基于頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜和主成分分析法研究不同發(fā)酵原料對草莓酒香氣成分的影響

李濤，周穎，張軍，楊梅，馮翰杰，張順屹，杜晴云

(天津農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津，300392)

草莓是薔薇科多年生草本植物，果實呈鮮紅色，香氣濃郁，富含維生素、花色苷和酚類物質(zhì)，具有防便秘、抗氧化及預(yù)防心腦血管疾病等功效，被譽(yù)為“水果皇后”[1-2]。果酒是以水果為原料，經(jīng)調(diào)整成分，酒精發(fā)酵等工藝釀制而成，其營養(yǎng)豐富、色澤誘人，適量飲用有助于身體健康[3]。以草莓為原料釀造的草莓果酒，既可以豐富果酒市場，提高草莓的利用率和附加值，也可以解決草莓不耐儲藏、貨架期短等問題。目前國外關(guān)于草莓酒的研究少有報道，而國內(nèi)對草莓酒的研究主要集中在釀造工藝的優(yōu)化[4]和酵母菌種的篩選[5]等方面。跟葡萄酒相比，草莓酒的發(fā)酵工藝還不成熟，市面上草莓酒的種類較少。不同發(fā)酵工藝對果酒的香氣品質(zhì)有很大的影響。周雪艷等[6]發(fā)現(xiàn)不同發(fā)酵方式(清汁發(fā)酵、濁汁發(fā)酵、帶渣發(fā)酵、加酶帶渣發(fā)酵)對鴨梨酒的香氣成分種類及其含量具有顯著影響，青汁發(fā)酵的鴨梨酒品質(zhì)更優(yōu)。傅力等[7]以賽買提杏為原料，采用杏汁和杏漿2種不同發(fā)酵方式進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果表明杏汁發(fā)酵的杏酒酒體柔和豐滿，感官品質(zhì)較好，而杏漿發(fā)酵的酒口感較粗糙。

頂空固相微萃取(head space solid-phase micro-extraction，HS-SPME)技術(shù)作為樣品前處理方法，具有操作簡單、高效、成本低等優(yōu)點(diǎn)[8]，該技術(shù)常與GC-MS聯(lián)用，用于快速分析物質(zhì)中的揮發(fā)性成分，目前在生命科學(xué)、食品、藥品、化工、香精油等方面具有廣泛應(yīng)用[9]。香氣是評價果酒感官品質(zhì)的重要指標(biāo)，決定著產(chǎn)品的風(fēng)格與典型性，其受原料品種、發(fā)酵方式、酵母種類、澄清工藝、儲藏條件等因素影響[10]。葉文斌等[11]采用HS-SPME-GC-MS對東方草莓酒揮發(fā)性香味成分進(jìn)行分離和鑒定,共鑒定出32種香氣物質(zhì)，其中異戊醇、2-甲基丙醇、正丙醇、乙縮醛二乙醇、乳酸乙酯、乙酸乙酯等物質(zhì)為草莓酒的主要香氣成分。時寬芹[12]通過HS-SPME-GC-MS方法分析了法蘭地草莓酒的揮發(fā)性成分及含量，樣品中共檢測出78種香氣物質(zhì)，其中酯類和醇類含量最多，乙酸異戊酯、乙酸己酯、辛酸乙酯和乙醛的氣味活性值較高，對草莓酒風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)。

本研究以紅顏草莓為原料，采用HS-SPME-GC-MS和主成分分析方法對草莓汁及草莓酒進(jìn)行香氣成分分析，研究2種不同發(fā)酵原料(去梗草莓和帶梗草莓)對草莓酒基本理化指標(biāo)、香氣成分和感官特性的影響，以期為進(jìn)一步研究草莓酒的工藝優(yōu)化及香氣成分分析提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草莓，2021年4月中旬采于北京欣寶萊科技有限公司，總糖質(zhì)量濃度為108 g/L，總酸質(zhì)量濃度為6.25 g/L(以酒石酸計)，挑選成熟度好、無污染無破損的新鮮紅顏品種草莓為原料。

果膠酶(食品級)、DL-酒石酸，河南萬邦實業(yè)有限公司；F15酵母、焦亞硫酸鉀(食品級)，法國Laffort公司；白砂糖，北京糖業(yè)煙酒集團(tuán)有限公司；福林-酚試劑，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；2-辛醇(色譜純)，上海泰坦科技股份有限公司；NaCl、NaOH、HCl、葡萄糖等試劑均為國產(chǎn)分析純，上海國藥集團(tuán)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-7890氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫科技有限公司；HH系列數(shù)顯型恒溫水浴鍋，江蘇科研儀器有限公司；HPX-250生化培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；雷磁pHS-25型pH計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；電子天平，天津天馬衡基儀器有限公司；L4紫外可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；手動破碎機(jī)，宜仟家釀酒設(shè)備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 發(fā)酵工藝流程及操作要點(diǎn)

草莓→清洗→輕度破碎→草莓果漿→調(diào)整成分→接種酵母→酒精發(fā)酵→皮渣分離→清汁發(fā)酵→結(jié)束發(fā)酵→倒灌澄清→除菌過濾→裝瓶→測定指標(biāo)

草莓果漿的制備：挑選成熟度好、無污染無破損的新鮮草莓，清水沖洗，去梗發(fā)酵先去除草莓果梗及萼片，帶梗發(fā)酵直接破碎入罐，得到草莓果漿。

調(diào)整成分：添加100 mg/L焦亞硫酸鉀防止氧化，30 min后加入40 mg/L果膠酶，用白砂糖調(diào)整總糖質(zhì)量濃度為200 g/L，酒石酸調(diào)整總酸質(zhì)量濃度為7.5 g/L(以酒石酸計)。

接種酵母：酵母的接種量為0.2 g/L。將稱量好的酵母按料液比1∶10(g∶mL)加入蒸餾水，在37 ℃恒溫水浴鍋中活化25 min，然后倒入發(fā)酵罐中攪拌均勻。

酒精發(fā)酵：發(fā)酵溫度為18 ℃，每隔24 h測一次溫度和比重(相對密度)，當(dāng)果肉接近無色時，皮渣分離。

清汁發(fā)酵：分離完皮渣的草莓清汁繼續(xù)酒精發(fā)酵，當(dāng)連續(xù)2次比重不再變化時，發(fā)酵結(jié)束。

倒罐澄清：倒罐，去除酒泥，加入100 mg/L焦亞硫酸鉀終止發(fā)酵，4 ℃條件下自然澄清，1個月后過濾裝瓶。

1.3.2 基本理化指標(biāo)的測定

總酸(以酒石酸計)采用指示劑法測定；揮發(fā)酸(以乙酸計)采用滴定法測定；pH值采用pH計測定；游離及總SO2采用直接碘量法測定；還原糖(以葡萄糖計)采用斐林試劑法測定；乙醇體積分?jǐn)?shù)采用密度瓶法測定；總酚采用福林酚比色法測定[13]。所有指標(biāo)均重復(fù)測定3次。

1.3.3 揮發(fā)性香氣成分的測定[14]

香氣成分萃?。悍謩e吸取10 mL酒樣放于20 mL頂空瓶中，加入2 g NaCl(可促進(jìn)揮發(fā)性香氣成分揮發(fā))和10 μL 2-辛醇內(nèi)標(biāo)(質(zhì)量濃度為500 μg/L)，置于恒溫磁力攪拌加熱平臺上，45 ℃預(yù)熱10 min。待頂空瓶中樣品香氣達(dá)到飽和之后，將萃取頭伸入頂空瓶中，45 ℃吸附40 min后拔出，插入氣相色譜進(jìn)樣口，230 ℃熱解析3 min。最后進(jìn)行數(shù)據(jù)采集分析。

色譜條件：色譜柱為DB-WAX毛細(xì)管色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣He(純度為99.999%)，流速為1 mL/min；手動進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度230 ℃；升溫程序：起始柱溫35 ℃(保持3 min)，以6 ℃/min升溫至150 ℃(保持1 min)，再以12 ℃/min升溫至230 ℃(保持3 min)。

質(zhì)譜條件：電子電離源(electron ionization,EI)，電子能量70 eV；掃描范圍m/z20～550；離子源溫度230 ℃；接口溫度230 ℃。

草莓汁揮發(fā)性香氣成分的測定方法同草莓酒。

1.3.4 香氣成分分析[15]

定性：通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)和計算機(jī)譜庫(NIST/Wiley)檢索，對GC-MS分析得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行定性(匹配度>800，最大值為1 000)。

定量：采用半定量法，以2-辛醇(質(zhì)量濃度為500 μg/L)作為內(nèi)標(biāo)物，對草莓酒和草莓汁樣品中各香氣成分進(jìn)行定量，計算如公式(1)所示：

(1)

式中：ρX，各香氣物質(zhì)的質(zhì)量濃度，μg/L；A，酒樣中測得香氣物質(zhì)的峰面積；ρ，2-辛醇的質(zhì)量濃度，μg/L；A0，2-辛醇的峰面積。

1.3.5 感官評價

在標(biāo)準(zhǔn)品嘗室中，由7名經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的品嘗員組成感官分析品嘗小組，參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》對草莓酒進(jìn)行感官分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 26.0進(jìn)行顯著性和主成分分析，Excel 2021和Origin 2021進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵原料對草莓酒理化指標(biāo)的影響

由表1可知，2種不同原料釀造的草莓酒還原糖質(zhì)量濃度均小于4 g/L，按照GB/T 15037—2006《葡萄酒》理化指標(biāo)規(guī)定，屬于干型果酒。酒樣中總酸質(zhì)量濃度均大于8 g/L，pH在3.4～3.6，帶梗發(fā)酵草莓酒中總酸含量較高，pH值較低，可能是由發(fā)酵過程中草莓果梗及萼片中的酸類物質(zhì)釋放到酒中所致。起始糖度一樣，而帶梗發(fā)酵草莓酒中的酒精體積分?jǐn)?shù)顯著高于去梗發(fā)酵草莓酒，可能是果梗的加入提高了乙醇的轉(zhuǎn)化率所致。從總酚質(zhì)量濃度來看，帶梗發(fā)酵草莓酒中含量較高，為(272.5±0.01)mg/L，是去梗發(fā)酵草莓酒的1.34倍，據(jù)報道，酚類物質(zhì)主要存在于果梗、果皮和種子中，隨著酒精發(fā)酵的進(jìn)行會進(jìn)入果酒中，賦予果酒收斂感和苦澀味[16]。乙酸對果酒風(fēng)味品質(zhì)的影響是負(fù)面的，研究發(fā)現(xiàn)，乙酸質(zhì)量濃度在200～700 mg/L較為適宜，而高于700 mg/L時，會使果酒產(chǎn)生酸敗感和溶劑味[17]。如表1所示，2種草莓酒中揮發(fā)酸質(zhì)量濃度(以乙酸計)均小于1.2 g/L，符合國標(biāo)GB/T 15037—2006《葡萄酒》要求，總SO2含量和游離SO2含量也符合GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》限量要求。

表1 草莓酒的理化指標(biāo)Table 1 Physicochemical indexes of strawberry wines

2.2 發(fā)酵原料對草莓酒香氣成分的影響

香氣是評價果酒品質(zhì)的重要指標(biāo)[10]，實驗采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)，對草莓汁及2種草莓酒進(jìn)行揮發(fā)性香氣成分測定，結(jié)果如表2所示，草莓酒中共檢測出40種香氣物質(zhì)，包括醇類7種、酯類18種、酸類3種、醛酮類1種、萜烯類8種、烷類2種和其他類1種，占香氣總量的42.43%、49.57%、0.51%、0.28%、5.14%、1.48%和0.59%，其中酯類物質(zhì)種類最多，含量最高。

2種不同原料釀造的草莓酒樣品中，分別檢測出35種和29種香氣物質(zhì)，占酒樣香氣總量的62.32%和37.68%，可見去梗發(fā)酵草莓酒中無論是香氣種類還是香氣總量均高于帶梗發(fā)酵草莓酒。

表2 草莓汁及草莓酒香氣化合物的組成及含量Table 2 Composition and content of aroma compounds in strawberry juice and strawberry wines

醇類物質(zhì)是構(gòu)成果酒酒味特征的基本香氣化合物，能賦予果酒復(fù)雜感，醇類物質(zhì)一部分來源于果實自身無氧代謝，另一部分來源于酵母菌酒精發(fā)酵過程中氨基酸代謝或糖代謝[18-20]。由表2可知，草莓酒樣品中共檢測出7種醇類物質(zhì)，有4種為共有物質(zhì)。醇類物質(zhì)在帶梗發(fā)酵草莓酒中含量最高，為68.80%，是其主要香氣成分。其中異戊醇是草莓酒中含量最高的醇類物質(zhì)，賦予草莓酒白蘭地香氣或辛辣味，特別是在帶梗發(fā)酵草莓酒中，含量達(dá)到了63.12%，研究報道，異戊醇含量過高對果酒的風(fēng)味會產(chǎn)生不良影響[21]。此外，苯乙醇、2-戊醇在酒樣中均檢出，它們賦予草莓酒玫瑰香、花香和蜜香[8]。酒樣中的正己醇主要來源于草莓果實，在草莓汁樣品中也被檢出，賦予酒體青草味[21]。

酯類物質(zhì)是構(gòu)成果酒的重要香氣物質(zhì)，主要產(chǎn)生于酒精發(fā)酵，能賦予果酒濃郁的花香和果香[22]。由表2可知，2種酒樣中分別檢測出17種和12種酯類物質(zhì)，有11種為草莓酒中共有，其中去梗發(fā)酵草莓酒中酯類物質(zhì)含量最高，為65.35%，而帶梗發(fā)酵草莓酒中僅占23.47%，酯類物質(zhì)是去梗發(fā)酵草莓酒中的主要香氣物質(zhì)。辛酸乙酯、癸酸乙酯、正己酸乙酯、丁酸乙酯和肉桂酸乙酯在2種酒樣中均檢出，且含量均較高，賦予草莓酒青蘋果、草莓、菠蘿、梨、花香、果香和脂肪味[23]，其中肉桂酸乙酯和丁酸乙酯主要來源于草莓果實，在草莓汁中均檢出。乙酸己酯、丁酸芳樟酯、乙酸苯乙酯、5-甲基-壬酸乙酯、癸酸異戊酯和十四酸乙酯僅在去梗發(fā)酵草莓酒樣品中檢出，是該樣品的特有香氣成分，賦予酒體梨、櫻桃、香蕉等清甜水果香[8,21]。

萜烯類物質(zhì)是一系列萜類化合物的總稱，廣泛存在于植物體內(nèi)，具有濃郁的水果香和花香,是水果香氣成分中的主要貢獻(xiàn)者[24]。如表2所示，萜烯類物質(zhì)在草莓汁樣品中含量最高，為32.61%，而在去梗和帶梗發(fā)酵草莓酒中含量較低，僅為5.73%和4.15%，萜烯類化合物是草莓汁中的主要香氣物質(zhì)。其中苯乙烯和(+)-α-松油醇僅在去梗發(fā)酵草莓酒中檢出，是其特有成分，順-α-紅沒藥烯和α-松油醇是帶梗發(fā)酵草莓酒中的特有成分，賦予了草莓酒丁香香氣。芳樟醇、(Z,E)-A-法尼烯、(E)-β-金合歡烯和紅沒藥醇在2種草莓酒樣品中均檢出，這些物質(zhì)主要來自于草莓果實，賦予草莓酒花香和薰衣草香[21]。

除此之外，2種酒樣中還檢測到酸類、醛酮類、烷類和其他類揮發(fā)性香氣物質(zhì)，這些揮發(fā)性物質(zhì)在草莓酒樣品中含量較低，對草莓酒的香氣起著重要的補(bǔ)充和修飾作用[25]，如圖1所示。

圖1 各類香氣物質(zhì)的總量Fig.1 The total amount of various aromatic substances

2.3 主成分分析

按照主成分選取標(biāo)準(zhǔn)，通常把累計貢獻(xiàn)率超過85%的主成分提取出來，如表3所示，3個樣品中共提取了2個主成分，其中第1主成分貢獻(xiàn)率為70.47%，第2主成分貢獻(xiàn)率為29.53%，二者累計方差貢獻(xiàn)率為100%，可以解釋原變量所有的變異信息[21]。

表3 主成分分析中解釋的總方差Table 3 The total variance explained in PCA

如表4所示，3種樣品中因子載荷量>0.750的物質(zhì)共有63種。第1主成分有41種，其中31種物質(zhì)來自草莓汁樣品，而在去梗和帶梗發(fā)酵草莓酒中只有19種和18種，芳樟醇和異戊醇為主成分1的主要香氣物質(zhì)，芳樟醇在草莓汁樣品中含量最高，為15.57%，異戊醇在帶梗發(fā)酵草莓酒中含量最高，為63.12%，且未在草莓汁樣品中檢出；第2主成分有22種，有16種物質(zhì)來自去梗發(fā)酵草莓酒中，11種物質(zhì)來自帶梗發(fā)酵草莓酒中，而草莓汁樣品中只有7種，辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯和乙酸異戊酯為主成分2的主要香氣成分，在去梗發(fā)酵草莓酒中含量最高，為49.12%，而在帶梗發(fā)酵草莓酒中只占5.86%，且未在草莓汁樣品中檢出。由此可以推出，第1主成分主要由草莓香和醇香共同組成，第2主成分主要為發(fā)酵香，其主成分的分布見圖2。

表4 成分矩陣Table 4 Component matrix

從圖2可以看出，3種樣品得到了較好的區(qū)分，草莓汁主要分布于主成分1的正半軸，去梗發(fā)酵草莓酒主要分布于主成分2的正半軸，帶梗發(fā)酵草莓酒主要分布于主成分1和主成分2的負(fù)半軸。具體來說，草莓汁位于第一象限，與芳樟醇、紅沒藥醇、正己醇、肉桂酸乙酯、己酸甲酯、乙二醇二丁酸酯、丁酸甲酯、乙酸己酯靠近，是草莓汁的主要香氣成分，具有甜橙、梨、香蕉、葡萄、玫瑰花、紫丁香等香氣。去梗發(fā)酵草莓酒位于第二象限，與辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙酸異戊酯、正己酸乙酯靠近，辛酸乙酯具有菠蘿、梨和花香[23]，癸酸乙酯和月桂酸乙酯具有花香、果香和脂肪香味，正己酸乙酯、乙酸苯乙酯和乙酸異戊酯具有水果香、玫瑰和茉莉花香[26]。帶梗發(fā)酵草莓酒位于第三象限，與異戊醇、苯乙醇、α-松油醇靠近，它們給酒體帶來雜醇、苦杏仁和辛辣味。

圖2 草莓汁及草莓酒香氣化合物主成分樣品 分布圖和因子載荷圖Fig.2 PCA distribution and loading plot of aroma components in strawberry juice and strawberry wines

2.4 感官評價

由表5可知，去梗發(fā)酵草莓酒感官評分最高，為(88.62±1.37)分，口感和香氣均優(yōu)于帶梗發(fā)酵草莓酒。在外觀方面，跟草莓汁相比，2種草莓酒的顏色均變淺，去梗發(fā)酵草莓酒酒體澄清透亮有光澤，而帶梗發(fā)酵草莓酒酒體澄清但沒有光澤。在口感方面，去梗發(fā)酵草莓酒酒體輕盈、口感清爽、酸澀適中、結(jié)構(gòu)感強(qiáng)，而帶梗發(fā)酵草莓酒總酸和酚類物質(zhì)含量較高，酒體飽滿、口感略粗糙、生青感較重、有苦澀味。研究發(fā)現(xiàn)，總酸賦予果酒骨架感和結(jié)構(gòu)感，一般酸度為6.5～8.5 g/L時最為適宜，當(dāng)酸度>8.5 g/L時，果酒會產(chǎn)生苦澀味，而<6.5 g/L時，口感較淡、酒體較薄[27-28]。在香氣方面，去梗發(fā)酵草莓酒果香細(xì)膩優(yōu)雅，草莓香氣突出，具有較好的典型性，而帶梗發(fā)酵草莓酒醇香濃郁，草莓香氣明顯，花香和果香較為平淡。

表5 草莓酒的感官評分Table 5 Sensory scores of strawberry wines

3 結(jié)論

本實驗對2種不同原料釀造的草莓酒進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩者理化指標(biāo)、香氣成分和感官品質(zhì)有顯著影響。2種草莓酒的理化指標(biāo)均符合國標(biāo)要求，帶梗發(fā)酵草莓酒中的總酸和總酚含量較高且差異顯著。草莓酒中共檢測出40種香氣化合物，其中共有成分24種，酯類物質(zhì)在去梗發(fā)酵草莓酒中含量最高，為65.35%，是其主要香氣成分；醇類物質(zhì)在帶梗發(fā)酵草莓酒中含量最高，為68.80%，是其主要香氣成分。為了更準(zhǔn)確地確定草莓酒中的關(guān)鍵香氣化合物，有必要采用外標(biāo)法對草莓酒的香氣成分進(jìn)行準(zhǔn)確定量，計算氣味活度值，并結(jié)合氣相色譜-嗅味計或電子鼻等氣味分析儀進(jìn)一步論證。主成分分析表明，2種不同原料釀造的草莓酒香氣風(fēng)格差異區(qū)分明顯，辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸異戊酯和正己酸乙酯是去梗發(fā)酵草莓酒的主要香氣成分；異戊醇和苯乙醇是帶梗發(fā)酵草莓酒的主要香氣成分。去梗發(fā)酵草莓酒，酯類物質(zhì)含量較高，以草莓香和果香為主，酒體輕盈、口感清爽，而帶梗發(fā)酵草莓酒，總酸和總酚含量較高，香氣復(fù)雜、酒體略粗糙、有苦澀味。在相同的發(fā)酵條件下，去梗發(fā)酵更加適合高品質(zhì)草莓酒的釀造。