一株貝萊斯芽孢桿菌的分離鑒定及其益生潛力評價

婁向弟，張向向，賀江，莫德錢，王永慧，熊建華，郜彥彥*

1(江西農業(yè)大學 食品科學與工程學院，江西 南昌，330045)2(江蘇沿海地區(qū)農業(yè)科學研究所，江蘇 鹽城，224002)

貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)是2005年由RUIZ-GARCA等[1]發(fā)現，為革蘭氏陽性好氧細菌，內生孢子，是芽孢桿菌屬(Bacillus)的新種，一種新型細菌[2]。近年來國內外對貝萊斯芽孢桿菌的研究越來越多，主要集中在生物防治[3]、藥物研發(fā)[4]、食品發(fā)酵[5]和工業(yè)酶制劑[6-7]等領域。貝萊斯芽孢桿菌來源非常廣泛，不同生境分離得到的貝萊斯芽孢桿菌功能也不完全相同[8]，有研究表明貝萊斯芽孢桿菌L-1對梨灰霉和青霉病菌有抑制作用，能引起病原菌菌絲膨大、畸形[9]。貝萊斯芽孢桿菌RJW-5-5能夠抑制禾旋孢腔菌(Cochliobolussativus)、辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)和梨黑斑病菌(AlternariakikuchianaTanaka)等多種農作物病害，具有多種羊毛硫抗生素、套索肽、細菌素等抗菌肽基因簇[10]。而來自發(fā)酵海洋魚醬油中的貝萊斯芽孢桿菌SW5對食品中多種常見病原菌具有明顯的抑菌活性，發(fā)酵上清液中含有多種抑菌物質[11]。

益生菌是一類能夠在宿主體內存活并發(fā)揮有益作用的微生物，具有維持腸黏膜屏障，調節(jié)免疫功能和促進營養(yǎng)物質的代謝吸收等重要功能[12]。具有酸和膽汁的耐受性，是益生菌在小腸中生存和發(fā)揮益生作用的重要因素[13]?？股孛舾?、抑制腸道中的致病菌生長，調節(jié)腸道菌群平衡，也是益生潛力評價的重要環(huán)節(jié)[14-15]。本實驗室從農家醬中分離得到的一株有抑菌活性的分離株PJP10，對其進行生理生化和16S rDNA測序比對分析。通過耐受性測定、抗氧化活性分析和安全性試驗來評價該菌株的益生潛力，為其在食品方面的開發(fā)和應用提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 實驗材料

農家醬，市售。

指示菌：腸炎沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、釀酒酵母、白色念珠菌、黑曲霉，本實驗室保存；銅綠假單胞菌、蠟樣芽孢桿菌、單增李斯特菌，上海嘉楚生物工程有限公司；副溶血性弧菌，北納生物技術研究院；青枯雷爾氏菌(辣椒青枯病病原菌)、黃單胞桿菌(柑橘潰瘍病病原菌)、刺盤孢菌(梨炭疽病病原菌)，江西農業(yè)大學農學院果蔬保藏實驗室。

胰蛋白胨、瓊脂粉、蛋白胨，生工生物工程(上海)股份有限公司；酵母膏、NaCl，天津市福晨化學試劑廠；DPPH、ABTS、三吡啶三吖嗪(tripyridine triazine, TPTZ)、過硫酸鉀，美國Sigma公司；16種藥敏紙片，杭州濱河微生物試劑有限公司；其他常規(guī)試劑采用進口分裝或國產分析純級。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 10.0、蛋白胨10.0、酵母粉5.0。固體培養(yǎng)基另加2%(質量分數)瓊脂粉，121 ℃，滅菌20 min后備用。

不同pH培養(yǎng)基：用稀HCl溶液和NaOH溶液將LB培養(yǎng)基的pH調為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，滅菌備用。

高鹽培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基中NaCl質量分數調整為8%，滅菌備用。

膽鹽培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基中加入膽鹽，使膽鹽的質量分數分別為0.1%、0.3%、0.5%，滅菌備用。

1.1.3 儀器與設備

FA2104電子天平，上海菁海儀器有限公司；SW-CJ潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；Spcord200紫外可見分光光度計，德國耶拿分析儀器股份有限公司；HC-2518R高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的分離

稱取農家醬5 g，加入100 mL滅菌水，180 r/min搖床振蕩20 min，制成菌懸液，吸取1 mL菌懸液進行梯度稀釋，分別取10-3、10-4、10-5三個梯度均勻涂布在LB固體平板上，30 ℃培養(yǎng)48 h后挑取單菌落，純化至純培養(yǎng)保存，此為分離菌。

1.2.2 菌種活化與培養(yǎng)

從-80 ℃冰箱中取出凍存的菌液，劃線到LB固體平板，37 ℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，然后取培養(yǎng)好的單菌落轉接至50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)36 h，作為種子液。

無菌發(fā)酵液制備：以2%接種量(體積分數，下同)轉接種子液至250 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)36 h，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，收集上清液，并用0.22 μm濾膜過濾，作為無菌發(fā)酵液。

1.2.3 菌株的篩選和鑒定

以金黃色葡萄球菌為指示菌，制備成菌懸液(1×108CFU/mL)，均勻涂布到LB固體平板上，晾干后，加入5 μL分離菌種子液，30 ℃培養(yǎng)1～2 d，選取能產生抑菌圈的分離菌進行革蘭氏染色和16S rDNA測序。

采用16S rDNA測序法鑒定PJP10菌株，選擇通用引物27F(5′-GTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增，PCR產物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序分析，使用MEGA 5.1軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹構建。

1.2.4 PJP10菌株的耐受性評價

1.2.4.1 pH耐受性

按2%接種量將活化后的PJP10種子液接種到不同pH的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min培養(yǎng)36 h后，測定不同pH值培養(yǎng)的OD600。

1.2.4.2 高鹽耐受性

按2%接種量轉接種子液到高鹽培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)36 h，平板菌落計數檢測其鹽耐受性。

1.2.4.3 高溫耐受性

參考劉秀俠等[16]的測定方法，略作修改。將2瓶種子液分別于80和100 ℃水浴10 min，以10%的接種量轉接至新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)，測定0和36 h的OD600，判斷其耐熱性。

1.2.4.4 膽鹽耐受性

以10%的接種量，將種子液分別接種至含0.1%、0.3%、0.5%膽鹽的LB培養(yǎng)基中，37 ℃水浴4 h，平板菌落計數檢測膽鹽耐受性。

1.2.4.5 胃腸液耐受性

以10%的接種量，將種子液分別接種于人工胃液和人工腸液[17]中，37 ℃水浴3 h，平板菌落計數分別檢測胃液和腸液中PJP10菌株的耐受性。

1.2.4.6 抗生素耐受性

采用K-B紙片擴散法(Kirby-Bauer disk diffusion method)測定抗生素敏感性，將種子液用生理鹽水梯度稀釋，將菌濃度稀釋到1×108CFU/mL，再吸取50 μL稀釋后的菌液均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基上，晾干后分別將16種抗生素藥敏紙片放入平板中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察抑菌效果并測量抑菌圈直徑。

1.2.5 PJP10菌株的抑菌能力測定

將活化好的指示菌種子液，采用梯度稀釋法用生理鹽水稀釋至所需的菌懸液濃度(1×108CFU/mL)。取50 μL指示菌懸液，細菌涂布于LB固體平板上，真菌涂布于PDA平板上。抑制細菌試驗采用打孔法，在各孔內分別加入100 μL PJP10無菌發(fā)酵液，以100 μL無菌LB液體培養(yǎng)基為陰性對照，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察并測量抑菌圈直徑。拮抗真菌試驗在涂好指示菌的平板上滴加5 μL PJP10種子液，以5 μL無菌LB液體培養(yǎng)基為陰性對照，30 ℃培養(yǎng)3～5 d，觀察并測量抑菌圈直徑。

1.2.6 PJP10菌株自由基清除能力測定

ABTS陽離子自由基清除能力：參考孟歌等[18]的測定方法，略作改動。用去離子水稀釋ABTS陽離子母液，稀釋至其OD734=0.70左右，30 ℃避光平衡30 min，得到ABTS陽離子工作液。吸取200 μL無菌發(fā)酵液，加入2.0 mL ABTS陽離子工作液，混勻后25 ℃避光放置20 min，于734 nm處測定吸光值，ABTS陽離子自由基的清除率按公式(1)計算。

(1)

式中：A樣品、A空白和A對照分別是樣品組、樣品空白組(以去離子水替代ABTS溶液)和對照組(去離子水替代樣品)的吸光值。

DPPH自由基清除能力：參考TANG等[19]的測定方法，略作改動。吸取2.0 mL無菌發(fā)酵液加入到2.0 mL DPPH(0.2 mmol/L)溶液中，混勻后25 ℃避光反應30 min，于517 nm處測定吸光值。DPPH自由基的清除率按公式(2)計算。

(2)

式中：A樣品、A空白和A對照分別是樣品組、樣品空白組(以無水乙醇替代DPPH溶液)和對照組(以無水乙醇替代樣品)的吸光值。

1.2.7 鐵離子還原能力的測定

參考BENZIE等[20]的測定方法，略作改動。首先取2.5 mL TPTZ溶液(0.01 mol/L)和25.0 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 3.6，0.3 mol/L)，與2.5 mL FeCl3(0.02 mol/L)溶液充分混勻，即得FRAP(ferric reducing antioxidant power，FRAP)工作液。

繪制標準曲線：取0.5 mL濃度分別為0.025、0.1、0.15、0.2、0.4、0.5、0.8、1.0、1.5 mmol/L的FeSO4溶液與3.0 mL FRAP工作液混合，37 ℃保溫15 min，于593 nm處測定吸光值。以反應體系中FeSO4濃度為縱坐標，吸光值為橫坐標繪制標準曲線，計算回歸方程為y=3.695x+0.006，R2=0.994 6。

取0.5 mL無菌發(fā)酵液，加入3.0 mL FRAP工作液，37 ℃保溫15 min，于593 nm處測定吸光值。

A樣品-A空白-A對照的差值通過回歸方程計算，獲得FeSO4的濃度，即為FRAP值。A樣品、A空白和A對照分別是樣品組、樣品空白組(以去離子水替代FRAP溶液)和對照組(去離子水替代樣品)的吸光值。

1.2.8 亞鐵離子螯合能力的測定

參考DECKER等[21]的測定方法，略作改動。吸取1.0 mL無菌發(fā)酵液與1.0 mL FeSO4溶液(2.0 mmol/L)混合，加入0.2 mL菲咯嗪溶液(5.0 mmol/L)，充分混勻后25 ℃保溫10 min，于562 nm處測定吸光值。亞鐵離子螯合率按公式(3)計算。

(3)

式中：A樣品、A空白和A對照分別是樣品組、樣品空白組(以去離子水替代菲咯嗪溶液)和對照組(去離子水替代樣品)的吸光值。

1.2.9 安全性試驗

溶血實驗：參考矯艷平等[22]的測定方法，并進行修改。取100 μL PJP10菌株的無菌發(fā)酵液采用打孔法加在血平板上，放于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置24 h，觀察有無溶血圈，以具有溶血性的蠟樣芽胞桿菌ATCC 14579無菌發(fā)酵液為陽性對照。

飼喂實驗：參考于景艷等[23]的測定方法，并進行修改。試驗所需的彭澤鯽(Carassiusauratusvar.Pengze)魚苗采購自江西省南昌市水產魚苗養(yǎng)殖基地，在室內馴養(yǎng)1周后，選取初始體長(8±0.5)cm，健康無病無傷45尾，隨機分為3個組，每組15尾魚，每組一個養(yǎng)殖容器(45 cm×32 cm×26 cm的周轉箱)開始實驗，實驗期間，充氧機充分曝氣，每隔1 d換一次水。每天正常投喂飼料一次，投喂飼料分別為添加1×106和1×108CFU/g的PJP10的通威魚用膨化飼料181號，并以不添加PJP10的通威181號飼料為對照，喂養(yǎng)21 d，觀察魚的生長狀態(tài)并計算各組魚的死亡率。

1.2.10 數據分析

實驗數據使用Excel 2019軟件整理，使用SPSS 25.0軟件統(tǒng)計分析，實驗結果采用平均值±標準差表示，每組設置3組平行，實驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 PJP10菌株的分離與鑒定

以金黃色葡萄球菌為指示菌，篩選到一株具有明顯拮抗活性的分離菌PJP10(圖1-a)。分離菌PJP10在LB固體平板，于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，菌落呈淺黃色，圓形，邊緣光滑，表面濕潤(圖1-b)。培養(yǎng)48 h進行革蘭氏染色為陽性，菌體細胞成桿狀，部分細菌可生成橢圓形芽孢(圖1-c)。

a-抑菌圈；b-菌落形態(tài)；c-菌體形態(tài)(16×100)圖1 菌株PJP10的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of the PJP10

根據測序結果可知，分離株PJP10的16S rDNA序列長度為1 496 bp，將16S rDNA基因序列通過美國國家生物技術信息中心(NCBI)進行BLAST比對分析，發(fā)現其與BacillusvelezensisGS-1、Bacillusvelezensis504的16S rDNA的基因序列最為相似，同源性達99.67%。與BacillussiamensisB268、BacillusmethylotrophicusIHB B 18137、BacillusvallismortisDc-02、BacillusmojavensisRHPR20、BacillusamyloliquefaciensSF14同源性分別為99.60%、99.53%、99.47%、99.46%和99.40%。利用MEGA5.1軟件的Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果顯示分離株PJP10與BacillusvelezensisGS-1位于同一分支，根據序列比對分析，形態(tài)學和生理生化鑒定結果，初步確定分離株PJP10為Bacillusvelezensis，命名為貝萊斯芽孢桿菌PJP10(BacillusvelezensisPJP10)(圖2)。

圖2 菌株PJP10基于16S rDNA序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the PJP10 based on 16S rDNA sequence注：括號內為菌株的16S rDNA序列在GenBank中的登錄號； 分支結點處數字為Bootstrap值；標尺的數據為進化距離

2.2 PJP10菌株的耐受性評價

由表1可知，PJP10菌株可以耐受8%(質量分數)的高鹽環(huán)境，培養(yǎng)36 h其生長濃度可以達到++(5×107CFU/mL)。膽鹽對PJP10菌株的生長有明顯的抑制作用，0.1%的膽鹽環(huán)境PJP10菌株的生長濃度可達到+++(108CFU/mL)，在0.3%和0.5%的膽鹽環(huán)境下，其生長濃度分別降到++(5×107CFU/mL)和+(107CFU/mL)，由此可見PJP10菌株對膽鹽敏感，雖然生長活力減弱，但是依然具備在膽鹽環(huán)境下生長的能力。

PJP10菌株種子液分別經80和100 ℃水浴10 min后，轉接培養(yǎng)36 h，其發(fā)酵液菌濃度依然可以培養(yǎng)至++和+，可見PJP10菌株形成的芽孢對高溫環(huán)境的耐受性很強。

弱酸和弱堿性的培養(yǎng)環(huán)境對PJP10菌株的生長沒有抑制作用，直到培養(yǎng)環(huán)境pH 9時，其生長濃度降為++，在pH 2、pH 3和pH 10等強酸和強堿的培養(yǎng)環(huán)境中，PJP10菌株的生長濃度為+，模擬的胃液和腸液環(huán)境對PJP10菌株的生長都有抑制作用，其生長濃度分別為++和+，由此表明，低pH對PJP10菌株的活力有抑制作用，但是PJP10菌株的生長也表現了其對低pH具有很好的耐受性。

表1 菌株PJP10的耐受性試驗結果Table 1 Results of tolerance tests of the PJP10

PJP10菌株對于大觀霉素、阿奇霉素和慶大霉素等16種不同抗生素的敏感性測定結果如表2所示。PJP10菌株僅對青霉素G和阿莫西林表現出耐藥，對其余14種抗生素均表現敏感。朱亞珠等[11]分離的貝萊斯芽孢桿菌SW5，對β-內酰胺類抗生素和氯霉素表現敏感，對多粘菌素B與克林霉素表現耐藥。貝萊斯芽孢桿菌抗生素敏感這一特性為其在食品開發(fā)領域創(chuàng)造了條件和基礎。

表2 菌株PJP10抗生素敏感性結果Table 2 Results of antibiotic susceptibility of the PJP10

2.3 PJP10菌株的抑菌能力

通過菌株拮抗實驗測定PJP10無菌發(fā)酵液對病原菌的拮抗能力，結果顯示PJP10抑菌譜廣，對革蘭氏陰性及陽性細菌都表現出拮抗活性，特別是對金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌、副溶血性弧菌、青枯雷爾氏菌的拮抗效果顯著，對大腸桿菌、單增李斯特菌、銅綠假單胞菌和糞腸球菌也有拮抗活性，對黑曲霉、刺盤孢菌、白色念珠菌、釀酒酵母等真菌同樣具有拮抗活性(表3)。

2.4 PJP10菌株的抗氧化能力

PJP10菌株的抗氧化能力如表4所示，ABTS經氧化能生成穩(wěn)定的藍綠色ABTS陽離子，當遇到具有抗氧化活性的物質時，ABTS陽離子會被還原，溶液顏色變淺，此特性被用來說明物質的抗氧化能力。解文利等[24]從四川泡菜中分離得到的6株植物乳桿菌中ABTS陽離子自由基清除率最高為(89.33±1.27)%。經測定，PJP10無菌發(fā)酵液對ABTS陽離子自由基的清除率達到了(95.66±3.1)%，表現出了較強的天然抗氧化活性。

DPPH自由基清除率通常用來評價益生菌的抗氧化活性，DPPH自由基被抗氧化劑還原后生成穩(wěn)定的DPPH分子，顏色由深紫色變?yōu)榈S色，因此可以通過顏色變化來判定物質的抗氧化能力。吳石金等[25]從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離得到的乳酸菌對DPPH自由基清除率均不超過30%。肖宇等[26]從藏靈菇中篩選得到的36株乳酸菌對DPPH自由基清除率最高為32.95%。經測定，PJP10無菌發(fā)酵液對DPPH自由基清除率為(44.81±2.2)%，由此可見，在未經優(yōu)化的條件下，PJP10菌株表現出較強的DPPH自由基的清除能力。

表4 菌株PJP10的抗氧化活性Table 4 Antioxidant activity of the PJP10

鐵離子還原能力是Fe3+被抗氧化物質還原成Fe2+，以供機體正常生長發(fā)育的能力。孟歌等[18]測定的藥用靈芝具有較強的鐵離子還原能力，在液體培養(yǎng)14 d后，鐵離子還原能力達到峰值，為314.76 μmol/L。經測定，PJP10無菌發(fā)酵液鐵離子還原能力為(301.9±3.7) μmol/L，表明了PJP10菌株同樣具有較強的鐵離子還原能力。

亞鐵離子螯合能力已經被應用到工業(yè)上用于證明物質的抗氧化能力。李權威等[27]從風干羊肉中分離得到的24株乳酸菌的亞鐵離子螯合率為22.20%～59.97%，平均螯合率為45.78%，其中螯合率最高為(59.97±0.02)%。經測定，PJP10無菌發(fā)酵液的亞鐵離子螯合能力為(76.88±2.2)%，說明PJP10具有良好的亞鐵離子螯合能力，具有通過清除體內自由基來實現抗氧化和預防疾病的潛力。

2.5 安全性試驗結果

溶血試驗結果如圖3所示，陽性對照蠟樣芽孢桿菌ATCC 14579的無菌發(fā)酵液在血平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后出現明顯的溶血圈，而菌株PJP10無溶血圈。

圖3 菌株PJP10的溶血試驗Fig.3 Hemolysis test of the PJP10

由表5可知，通過連續(xù)給彭澤鯽飼喂含1×106和1×108CFU/g PJP10的魚飼料21 d，鯽魚未出現異常，與對照組無明顯差異，生理狀態(tài)仍健康活潑，表明該菌株生物安全性較好，具備較好的益生潛力。

表5 菌株PJP10的安全性試驗結果Table 5 Results of safety test of the PJP10

3 結論與討論

貝萊斯芽孢桿菌在生物防治領域表現出來的潛力是近年來國內外研究的熱點，研究表明貝萊斯芽孢桿菌是促進植物生長的根系微生物之一，其不僅能夠通過直接分泌化合物促進植物生長，緩解壓力，還能夠通過自身分泌物誘導植物產生系統(tǒng)抗性，拮抗病原菌的反復入侵和病蟲害壓力[28-29]。從食品中分離得到貝萊斯芽孢桿菌的研究報道則相對較少，尤其對貝萊斯芽孢桿菌進行益生特性評價和抗氧化活性的研究更是鮮有報道。

本文以金黃色葡萄球菌、青枯雷爾氏菌、黑曲霉等多株細菌和真菌為指示菌，測定PJP10的抑菌活性和抑菌效果，結果顯示PJP10對細菌和真菌都能表現出拮抗作用。耐受性測定實驗表明PJP10可以耐受高鹽、膽鹽、高溫、低pH培養(yǎng)和模擬的胃腸道消化液環(huán)境，在抗生素敏感性測定實驗中對大多數抗生素表現敏感。抗氧化能力測定實驗說明其對ABTS陽離子和DPPH自由基的清除效果較好，并且具有較強的鐵離子還原能力和亞鐵離子螯合能力，且無溶血性，彭澤鯽飼喂實驗無病魚死魚現象，生物安全性較好。本實驗室通過對天然發(fā)酵食品來源的貝萊斯芽孢桿菌PJP10進行了益生潛力評價和抗氧化活性分析，拓寬了貝萊斯芽孢桿菌的研究方向，為該菌在食品領域開發(fā)和應用提供了研究基礎。