基于熒光原位雜交技術(shù)的全自動(dòng)病理染色系統(tǒng)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

林成旭 甘 浪 譚鑫平 李雪梅 閆 旺 李 倩 陳 剛廖廣蘭 劉智勇

1.華中科技大學(xué)機(jī)械科學(xué)與工程學(xué)院，武漢，430000 2.武漢康錄生物技術(shù)股份有限公司，武漢，430000

0 引言

受人口老齡化影響，我國(guó)惡性腫瘤的發(fā)病率不斷上升[1-2]。2022年國(guó)家癌癥中心報(bào)道的最新數(shù)據(jù)顯示，2016年肺癌和乳腺癌分別是我國(guó)男性人群和女性人群中發(fā)病率最高的癌癥，相較于2010年分別提高了約32%和46%[3-4]。在發(fā)病率上升的同時(shí)治愈率也在不斷提高，主要原因在于癌癥診斷相關(guān)技術(shù)的不斷進(jìn)步，人們能夠更早地發(fā)現(xiàn)癌癥病灶，并予以適當(dāng)?shù)闹委焄5]。近年來(lái)分子細(xì)胞遺傳學(xué)發(fā)展迅速，熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技術(shù)是一種在分子水平上檢測(cè)核酸序列的有效方法，并在乳腺癌[6]、淋巴瘤[7]、膀胱癌[8]診斷、治療與研究等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。

FISH實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟在于組織樣本預(yù)處理、雜交及染色，此過(guò)程需要使用多種實(shí)驗(yàn)儀器和試劑，人工實(shí)驗(yàn)操作繁瑣且極易出錯(cuò)[9]。在雜交階段，根據(jù)使用的探針試劑或檢測(cè)需求不同，通常需雜交16 h以上[10-11]，人工開展FISH實(shí)驗(yàn)將大量消耗人力物力資源，檢測(cè)效率受到了極大的限制。隨著自動(dòng)化和智能化技術(shù)的快速發(fā)展，國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究團(tuán)隊(duì)提出了采用自動(dòng)化病理染色系統(tǒng)來(lái)代替人工。國(guó)內(nèi)團(tuán)隊(duì)多是針對(duì)免疫組化技術(shù)研發(fā)染色設(shè)備，如福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司推出的“Titan”、廈門通靈生物醫(yī)藥科技有限公司推出的“Aliya”等，而針對(duì)FISH技術(shù)的自動(dòng)化染色設(shè)備研究尚少。國(guó)外最具代表性的團(tuán)隊(duì)有德國(guó)Leica、美國(guó)BioGenex等，二者推出的自動(dòng)病理染色儀支持包括FISH技術(shù)在內(nèi)的多種染色技術(shù)。但是用戶使用后發(fā)現(xiàn)，前者仍為半自動(dòng)設(shè)備，需手動(dòng)蓋蓋玻片及揭蓋玻片，一定程度上需要人員值守；后者反應(yīng)倉(cāng)底部為非密封結(jié)構(gòu)，在使用過(guò)程中存在反應(yīng)倉(cāng)試劑泄漏、試劑量不準(zhǔn)確等問(wèn)題，導(dǎo)致染色效果不理想。因此，面向FISH技術(shù)的自動(dòng)病理染色系統(tǒng)還存在自動(dòng)化程度不足、功能不完善等問(wèn)題。

本研究以全自動(dòng)病理染色系統(tǒng)的機(jī)械結(jié)構(gòu)為研究對(duì)象，參考手工FISH實(shí)驗(yàn)的基本流程，分析染色過(guò)程所需的基本操作，利用SolidWorks和AutoCAD軟件設(shè)計(jì)染色系統(tǒng)的機(jī)械結(jié)構(gòu)，依托自動(dòng)化控制系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)FISH實(shí)驗(yàn)的全自動(dòng)進(jìn)行。本設(shè)計(jì)解決了上述染色系統(tǒng)存在自動(dòng)化程度不足、染色效果不理想等問(wèn)題，具有工作效率高、功能集成度高、染色質(zhì)量好、發(fā)展?jié)摿Υ蟆⑦m用樣本種類多等優(yōu)點(diǎn)，顯著減輕了人員勞動(dòng)強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)了我國(guó)針對(duì)FISH技術(shù)的全自動(dòng)化染色系統(tǒng)從無(wú)到有的突破，推動(dòng)了FISH實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化和全自動(dòng)化發(fā)展進(jìn)程，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 總體設(shè)計(jì)

1.1 總體布局

設(shè)計(jì)研究的一種全自動(dòng)病理染色系統(tǒng)的機(jī)械結(jié)構(gòu)主要由運(yùn)動(dòng)模塊、夾具模塊、輔助模塊等部分組成。其中，運(yùn)動(dòng)模塊包含多軸操縱臂、試劑加樣器等，夾具模塊包含載玻片夾具、蓋玻片夾具等，輔助模塊包含取樣平臺(tái)、電氣控制柜等。三維結(jié)構(gòu)如圖1所示，取樣平臺(tái)1是承接系統(tǒng)機(jī)械運(yùn)動(dòng)及可供用戶操作的平臺(tái)，取樣平臺(tái)后方的電氣控制柜2中布置了系統(tǒng)控制單元和驅(qū)動(dòng)單元，取樣平臺(tái)上方支承了系統(tǒng)核心工作組件多軸操縱臂3，它主要對(duì)放置在載玻片夾具4中的病理切片進(jìn)行滴樣、蓋蓋玻片和揭蓋玻片等操作，待使用的蓋玻片放置在蓋玻片夾具5中，系統(tǒng)工作過(guò)程中所需的生物試劑主要由試劑加樣器6添加至病理切片上。

1.取樣平臺(tái) 2.電氣控制柜 3.多軸操縱臂 4.載玻片夾具 5.蓋玻片夾具 6.試劑加樣器圖1 總體結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Overall structure diagram

1.2 工作原理

通過(guò)FISH技術(shù)處理病理切片有如下11個(gè)詳細(xì)步驟：烤片、脫蠟、洗滌、通透、水處理、酶消化、脫水、變性、雜交、洗脫和染色，涉及試劑滴加、蓋蓋玻片、揭蓋玻片、載玻片控溫、載玻片干燥等基本操作，本系統(tǒng)需要模擬人工對(duì)病理切片的處理，即需實(shí)現(xiàn)上述基本操作的機(jī)械化和自動(dòng)化。

試劑滴加可分為大量試劑(如酒精、脫蠟劑、洗滌劑)滴加及微量試劑(如通透劑、探針、熒光染料)滴加，大量試劑由蠕動(dòng)泵或氣泵快速噴出，微量試劑由微量注射泵精確滴加；待使用的蓋玻片由蓋玻片夾具夾持，多軸操縱臂中的吸盤軸利用真空吸附原理吸取蓋玻片；載玻片溫度由載玻片夾具中的加熱裝置進(jìn)行控制；載玻片干燥通過(guò)升溫和提高空氣流速來(lái)實(shí)現(xiàn)，將載玻片夾具升溫可提高試劑蒸發(fā)速率，氣泵提供高速氣流排空大部分試劑，殘留的少量試劑由風(fēng)筒吹干。

2 機(jī)械結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

2.1 運(yùn)動(dòng)模塊

2.1.1多軸操縱臂

多軸操縱臂由多個(gè)運(yùn)動(dòng)軸構(gòu)成，是本系統(tǒng)的核心部件，它直接對(duì)病理切片進(jìn)行機(jī)械化和自動(dòng)化的操作，主要完成精確定位病理切片、載玻片吹干、移液槍頭提取、蓋蓋玻片、揭蓋玻片等操作。操縱臂的布局和結(jié)構(gòu)如圖2所示，建立空間笛卡兒坐標(biāo)系，X軸和Y軸為獨(dú)立單軸，Z軸為三復(fù)合軸。自動(dòng)化設(shè)備中常用步進(jìn)電機(jī)作為驅(qū)動(dòng)單元，并搭載同步帶或絲杠螺母實(shí)現(xiàn)圓周運(yùn)動(dòng)向直線運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)化[12-13]。同步帶具有傳動(dòng)承載能力高、噪聲低、振動(dòng)小等優(yōu)點(diǎn)，絲杠螺母具有傳動(dòng)精度高、剛性好、微進(jìn)給性好、結(jié)構(gòu)緊湊等優(yōu)點(diǎn)。X軸和Y軸采用同步帶和直線導(dǎo)軌滑塊的傳動(dòng)形式，在滿足使用工況的情況下減小系統(tǒng)噪聲。Z軸運(yùn)動(dòng)精度要求較高，且Y軸的懸臂結(jié)構(gòu)限制了Z軸的體積和質(zhì)量，因此Z軸采用絲杠螺母的傳動(dòng)形式，在保證傳動(dòng)精度和微量進(jìn)給的情況下提高運(yùn)動(dòng)軸剛性。

圖2 多軸操縱臂3D結(jié)構(gòu)圖Fig. 2 3D structure diagram of multi axis control arm

X軸安裝在取樣平臺(tái)上，帶動(dòng)Y軸和Z軸組件沿X方向定點(diǎn)運(yùn)動(dòng)。該組件除了必要的結(jié)構(gòu)零件外，還承載了若干步進(jìn)電機(jī)、氣泵、注射泵等，整體質(zhì)量較大，在沿X軸運(yùn)動(dòng)的過(guò)程中易發(fā)生繞Y軸的旋轉(zhuǎn)，運(yùn)動(dòng)誤差較大，因此本設(shè)計(jì)使用了雙滑塊的單滑動(dòng)導(dǎo)軌，通過(guò)增加X(jué)軸方向的支撐點(diǎn)來(lái)保證組件運(yùn)動(dòng)的精度和平穩(wěn)性，同時(shí)提高X軸承載能力。此外，在X軸兩端設(shè)計(jì)有行程開關(guān)和橡膠限位塊，可實(shí)現(xiàn)軟件層面和硬件層面的雙重保護(hù)，防止因人為誤觸或機(jī)械故障等因素而導(dǎo)致的X軸超程事故。

Y軸采用懸臂梁結(jié)構(gòu)，盡可能為用戶提供一個(gè)開放的操作空間。Y軸帶動(dòng)Z軸組件定向運(yùn)動(dòng)，為了平衡Y軸正方向上Z軸組件的載荷，在Y軸負(fù)方向一側(cè)設(shè)計(jì)了一個(gè)平臺(tái)，用于放置氣泵、注射泵、平衡塊等零件。Y軸下端設(shè)計(jì)了四個(gè)噴氣口，噴氣口與氣泵相連，用于反應(yīng)結(jié)束后排空載玻片上的試劑。噴氣口軸線與載玻片夾角約為70°，噴出的壓力空氣將形成氣流屏障，氣流屏障為試劑提供沿Y軸負(fù)方向的推動(dòng)力，當(dāng)噴氣口緩慢向Y軸負(fù)方向移動(dòng)時(shí)，試劑將被推至夾具排水口端，從而將試劑排出夾具，如圖3所示。載玻片與夾具之間殘余的試劑(如脫蠟劑、通透劑、蛋白酶、洗滌液等)可通過(guò)多次滴加并浸泡去離子水或無(wú)水乙醇去除，最后對(duì)夾具適當(dāng)升溫將水或無(wú)水乙醇蒸發(fā)即可。

圖3 試劑排空原理示意圖Fig.3 Schematic diagram of reagent emptying principle

Z軸是復(fù)合軸，分為Z1、Z2、Z3三個(gè)運(yùn)動(dòng)軸，具有功能多、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單緊湊、體積較小、運(yùn)動(dòng)精度高等優(yōu)點(diǎn)。Z1軸主要用于提取和丟棄移液槍頭。本設(shè)計(jì)統(tǒng)一采用容積為200 μL的槍頭，在滿足正常吸取試劑的前提下，提高Z軸的緊湊性和通用性。提取裝置具有一定錐度，且略大于槍頭錐度。提取槍頭時(shí)，提取裝置向槍頭 移動(dòng)，槍頭錐面受力發(fā)生微小彈性形變，提取裝置與槍頭之間通過(guò)靜摩擦力鎖緊，同時(shí)摩擦面具有一定的氣密性，以保證后續(xù)順利抽取微量試劑。丟棄槍頭時(shí)，Z1軸移動(dòng)至丟棄裝置中，丟棄裝置的卡槽將槍頭卡緊，提取裝置沿Z軸負(fù)方向移動(dòng)克服靜摩擦力，實(shí)現(xiàn)槍頭的丟棄。Z2軸主要操作蓋玻片，包括抽取蓋玻片、蓋蓋玻片、揭蓋玻片等。Z2軸的軸端固定有橡膠吸盤，通過(guò)吸盤的真空吸附力將蓋玻片吸牢，搭配X軸和Y軸的運(yùn)動(dòng)將蓋玻片送至預(yù)定的位置，然后氣泵對(duì)吸盤充氣釋放蓋玻片，從而完成上述對(duì)蓋玻片的操作。為了防止蓋玻片因水浮作用而漂移，本設(shè)計(jì)的Z2軸可向下移動(dòng)，使得蓋玻片貼近載玻片，從而抑制蓋玻片的漂移。本系統(tǒng)使用兩種規(guī)格蓋玻片(1號(hào)：22 mm×22 mm，2號(hào)：24 mm×50 mm)。1號(hào)蓋玻片主要用于覆蓋探針，探針黏度大且試劑量極少(約10 μL)，蓋玻片幾乎不會(huì)發(fā)生漂移。2號(hào)蓋玻片用于覆蓋樣本區(qū)的通透劑，受反應(yīng)盒尺寸限制，其漂移量不大于2 mm，且因其面積較大，仍能完全覆蓋樣本區(qū)。Z3軸主要對(duì)載玻片夾具進(jìn)行操作，其軸端設(shè)置有彈性壓頭，壓頭作用在載玻片上，提供一個(gè)向下的復(fù)位壓力，防止揭蓋玻片后載玻片被抬起而脫離載玻片夾具的加熱表面，影響后續(xù)步驟的溫度控制。

2.1.2試劑加樣器

試劑加樣器分為微量試劑加樣器和大量試劑加樣器。本設(shè)計(jì)中的微量試劑是指一次噴出量小于200 μL的試劑，大量試劑是指一次噴出量大于1 mL的試劑。

受試劑生產(chǎn)規(guī)格及使用成本的影響，微量試劑加樣誤差需控制在1 μL以內(nèi)，因此，微量試劑加樣器選用最大注射量為200 μL且最小分辨力為0.1 μL的微量注射泵。微量注射泵通過(guò)管路與Z1軸槍頭提取裝置相連，微量試劑瓶統(tǒng)一放置在取樣平臺(tái)上。微量試劑加樣主要步驟為：①Z1軸提取槍頭；②X和Y軸聯(lián)動(dòng)將槍頭移動(dòng)至試劑瓶上方；③Z1軸將槍頭插入微量試劑瓶；④注射泵動(dòng)作吸取定量試劑；⑤Z1軸抬起槍頭；⑥X和Y軸聯(lián)動(dòng)將吸有試劑的槍頭移動(dòng)至加樣區(qū)；⑦注射泵排出試劑完成加樣。微量注射泵使得加樣精準(zhǔn)可控，多軸聯(lián)動(dòng)使得移動(dòng)快速準(zhǔn)確。

大量試劑加樣器有直接泵出式和間接泵出式兩種。直接泵出式由蠕動(dòng)泵提供壓力，直接抽取試劑瓶中的試劑。蠕動(dòng)泵出口通過(guò)管路與多軸操縱臂下端的噴液口相連，噴液口對(duì)準(zhǔn)載玻片上的組織樣本區(qū)，蠕動(dòng)泵旋轉(zhuǎn)即可將試劑噴射到樣本區(qū)，另外在管路中還配置了快速接頭，便于試劑瓶快速拆裝。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，本設(shè)計(jì)共有六組直接泵出式試劑加樣器。

間接泵出式由氣泵提供壓力，間接擠出密閉容器中的試劑，如圖4所示。壓力氣泵通過(guò)進(jìn)氣口向試劑瓶通入一定量的空氣，當(dāng)瓶?jī)?nèi)空氣壓強(qiáng)大于瓶外大氣壓強(qiáng)時(shí)，試劑將通過(guò)出液口被擠出。間接泵出式要求試劑瓶具有良好的裝配性和氣密性。本設(shè)計(jì)在試劑瓶口對(duì)稱設(shè)置了兩個(gè)楔形凸起，相對(duì)應(yīng)地在瓶蓋上設(shè)置了兩個(gè)楔形滑槽，試劑瓶在滑槽內(nèi)逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)30°～60°即可完成裝配，沿相反方向轉(zhuǎn)動(dòng)即可完成拆卸，拆裝簡(jiǎn)單便捷。氣密性由密封圈來(lái)保證，瓶蓋內(nèi)襯一個(gè)特制的環(huán)形橡膠密封圈，密封圈的內(nèi)側(cè)面與試劑瓶口外壁相匹配，以實(shí)現(xiàn)試劑瓶口的側(cè)面密封。相比于頂面密封的方式，側(cè)面密封一方面可以防止因3D打印端面不平而造成的密封不良問(wèn)題，另一方面可以減小楔形凸起與滑槽間的摩擦力，減少零件磨損，延長(zhǎng)使用壽命。

(a)加樣原理 (b)剖面結(jié)構(gòu)圖4 間接泵出式試劑加樣器結(jié)構(gòu)示意圖Fig.4 Structure diagram of indirect pump outreagent sampler

2.2 夾具模塊

2.2.1載玻片夾具

為了便于自動(dòng)化處理病理切片，載玻片在本系統(tǒng)中應(yīng)具有唯一且確定的位置，可通過(guò)設(shè)計(jì)載玻片夾具來(lái)實(shí)現(xiàn)。載玻片夾具是對(duì)病理切片定位并夾緊的機(jī)構(gòu)，本系統(tǒng)設(shè)置了12個(gè)載玻片夾具(即12個(gè)工位)。載玻片夾具為獨(dú)立結(jié)構(gòu)，各工位之間互不干擾，具有溫度可控、無(wú)試劑泄漏和操作方便等優(yōu)點(diǎn)，主要由夾緊頭、反應(yīng)盒及發(fā)熱片等構(gòu)成，如圖5a所示。

反應(yīng)盒是載玻片夾具的主體，是本系統(tǒng)發(fā)生生物反應(yīng)的主要場(chǎng)所。反應(yīng)盒由銅合金或航空鋁合金等具有良好導(dǎo)熱性能的材料機(jī)加工而成，其表面涂鍍一層聚四氟乙烯，以提高反應(yīng)盒的耐腐蝕性，同時(shí)保證其良好的導(dǎo)熱性。反應(yīng)盒底部貼有電阻或半導(dǎo)體發(fā)熱片，用于達(dá)到不同反應(yīng)步驟所需的溫度條件，其控溫精度為0.1 ℃。反應(yīng)盒底部完全密封，無(wú)試劑泄漏問(wèn)題，能長(zhǎng)時(shí)間保存反應(yīng)試劑，保證反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行。病理切片放置在反應(yīng)盒內(nèi)，它在X方向和Y方向上的位置精度應(yīng)小于0.5 mm，通過(guò)控制反應(yīng)盒內(nèi)側(cè)特征尺寸的精度即可保證。

(a)3D示意圖

夾緊頭用于病理切片的夾緊，圖5b為夾緊頭結(jié)構(gòu)示意圖。夾緊頭基體上開有通孔，夾緊按鍵可在其內(nèi)上下滑動(dòng)，按鍵上端通過(guò)復(fù)位彈簧與基體相連。夾緊按鍵外部開有環(huán)形槽，基體側(cè)面開有水平槽，環(huán)形槽與解鎖按鍵的頭部相匹配，解鎖按鍵可在基體水平槽內(nèi)滑動(dòng)。夾緊按鍵內(nèi)部開有階梯孔，壓頭可在其內(nèi)上下滑動(dòng)。壓頭下端壓裝了壓片，二者之間為過(guò)盈配合，壓片可以減小壓強(qiáng)且防止復(fù)位時(shí)按鍵飛出。壓片與病理切片直接接觸，傳遞夾緊力。壓頭上端通過(guò)夾緊彈簧與堵頭相連，調(diào)節(jié)堵頭旋入的深度即可調(diào)節(jié)夾緊力。當(dāng)夾緊按鍵被按下時(shí)，解鎖按鍵在壓縮彈簧的作用下卡入滑槽內(nèi)，限制夾緊按鍵復(fù)位，復(fù)位彈簧和夾緊彈簧均被壓縮，達(dá)到夾緊的目的。當(dāng)解鎖按鍵按下時(shí)，頭部移出滑槽，夾緊按鍵在復(fù)位彈簧和夾緊彈簧的作用下向上彈起，達(dá)到松開的目的。本設(shè)計(jì)為一鍵夾緊及一鍵松開結(jié)構(gòu)，操作方便快捷。夾緊力由壓縮彈簧提供，恒定且可調(diào)。

2.2.2蓋玻片夾具

蓋玻片的定位和夾緊通過(guò)蓋玻片夾具來(lái)實(shí)現(xiàn)，兩種規(guī)格的蓋玻片所使用的夾具結(jié)構(gòu)相同，僅尺寸不同，夾具結(jié)構(gòu)如圖6所示。夾具體通過(guò)底部螺釘與取樣平臺(tái)相連，具有確定的位置。夾具體底部開有導(dǎo)向孔，推桿可在孔中上下移動(dòng)。推桿上端連接推板，蓋玻片被整齊地碼放在推板上，在彈簧的作用下，推板產(chǎn)生一個(gè)向上的推力，使得最上方的蓋玻片始終貼緊頂部限位塊，保證抽取蓋玻片的位置一致。頂部限位塊在靠近抽片方向開有一窄縫，控制窄縫寬度，使得最多允許一片蓋玻片通過(guò)。抽片時(shí)吸盤吸緊最上方的蓋玻片，吸盤移動(dòng)時(shí)蓋玻片與窄縫會(huì)產(chǎn)生相互作用，分離多余蓋玻片，并抽取出一片蓋玻片。蓋玻片極薄(0.19～0.23 mm)，而系統(tǒng)工作腔內(nèi)濕度往往大于70% RH(相對(duì)濕度)，普通蓋玻片放置在夾具內(nèi)極易發(fā)生吸潮粘連。蓋玻片粘連后，在通過(guò)窄縫時(shí)往往會(huì)發(fā)生蓋玻片與吸盤滑移、一次抽取兩張蓋玻片、蓋玻片無(wú)法通過(guò)、蓋玻片碎裂等異常情況，從而導(dǎo)致抽取失敗。本設(shè)計(jì)采用了一種表面帶涂層的防粘蓋玻片，其表面涂覆了疏水材料，在工作腔內(nèi)幾乎不發(fā)生粘連，抽片成功率大于99%。本蓋玻片夾具具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、抽片成功率高、操作方便等優(yōu)點(diǎn)。

圖6 蓋玻片夾具結(jié)構(gòu)示意圖Fig.6 Structural diagram of cover glass holder

在通透、變性、雜交等反應(yīng)過(guò)程中，需使用微量試劑，且需要加熱病理切片。升高溫度會(huì)加速試劑水分蒸發(fā)，使得試劑濃度發(fā)生較大變化，甚至出現(xiàn)病理切片烤干的現(xiàn)象，從而影響反應(yīng)正常進(jìn)行，導(dǎo)致最終處理效果不佳。因此，在上述過(guò)程中需要在樣本區(qū)蓋上蓋玻片，減少水分蒸發(fā)。在通透過(guò)程中，反應(yīng)所需溫度高(高于80 ℃)，需進(jìn)一步采用礦物油密封，在滴加完通透劑后Z1軸更換槍頭并吸取120 μL礦物油，沿載玻片外側(cè)白色方框繪制連續(xù)油路，隨后采用2號(hào)蓋玻片覆蓋，實(shí)現(xiàn)密封樣本，維持反應(yīng)正常進(jìn)行。而對(duì)于大量試劑(如乙醇、脫蠟劑等)，其用量大且反應(yīng)時(shí)間短，故不需要蓋玻片密封。

2.3 輔助模塊

取樣平臺(tái)是輔助模塊的主要部件，它主要起到存儲(chǔ)和連接的作用。取樣平臺(tái)上存放了待處理的病理切片、染色過(guò)程所需的移液槍頭、蓋玻片及微量試劑等，連接了多軸操縱臂、電氣控制柜等，因此在臺(tái)面上對(duì)應(yīng)留有相應(yīng)的安裝位置和連接法蘭。染色過(guò)程中，為防止試劑交叉污染，使用過(guò)的移液槍頭及蓋玻片需及時(shí)丟棄，因此在取樣平臺(tái)上分別設(shè)計(jì)有對(duì)應(yīng)的丟棄孔位，實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的廢液經(jīng)平臺(tái)右側(cè)的廢液孔流至廢液桶內(nèi)，并在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后分類處置。

電氣控制柜主要用于電能分配和電路保護(hù)。電氣控制柜中主要包括加熱控制箱、系統(tǒng)控制板、電機(jī)驅(qū)動(dòng)器、信號(hào)處理單元和電源適配器等。加熱控制箱實(shí)現(xiàn)對(duì)12個(gè)載玻片夾具獨(dú)立控溫。系統(tǒng)控制板實(shí)現(xiàn)對(duì)系統(tǒng)工作流程的邏輯控制。電機(jī)驅(qū)動(dòng)器用于對(duì)系統(tǒng)使用的各軸電機(jī)、真空泵和蠕動(dòng)泵等進(jìn)行運(yùn)動(dòng)控制。信號(hào)處理單元用于讀取系統(tǒng)傳感器輸出的信號(hào)并做出相應(yīng)的預(yù)處理。電源適配器用于變換及穩(wěn)定電壓并為整個(gè)系統(tǒng)供電，除此之外還配備了短路、過(guò)載等保護(hù)模塊。根據(jù)各模塊的電氣連接屬性，合理布局電氣控制柜，設(shè)計(jì)了相關(guān)的安裝及連接結(jié)構(gòu)。

3 系統(tǒng)測(cè)試

通過(guò)機(jī)械加工、3D打印技術(shù)等制作機(jī)械結(jié)構(gòu)零件，同時(shí)引進(jìn)部分自動(dòng)化零部件，結(jié)合自動(dòng)控制技術(shù)，裝配及調(diào)試各功能模塊，得到圖7所示的全自動(dòng)病理染色系統(tǒng)樣機(jī)。對(duì)系統(tǒng)的多軸操縱功能、試劑加樣功能、夾持定位功能等進(jìn)行測(cè)試。多軸操縱臂能夠準(zhǔn)確定位操作對(duì)象，定位誤差不大于±0.1 mm；Y軸氣嘴往復(fù)運(yùn)動(dòng)2次即可排空載玻片殘余試劑，5 min內(nèi)即可烘干載玻片；Z1軸能準(zhǔn)確提取及丟棄移液槍頭，準(zhǔn)確率大于99.5%；Z2軸抽取蓋玻片成功率大于99%，并能完成蓋蓋玻片和揭蓋玻片的動(dòng)作。試劑加樣器能夠準(zhǔn)確響應(yīng)所需的試劑類型，微量試劑加樣誤差不大于0.6 μL，大量試劑加樣誤差不大于0.5 mL。載玻片夾具操作便捷，最大控溫110 ℃且控溫誤差不大于±1 ℃。測(cè)試結(jié)果表明，本系統(tǒng)的各模塊均可正常工作，系統(tǒng)功能滿足設(shè)計(jì)需求，能夠全自動(dòng)完成FISH實(shí)驗(yàn)的基本操作。

圖7 全自動(dòng)病理染色系統(tǒng)樣機(jī)Fig.7 Prototype of automatic pathologicalstaining system

利用本系統(tǒng)開展FISH實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的實(shí)驗(yàn)流程和參數(shù)優(yōu)化，本系統(tǒng)能夠得到良好的染色效果，在熒光顯微鏡下可判讀率超過(guò)90%。選用合適的組織樣本和生物試劑(如通透劑、蛋白酶、快速探針等)，實(shí)驗(yàn)所需試劑均由武漢康錄生物技術(shù)股份有限公司提供。在表1所示條件下完成FISH實(shí)驗(yàn)，使用100倍熒光顯微鏡得到圖8所示的結(jié)果，可以看出，本系統(tǒng)處理的病理切片熒光圖像對(duì)比度高、信號(hào)點(diǎn)清晰可見、酶消化程度良好、熒光染色均勻，滿足病理判讀要求。

表1 關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)步驟及其條件

(a)紅色熒光圖 (b)綠色熒光圖

將本系統(tǒng)與現(xiàn)有自動(dòng)化染色系統(tǒng)的部分功能進(jìn)行比較，如表2所示，可以看出，本系統(tǒng)在機(jī)械尺寸、反應(yīng)倉(cāng)溫度控制范圍、試劑保持效果和自動(dòng)化程度上有明顯優(yōu)勢(shì)。除此之外，本系統(tǒng)還能對(duì)細(xì)胞和尿液樣本進(jìn)行染色，更換控制程序及對(duì)應(yīng)試劑等參數(shù)后亦可用于免疫組化實(shí)驗(yàn)。

表2 本系統(tǒng)與現(xiàn)有染色系統(tǒng)功能對(duì)比

4 結(jié)語(yǔ)

本研究針對(duì)現(xiàn)有染色系統(tǒng)存在的不足，參考人工熒光原位雜交(FISH)實(shí)驗(yàn)的操作過(guò)程，設(shè)計(jì)優(yōu)化了相關(guān)的機(jī)械化操作結(jié)構(gòu)：首先，設(shè)計(jì)了機(jī)械運(yùn)動(dòng)模塊，模擬人工實(shí)驗(yàn)的相關(guān)動(dòng)作，可實(shí)現(xiàn)試劑滴加、蓋蓋玻片、揭蓋玻片等功能；其次，設(shè)計(jì)了夾具模塊，可實(shí)現(xiàn)載玻片和蓋玻片準(zhǔn)確定位、載玻片控溫及干燥、分離蓋玻片等功能；最后，設(shè)計(jì)了輔助模塊，可實(shí)現(xiàn)物品存儲(chǔ)、模塊連接、控制系統(tǒng)保護(hù)等功能。裝配并調(diào)試優(yōu)化各功能模塊，搭載自動(dòng)控制系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了FISH實(shí)驗(yàn)的全自動(dòng)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本系統(tǒng)滴樣誤差小于1 μL、定位誤差不大于±0.1 mm、載玻片溫度控制誤差不大于±1 ℃、抽取蓋玻片成功率大于99%、無(wú)試劑泄漏，可實(shí)現(xiàn)高效全自動(dòng)病理切片處理，無(wú)需人工干預(yù)，最終染色效果良好，可判讀率大于90%，臨床應(yīng)用和市場(chǎng)發(fā)展?jié)摿Υ蟆?/p>