凡納濱對(duì)蝦幾丁質(zhì)酶的活性分布及其短波紫外線照射激活作用

竇碧靜，潘燕平，JULIETH Majura，韓梅，曹文紅,2* ，陳忠琴,2， 鄭惠娜,2，高加龍,2

1(廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院，國(guó)家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心(湛江)，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東省海洋生物制品工程實(shí)驗(yàn)室，廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心，水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 湛江，524088)2(大連工業(yè)大學(xué) 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連，116034)

凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)是世界上養(yǎng)殖最廣泛的甲殼類動(dòng)物，2020年我國(guó)凡納濱對(duì)蝦產(chǎn)量為186多萬(wàn)t[1]，占全世界對(duì)蝦養(yǎng)殖量的80%以上。對(duì)蝦加工需去除頭部和硬殼(占質(zhì)量近40%～60%)[2]，產(chǎn)生大量廢物，給蝦類行業(yè)帶來(lái)環(huán)境污染。然而，蝦的生物廢棄物是生產(chǎn)幾丁質(zhì)的良好來(lái)源。幾丁質(zhì)，由β-(1-4)-聚-N-乙酰-D-氨基葡萄糖殘基通過(guò)氫鍵高度交聯(lián)的一種不溶性生物聚合物，是自然界中最豐富的有機(jī)化合物之一(僅次于纖維素)[3]。值得注意的是，幾丁質(zhì)衍生物(如殼聚糖)具有良好的生物降解性、生物相容性和無(wú)毒性等功能特性，可廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、化妝品、廢水處理等領(lǐng)域[4]。但傳統(tǒng)化學(xué)提取幾丁質(zhì)會(huì)產(chǎn)生大量的環(huán)境污染物并增加幾丁質(zhì)的部分脫乙?；?。

而酶提取法由于其具有環(huán)保性越來(lái)越受歡迎，被廣泛認(rèn)為是綠色提取方法之一。幾丁質(zhì)酶在自然界中廣泛存在，是一組水解酶，具有幾丁質(zhì)結(jié)合和催化結(jié)構(gòu)域，可以水解幾丁質(zhì)中的糖苷鍵。幾丁質(zhì)酶可將幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為廢物管理、生物醫(yī)學(xué)和酶工業(yè)中的有用產(chǎn)品[5]。已有報(bào)道稱幾丁質(zhì)酶存在于甲殼動(dòng)物，例如南美白對(duì)蝦、中華絨螯蟹、斑節(jié)對(duì)蝦、脊尾白蝦[6]。來(lái)自海洋甲殼動(dòng)物的幾丁質(zhì)酶具有作為工業(yè)應(yīng)用生物催化劑的潛能。然而，幾丁質(zhì)酶商業(yè)應(yīng)用因?yàn)槊府a(chǎn)率低、生產(chǎn)成本高及酶穩(wěn)定性差受到限制[3]。因此，探索提高幾丁質(zhì)酶活性的途徑是一項(xiàng)必要的研究。

短波紫外線(ultraviolet-C，UV-C)照射是一種非熱技術(shù)[7]，具有操作簡(jiǎn)單、安全性高、經(jīng)濟(jì)、無(wú)污染、無(wú)化學(xué)殘留等優(yōu)點(diǎn)。BHAT等[8]表明紫外線照射增加了魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度，主要是由于紫外線照射引起魚(yú)蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。KRISTO等[9]觀察到紫外誘導(dǎo)的蛋白構(gòu)象變化增加了乳清蛋白對(duì)胃蛋白酶水解的敏感性。另外，適度的UV-C照射可激活生物酶活性，紫外線照射后海參體壁酸性磷酸酶和組織蛋白酶的活性增加，表明紫外線照射在海參體壁“融化”過(guò)程中具有潛在的作用[10]。前期研究表明UV-C照射可激活凡納濱對(duì)蝦蝦頭幾丁質(zhì)酶[11]，但尚未系統(tǒng)研究?jī)?yōu)化UV-C照射激活幾丁質(zhì)酶的工藝。因此，本研究以凡納濱對(duì)蝦為研究對(duì)象，根據(jù)其不同組織部位幾丁質(zhì)酶的分布，選擇幾丁質(zhì)酶分布最集中的組織部位進(jìn)行最優(yōu)工藝的探討。使用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了UV-C照射參數(shù)，以開(kāi)發(fā)一種更有效提高幾丁質(zhì)酶活力的工藝。此外，探究了UV-C照射對(duì)幾丁質(zhì)酶酶學(xué)性質(zhì)影響，為UV-C照射提高凡納濱對(duì)蝦幾丁質(zhì)酶活力提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活的凡納濱對(duì)蝦，平均體質(zhì)量：(13.99±0.92) g，平均體長(zhǎng)：(13.92±0.58) cm，購(gòu)自廣東省湛江市麻章區(qū)湖光市場(chǎng)，將凡納濱對(duì)蝦不同部位進(jìn)行分離，分出頭殼、殼(來(lái)自蝦背部)、胃、肝臟、腸、肉、尾及蝦頭等組織部位。

幾丁質(zhì)(試劑級(jí))，美國(guó)Sigma公司；對(duì)二甲氨基苯甲醛(4-dimethylaminobenzaldehyde，DMAB)(分析純)，廣州化學(xué)試劑廠；蝸牛酶，上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DZKW-S-4型電熱恒溫水浴鍋，北京光明醫(yī)療儀器有限公司；LG20-W型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，北京京立離心機(jī)有限公司；2-16KL型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司；JYL-C012型榨汁攪拌機(jī)，九陽(yáng)股份有限公司；FE28型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；QL-905型旋渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Varioskan Flash型全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司；紫外燈(波長(zhǎng) 253.7 nm，功率分別為 6、10、20、30、40 W)，廣東雪萊特光電科股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 不同組織部位幾丁質(zhì)酶液制備

參照王賀等[11]的方法，稍作修改。將頭殼、殼、胃、肝臟、腸、肉、尾等組織部位按料液比1∶4(g∶mL)加入乙酸鈉緩沖液(20 mmol/L，pH 5)，再利用攪拌機(jī)得到不同組織部位的勻漿物。將勻漿物速凍到0 ℃，待解凍完全后，于4 ℃抽提1 h。隨后8 000 r/min離心15 min，得到的上清液即為頭殼、殼、胃、肝臟、腸、肉、尾的粗酶液。將酶液分裝后放在-80 ℃冰箱儲(chǔ)存。

1.3.2 幾丁質(zhì)酶活力的測(cè)定

按照王婧[12]的方法，稍作修改，采用DMAB方法用酶標(biāo)儀測(cè)定幾丁質(zhì)酶活力。將乙酸鈉緩沖液(50 mmol/L，pH 5.0)、1%膠體幾丁質(zhì)及粗酶液各200 μL在37 ℃水浴反應(yīng)2 h。將反應(yīng)混合物以4 000 r/min離心10 min終止反應(yīng)。取200 μL上清液，加入20 μL 10 g/L蝸牛酶溶液，于37 ℃水浴0.5 h。再加入100 μL飽和硼砂溶液，沸水浴7 min。待冷卻后，加入1 000 μL冰醋酸及500 μL 10 g/L DMAB溶液，于37 ℃下水浴15 min。然后在585 nm處測(cè)定其吸光度值，并使用不同濃度的N-乙酰葡萄糖胺繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。一個(gè)活性單位(U)定義為1 mL酶液每小時(shí)分解膠體幾丁質(zhì)產(chǎn)生1 μgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量。以20 min加熱滅活的酶為陰性對(duì)照。幾丁質(zhì)酶比活力以原料鮮重計(jì)算，單位為U/g原料。

1.3.3 UV-C照射對(duì)蝦頭幾丁質(zhì)酶的影響

參考CAO等[13]的方法，稍作修改。UV-C照射蝦頭幾丁質(zhì)酶的固定條件為：照射功率30 W、照射時(shí)間20 min、照射高度20 cm。設(shè)置的各因素梯度分別為：照射功率10、20、30、40、50 W，照射時(shí)間10、15、20、25、30 min，照射高度10、15、20、25、30 cm。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，改變以上某種因素，其他條件不變。按照1.3.1得到蝦頭勻漿物，將其鋪在玻璃培養(yǎng)皿(直徑9 cm)，厚度大概為5 mm。將紫外燈(波長(zhǎng)253.7 nm)放在培養(yǎng)皿正上方進(jìn)行照射。按照1.3.1制備不同UV-C照射條件下的粗酶液，測(cè)定幾丁質(zhì)酶活力。以未照射的蝦頭幾丁質(zhì)酶液為對(duì)照組。

1.3.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以UV-C照射功率、照射時(shí)間、照射高度為試驗(yàn)因素，以幾丁質(zhì)酶比活力為試驗(yàn)指標(biāo)，選擇3因素3水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiment design

1.3.5 凡納濱對(duì)蝦不同組織部位的激活

將各組織部位的勻漿物按照最優(yōu)工藝參數(shù)進(jìn)行UV-C照射，然后按照1.3.1制備UV-C照射條件下不同組織部位的粗酶液，來(lái)測(cè)定照射后各組織部位的幾丁質(zhì)酶活力。以未照射的各組織部位粗酶液為對(duì)照。

1.3.6 UV-C照射前后蝦頭幾丁質(zhì)酶酶學(xué)性質(zhì)變化

1.3.6.1 溫度對(duì)幾丁質(zhì)酶活力的影響

將UV-C照射的酶液與底物反應(yīng)體系混合物在pH 5和20～60 ℃的溫度范圍內(nèi)測(cè)定幾丁質(zhì)酶活力，確定酶的最佳溫度。未經(jīng)UV-C照射的為對(duì)照，同上操作。

1.3.6.2 pH對(duì)幾丁質(zhì)酶活力的影響

在37 ℃下確定UV-C照射前后蝦頭幾丁質(zhì)酶的最適pH。使用甘氨酸-HCl緩沖液(pH 2.2～3)、醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 4～5)、Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液(pH 6～8)和Na2CO3-NaHCO3緩沖液(pH 9)作為50 mmol/L反應(yīng)緩沖液測(cè)定不同pH值下UV-C照射前后幾丁質(zhì)酶活力。

1.3.6.3 金屬離子對(duì)幾丁質(zhì)酶活力的影響

加入Na2HPO4-檸檬酸緩沖液(50 mmol/L，pH 6.4)配制濃度為10 mmol/L金屬鹽溶液(Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+)。將各種金屬離子添加到UV-C照射和未照射的幾丁質(zhì)酶液中，然后測(cè)定幾丁質(zhì)酶活力。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均做3次平行，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSS 26.0、Origin 2018軟件分析數(shù)據(jù)及作圖。通過(guò)Duncan多重檢驗(yàn)確定樣本之間差異的顯著性(P<0.05，差異顯著)。

2 結(jié)果與分析

2.1 凡納濱對(duì)蝦不同組織部位幾丁質(zhì)酶活力分布

如圖1-a所示，凡納濱對(duì)蝦肝臟、胃、腸、頭殼、殼、尾的幾丁質(zhì)酶比活力分別為(72.84±2.54)、(33.54±1.31)、(27.25±0.91)、(21.40±1.25)、(10.74±0.48)、(5.22±0.05)U/g，說(shuō)明凡納濱對(duì)蝦中幾丁質(zhì)酶大部分存在于蝦頭。凡納濱對(duì)蝦不同組織部位幾丁質(zhì)酶活力占比如圖1-b所示，肝臟最高，其次是胃、頭殼及殼，最后是腸及尾，這主要與各部位質(zhì)量及酶活力相關(guān)。蝦頭部位(含肝臟、胃、頭殼)的幾丁質(zhì)酶活力占比達(dá)到84.83%。因此選擇蝦頭做后續(xù)試驗(yàn)。研究發(fā)現(xiàn)，南美白對(duì)蝦幾丁質(zhì)酶在肝胰腺中高水平表達(dá)但在表皮組織中低水平表達(dá)[14]。斑節(jié)對(duì)蝦幾丁質(zhì)酶在肝胰腺和腸道中表達(dá)，且參與了蛻皮時(shí)幾丁質(zhì)的降解[15]?？芍?，幾丁質(zhì)酶主要存在于凡納濱對(duì)蝦的一些消化吸收器官及表皮，這主要因?yàn)閹锥≠|(zhì)酶可分解幾丁質(zhì)及參與甲殼類動(dòng)物蛻皮。幾丁質(zhì)酶對(duì)于甲殼類動(dòng)物來(lái)說(shuō)是必不可少的，具有消化幾丁質(zhì)食物、修飾腸道圍營(yíng)養(yǎng)膜和降解幾丁質(zhì)外骨骼的功能[16]。

a-幾丁質(zhì)酶的比活力；b-幾丁質(zhì)酶活力占比圖1 凡納濱對(duì)蝦不同組織部位幾丁質(zhì)酶比活力 及酶活力占比Fig.1 Specific activity and proportion of the chitinase activity in different tissues of L.vannamei注：不同小寫(xiě)字母表示組間差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 UV-C照射對(duì)蝦頭幾丁質(zhì)酶活力的影響

2.2.1 照射功率對(duì)幾丁質(zhì)酶活力的影響

如圖2所示，不同照射功率下(6、10、20、30、40 W)的幾丁質(zhì)酶比活力均高于未照射的，分別增加了27.32%、40.70%、33.26%、29.30%、17.48%，說(shuō)明UV-C照射提高了幾丁質(zhì)酶活力。隨著照射功率的增加，幾丁質(zhì)酶比活力逐漸增大，在照射功率為10 W時(shí)最高，達(dá)到(37.75±1.35)U/g(P< 0.05)。當(dāng)照射功率超過(guò)10 W后，酶比活力增加的趨勢(shì)逐漸減小。相比10 W時(shí)最高的幾丁質(zhì)酶比活力，20、30、40 W時(shí)幾丁質(zhì)酶比活力分別降低了5.29%、8.11%、16.51%。這些結(jié)果表明，低強(qiáng)度光處理可能會(huì)改變酶活性位點(diǎn)的構(gòu)象，而不會(huì)損害其催化能力，但會(huì)導(dǎo)致整體活性增加。相比之下，UV-C更高強(qiáng)度處理與導(dǎo)致酶失活的不可逆結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。光會(huì)通過(guò)2條主要途徑改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而影響蛋白質(zhì)的生物活性，一是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或發(fā)色團(tuán)吸收輻射引起的直接光氧化，另一個(gè)是通過(guò)光敏劑能量轉(zhuǎn)移產(chǎn)生單線態(tài)氧形成的間接蛋白質(zhì)氧化[17]。

圖2 不同照射功率下蝦頭幾丁質(zhì)酶的比活力Fig.2 Specific activity of chitinase in shrimp heads under different irradiation powers注：不同小寫(xiě)字母表示組間差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2.2 照射時(shí)間對(duì)幾丁質(zhì)酶活力的影響

如圖3所示，相比未照射的樣品，幾丁質(zhì)酶在10、15、20、25、30 min照射時(shí)間下均有不同程度的激活，分別提高了25.08%、65.36%、133.77%、96.81%、4.44%。由圖3可知，幾丁質(zhì)酶隨著照射時(shí)間的增加而被激活，然后隨著處理時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)而降低。當(dāng)照射時(shí)間為20 min時(shí)，幾丁質(zhì)酶比活力為(36.37±2.29)U/g(P<0.05)。當(dāng)處理時(shí)間超過(guò)20 min時(shí)，幾丁質(zhì)酶比活力顯著降低。相比20 min時(shí)的酶比活力，25、30 min下酶比活力分別降低了15.80%、55.33%。劉亮等[18]觀察到在照射功率20 W和照射距離10 cm的條件下，水蜜桃果汁中多酚氧化酶活性隨照射時(shí)間延長(zhǎng)而降低，并在41.42 min時(shí)損失50%。ZHANG等[19]發(fā)現(xiàn)油桃中UV-C處理的幾丁質(zhì)酶活力隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，并在24 h達(dá)到峰值，之后急劇下降。前期溫和的UV-C照射條件增強(qiáng)了幾丁質(zhì)酶活力，但長(zhǎng)時(shí)間的UV-C照射會(huì)破壞幾丁質(zhì)酶蛋白的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其活力降低。

圖3 不同照射時(shí)間下蝦頭幾丁質(zhì)酶的比活力Fig.3 Specific activity of chitinase in shrimp heads at different irradiation time

2.2.3 照射高度對(duì)幾丁質(zhì)酶活力的影響

如圖4所示，相比未處理的樣品，在照射高度為10、15、20、25、30 cm下照射處理的幾丁質(zhì)酶有不同程度的激活，分別增加了36.64%、80.81%、62.21%、44.55%、9.14%。隨著照射高度的增加，幾丁質(zhì)酶比活力增大，之后隨著照射高度的進(jìn)一步增加而降低。在照射高度為15 cm下酶比活力最高，達(dá)到(26.07±0.83)U/g(P<0.05)。相比15 cm時(shí)酶比活力，在20、25、30 cm的照射高度下觀察到酶比活力的損失，分別為10.28%、20.05%、39.63%。BOYCE等[20]發(fā)現(xiàn)當(dāng)微生物樣品表面距UV-C設(shè)備更遠(yuǎn)的距離時(shí)，細(xì)菌對(duì)數(shù)減少量較低。劉亮等[19]發(fā)現(xiàn)在10、20、30 cm的照射距離下，多酚氧化酶活性隨照射距離的增加而逐漸上升。

圖4 不同照射高度下蝦頭幾丁質(zhì)酶的比活力Fig.4 Specific activity of chitinase in shrimp heads under different irradiation heights

2.3 UV-C照射工藝的正交試驗(yàn)優(yōu)化

對(duì)照射功率、照射時(shí)間、照射高度，采用4因素3水平的正交表L9(34)，以幾丁質(zhì)酶比活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)方案及結(jié)果分析如表2所示。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Design and results of the orthogonal experiment

表2的極差結(jié)果顯示，在UV-C照射幾丁質(zhì)酶工藝條件中影響酶比活力的主次因素為B>C>A，即照射時(shí)間>照射高度>照射功率。UV-C照射幾丁質(zhì)酶的最佳工藝為A2B3C1，即照射功率10 W，照射時(shí)間20 min，照射高度10 cm。得到的最佳工藝是試驗(yàn)6號(hào)的組合，此時(shí)的酶活力也是9組試驗(yàn)中最高的，為(27.06±0.10)U/g。因此，利用UV-C照射最佳工藝對(duì)接下來(lái)不同組織部位激活以及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行探究。

2.4 UV-C照射對(duì)不同組織部位幾丁質(zhì)酶的激活作用

UV-C照射可作為提高酶活力的有效手段，圖5結(jié)果顯示，UV-C照射對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝臟、腸、胃、頭殼、殼、尾幾丁質(zhì)酶有不同程度的激活，分別升高41.41%、157.81%、137.86%、64.12%、25.68%、16.61%。

圖5 UV-C照射對(duì)不同組織部位幾丁質(zhì)酶激活作用Fig.5 Activation of the chitinase in different tissues by UV-C irradiation注：不同的大小寫(xiě)字母分別表示0.05水平下UV-C照射 前后組間有顯著性差異(下同)

可見(jiàn)，UV-C照射可以顯著激活凡納濱對(duì)蝦不同組織部位的幾丁質(zhì)酶。CAO等[13]利用30 W紫外燈照射蝦頭20 min，發(fā)現(xiàn)蛋白酶水解活性相對(duì)于未處理樣品增加了62%。鄭麗等[21]發(fā)現(xiàn)紫外線照射能提高扇貝加工廢棄物中自溶酶活力。UV-C照射可以通過(guò)改變氨基酸微環(huán)境來(lái)激活酶[22]，并可能改變芳香族殘基的修飾，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)變化，使芳香族氨基酸分子側(cè)鏈基團(tuán)逐漸暴露于溶液中[23]。蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的適度伸展使其能夠更好地與底物結(jié)合，從而提高其催化能力。UV-C照射技術(shù)可增大凡納濱對(duì)蝦廢棄物中幾丁質(zhì)酶在幾丁質(zhì)降解上的利用價(jià)值。

2.5 UV-C照射對(duì)幾丁質(zhì)酶酶學(xué)性質(zhì)的影響

2.5.1 溫度對(duì)幾丁質(zhì)酶活力的影響

如圖6所示，pH 5.0時(shí)UV-C照射前后溫度對(duì)酶的影響趨勢(shì)一致，幾丁質(zhì)酶最適溫度為40 ℃，說(shuō)明UV-C照射對(duì)幾丁質(zhì)酶的溫度沒(méi)有影響。照射前后蝦頭幾丁質(zhì)酶最適溫度與脊尾白蝦[12]的最適溫度一致。而斑節(jié)對(duì)蝦幾丁質(zhì)酶的最適溫度為55 ℃，這主要是因?yàn)椴煌贩N蝦的生活環(huán)境不一樣[24]。此外，最適溫度下照射前后幾丁質(zhì)酶活力由(37.22±0.77)U/g升高至(44.91±1.32)U/g，提高了20.67%，說(shuō)明UV-C照射可提高幾丁質(zhì)酶活力。在20～50 ℃的溫度范圍內(nèi)，幾丁質(zhì)酶顯示出較高的比活力。相反，當(dāng)溫度>60 ℃后，照射前后酶活力損失均超過(guò)60%。這可能是由于熱變性所致。BEYGMORADI等[25]觀察到墨吉明對(duì)蝦中的幾丁質(zhì)酶在高于60 ℃時(shí)酶活性損失超過(guò) 60%。因此，UV-C照射可作為提高凡納濱對(duì)蝦廢棄物中幾丁質(zhì)酶在適溫條件下降解幾丁質(zhì)的綠色技術(shù)。

圖6 UV-C照射前后不同溫度對(duì)幾丁質(zhì)酶比活力的影響Fig.6 Effects of different temperatures on the chitinase specific activity before and after UV-C irradiation

2.5.2 pH對(duì)幾丁質(zhì)酶活力的影響

UV-C照射前的幾丁質(zhì)酶在pH 4.0具有最大的幾丁質(zhì)分解活性(圖7)，接近斑節(jié)對(duì)蝦的最適pH[24]，這表明甲殼類幾丁質(zhì)分解酶的最佳pH是酸性的。而UV-C照射的幾丁質(zhì)酶在pH 5.0時(shí)酶活性最高?？芍?，UV-C增大了幾丁質(zhì)酶的最適pH值，結(jié)果與王賀等[11]研究結(jié)果相似。在最適pH下，UV-C照射前后的幾丁質(zhì)酶比活力分別為(37.08±1.17)、(29.71±0.55)U/g，提高24.83%。相反，在其他pH下，觀察到UV-C照射前后幾丁質(zhì)酶活性有損失，而在pH 9下UV-C照射前后酶活性最大損失分別為63.74%、56.71%。酶活性的降低可能是由于蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化[26]和酶不能正確地結(jié)合底物[27]所致。具有低pH值特性的凡納濱對(duì)蝦幾丁質(zhì)酶是一類適用于消化酸性條件下含幾丁質(zhì)食物的酶。

圖7 UV-C照射前后不同pH對(duì)幾丁質(zhì)酶比活力的影響Fig.7 Effects of different pH on the chitinase specific activity before and after UV-C irradiation

2.5.3 金屬離子對(duì)幾丁質(zhì)酶活力的影響

如圖8所示，Na+、Ca2+對(duì)照射前后的幾丁質(zhì)酶有輕微的激活作用，K+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Fe3+、Cu2+有不同程度抑制作用，說(shuō)明UV-C照射沒(méi)有改變幾丁質(zhì)酶對(duì)金屬離子的特性。K+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Fe3+對(duì)未處理的酶分別抑制了7.93%、28.05%、24.38%、76.49%、38.14%，而對(duì)照射的酶分別抑制了2.75%、10.87%、35.25%、27.82%、49.14%。Cu2+對(duì)照射前后的酶完全抑制。OLIVEIRA等[28]發(fā)現(xiàn)Cu2+、Fe3+、Zn2+顯著降低了腰果中幾丁質(zhì)酶活性。在不同金屬離子的作用下，經(jīng)UV-C照射的幾丁質(zhì)酶活力均比未照射的顯著提高。Zn2+、Fe3+、Cu2+能引起幾丁質(zhì)酶的失活是因?yàn)槠渑c組氨酸或半胱氨酸結(jié)合而導(dǎo)致酶蛋白構(gòu)象的變化[29]。據(jù)推測(cè)，金屬離子與關(guān)鍵催化殘基的側(cè)鏈羧酸鹽基團(tuán)的相互作用固定了它們的構(gòu)象，限制了它們的水解能力[30]。上述結(jié)果表明，蝦頭幾丁質(zhì)酶可能是一種金屬酶，其活性依賴于陽(yáng)離子的存在。

圖8 UV-C照射前后不同金屬離子對(duì)幾 丁質(zhì)酶比活力的影響Fig.8 Effects of different metal ions on the specific activity of chitinase before and after UV-C irradiation

3 結(jié)論

凡納濱對(duì)蝦肝臟、胃、腸、頭殼、殼、尾的幾丁質(zhì)酶比活力分別為(72.84±2.54)、(33.54±1.31)、(27.25±0.91)、(21.40±1.25)、(10.74±0.48)、(5.22±0.05)U/g原料。幾丁質(zhì)酶主要分布在蝦頭部位(含肝臟、胃、頭殼)，占比達(dá)84.83%。UV-C照射可顯著激活幾丁質(zhì)酶。正交優(yōu)化UV-C照射激活蝦頭幾丁質(zhì)酶工藝為：照射功率10 W，照射時(shí)間25 min，照射高度10 cm，此時(shí)幾丁質(zhì)酶活力為(27.06±0.10)U/g原料。在最優(yōu)照射條件下，UV-C照射顯著激活對(duì)蝦各組織部位中幾丁質(zhì)酶且對(duì)幾丁質(zhì)酶酶學(xué)性質(zhì)無(wú)顯著影響。適度UV-C照射使幾丁質(zhì)酶蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)伸展，形成了利于其與底物結(jié)合的空間結(jié)構(gòu)。有關(guān)UV-C照射幾丁質(zhì)酶的分子機(jī)制有待后續(xù)深入研究。