱上的敵敵畏、甲拌磷較難被洗脫。由圖1可知，敵敵畏、甲拌磷在GC-MS中的響應(yīng)值非常低，主要與農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)及洗脫溶劑的極性有關(guān)，而被檢測的農(nóng)藥多為有機磷類和雜環(huán)類結(jié)構(gòu)，極性大，依據(jù)相似相溶原理，當(dāng)用極性較低的溶劑正己烷—丙酮和丙酮時，極性大的農(nóng)藥化合物較難被洗脫，當(dāng)增大極性，用乙腈—甲苯洗脫時，被檢測的農(nóng)藥化合物較易被洗脫。

圖1 24種農(nóng)殘標準溶液(1.00 μg/mL)在不同固相萃取小柱和洗脫溶劑中選擇離子流色譜圖

表1 農(nóng)藥標準物質(zhì)在不同固相萃取小柱和洗脫溶劑下的洗脫效率

在正己烷—丙酮(V正己烷∶V丙酮=9∶1)洗脫溶劑體系下，3種固相萃取小柱的凈化效果為ProElut TPC固相萃取小柱>ProElut Florisil固相萃取小柱>Mega BE Carb/NH2固相萃取小柱；在丙酮洗脫溶劑體系下，3種固相萃取小柱的洗脫效果為ProElut TPC固相萃取小柱>ProElut Florisil固相萃取小柱>Mega BE Carb/NH2固相萃取小柱；在乙腈—甲苯(V乙腈∶V甲苯=3∶1)洗脫溶劑體系下，3種固相萃取小柱的洗脫效果為ProElut TPC固相萃取小柱>Mega BE Carb/NH2>固相萃取小柱ProElut Florisil固相萃取小柱。3種固相萃取小柱的洗脫凈化效率存在差異，主要與固相萃取小柱的填充材料有關(guān)，F(xiàn)lorisil固相萃取小柱以無機材料弗羅里硅藻土(MgO·SiO2)為主，是一種高選擇性能的吸附劑，主要吸附油脂、烴類含氮化合物及色素；Mega BECarb/NH2固相萃取小柱以石墨化碳(CARB)和氨基(NH2)為主，主要通過離子交換和極性吸附達到保留的作用；ProElut TPC固相萃取小柱是以高聚物PAS、石墨化碳(CARB)和硫酸鎂為主，是與NH2相似的吸附柱，但具有比NH2更強的離子交換能力，可用于去除農(nóng)殘分析中的金屬離子、有機酸、色素和酚類物質(zhì)。24種農(nóng)殘在ProElut TPC固相萃取小柱上的吸附效率最低，經(jīng)GC-MS檢測，目標峰最多，其次為ProElut Florisil固相萃取小柱，吸附最大的為Mega BE Carb/NH2固相萃取小柱。

綜上，選擇乙腈—甲苯(V乙腈∶V甲苯=3∶1)作為洗脫溶劑，ProElut TPC固相萃取小柱作為凈化柱。

2.3 分析條件的優(yōu)化

以兩相鄰色譜峰分離度≥1.5為原則，優(yōu)化氣相色譜條件，通過全掃描獲得混合標準農(nóng)藥總離子流圖(TIC)，根據(jù)總離子流圖中目標化合物的保留時間和質(zhì)荷比(m/z)，確定選擇離子掃描(SIM)模式下的分析條件，24種農(nóng)藥殘留的保留時間、定性離子、定量離子及豐度比見表2。

表2 24種農(nóng)藥保留時間、定量和定性離子、線性方程等相關(guān)參數(shù)表

2.4 校準曲線及其相關(guān)性

由圖2可知，24種農(nóng)藥在28 min內(nèi)得到較好分離，各農(nóng)藥在質(zhì)量濃度為0.016～0.400 mg/kg時線性關(guān)系良好，其相關(guān)系數(shù)為0.997 9～0.999 9，符合GB/T 27417—2017《合格評定 化學(xué)分析方法確認和驗證指南》定量分析要求。

1.敵敵畏 2.甲胺磷 3.異丙威 4.滅線磷 5.甲拌磷 6.二嗪磷 7.氯唑磷 8.久效磷 9.甲基毒死蜱 10.毒死蜱 11.甲基對硫磷 12.倍硫磷 13.馬拉硫磷 14.殺螟硫磷 15.環(huán)氧七氯(內(nèi)標) 16.對硫磷 17.二甲戊靈 18.喹硫磷 19.水胺硫磷 20.三唑醇 21.殺撲磷 22.溴蟲腈 23.丙環(huán)唑 24.三唑磷 25.戊唑醇

2.5 方法的定量限、回收率和精密度

由表3可知，24種農(nóng)藥殘留的方法定量限為0.01～0.03 mg/kg；0.03 mg/kg加標水平下，回收率為65.2%～108.5%，日內(nèi)精密度相對標準偏差(RSD)為3.7%～6.8%，日間精密度相對標準偏差為4.2%～7.2%；0.30 mg/kg 加標水平下，回收率為81.4%～105.7%，日內(nèi)精密度相對標準偏差為2.5%～5.9%，日間精密度相對標準偏差為2.8%～6.4%，符合GB/T 27417—2017《合格評定 化學(xué)分析方法確認和驗證指南》要求。

表3 0.03，0.30 mg/kg加標水平下24種農(nóng)藥殘留的定量限、回收率和精密度

2.6 實際樣品分析

運用建立的方法對保山市、普洱市、臨滄市、德宏州4個咖啡主產(chǎn)區(qū)的12份咖啡干果皮樣品進行農(nóng)藥殘留檢測，結(jié)果表明：2份樣品檢出毒死蜱，含量分別為0.041，0.037 mg/kg；1份樣品檢出戊唑醇，含量為0.058 mg/kg，為了進一步驗證方法的準確性，將檢測出毒死蜱和戊唑醇的樣品進液相色譜—質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀分析確證，結(jié)果一致。依據(jù)GB 2763—2021《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》進行判定，均未超出標準要求；其余樣品均未檢出，說明云南咖啡果皮農(nóng)藥殘留安全狀況總體良好。

3 結(jié)論

建立了一種同時分析咖啡干果皮中24種農(nóng)藥殘留的固相萃取—氣相色譜/質(zhì)譜方法。該方法各性能參數(shù)經(jīng)驗證均滿足國家標準要求，測定結(jié)果準確、可靠，能夠運用于咖啡果皮中多組分農(nóng)藥殘留的定性和定量分析。當(dāng)選用乙腈—甲苯(V乙腈∶V甲苯=3∶1)作洗脫溶劑、ProElut TPC固相萃取小柱作凈化柱時，凈化和洗脫效均最高，效率為95%。從農(nóng)藥殘留檢出情況看，12批次樣品中，3批次樣品檢出農(nóng)藥殘留，依據(jù)GB 2763—2021《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》判定，均未超出標準要求值，表明咖啡干果皮農(nóng)殘安全性較高。同時，由于此次采集的樣品數(shù)量有限，在農(nóng)殘檢測數(shù)據(jù)充分性上還有待完善，后續(xù)將加大對云南各咖啡主產(chǎn)區(qū)咖啡果皮農(nóng)藥殘留的監(jiān)測力度，以便更加準確、客觀、科學(xué)、全面地評價云南咖啡果皮農(nóng)藥殘留狀況。