在黑果腺肋花楸中共發(fā)酵里氏木霉和綠色木霉生產(chǎn)木聚糖酶

袁亞峰，姜秋實(shí)，程志強(qiáng)

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春，130118)

木聚糖酶能夠降解木聚糖，在造紙[1]、木質(zhì)纖維材料生物轉(zhuǎn)化以及果汁澄清[2]等方面有著廣泛的應(yīng)用。目前研究表明，除了動(dòng)物和植物，許多細(xì)菌和真菌都可以產(chǎn)生木聚糖酶，但是不同微生物生產(chǎn)的木聚糖酶性質(zhì)有所差別，細(xì)菌生產(chǎn)的主要是酸性木聚糖酶[3]，真菌生產(chǎn)的大都是堿性木聚糖酶[4]。微生物發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶具有經(jīng)濟(jì)性好，對(duì)生產(chǎn)設(shè)備、場(chǎng)地要求簡(jiǎn)單等諸多優(yōu)勢(shì)，因而是目前規(guī)?；a(chǎn)木聚糖的主要方法。

木霉菌是能產(chǎn)生多種酶類(lèi)的絲狀真菌，其中最主要的是木聚糖酶[5]和纖維素酶[6]等。國(guó)內(nèi)外對(duì)木霉菌發(fā)酵產(chǎn)生木聚糖酶的研究較多。里氏木霉和綠色木霉生長(zhǎng)周期短，產(chǎn)木聚糖酶的時(shí)間短，對(duì)環(huán)境要求低，是規(guī)?；a(chǎn)木聚糖酶的理想真菌。但是單一菌株生產(chǎn)木聚糖酶存在產(chǎn)酶時(shí)間長(zhǎng)、酶系組成單一、產(chǎn)酶量低等問(wèn)題。利用混合發(fā)酵可以有效地解決上述問(wèn)題并提高酶的活力。GUTIERREZ-CORREA等[7]利用里氏木霉與黑曲霉或海棗曲霉共培養(yǎng)，在甘蔗渣上進(jìn)行固體基質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶。鄒水洋等[8]發(fā)現(xiàn)較單獨(dú)培養(yǎng)康寧木霉相比，康寧木霉與米根霉混合培養(yǎng)形成了相互促進(jìn)的共生關(guān)系，有效地提高了纖維素酶和木聚糖酶的酶活力。BALDRIAN[9]將哈茨木霉添加到白腐菌培養(yǎng)物中使漆酶活性增加40倍以上。但是真菌共發(fā)酵生產(chǎn)酶仍然面臨許多挑戰(zhàn)和尚未解決的問(wèn)題，特別是真菌之間的分子相互作用以及由此產(chǎn)生的酶優(yōu)化問(wèn)題。但是目前共培養(yǎng)仍然是工業(yè)酶生產(chǎn)的一個(gè)發(fā)展領(lǐng)域，在實(shí)際應(yīng)用之前，該技術(shù)的培養(yǎng)方面需要進(jìn)一步改進(jìn)。

木聚糖酶是一種誘導(dǎo)酶，選擇適合的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件會(huì)促進(jìn)木霉菌產(chǎn)木聚糖酶。目前，為了降低木聚糖酶的生產(chǎn)成本，一般都是利用秸稈[10]、麩皮、玉米芯、稻草[11]等農(nóng)業(yè)廢棄物作為主要基質(zhì)，里氏木霉[12]、綠色木霉、哈茨木霉[13]等真菌進(jìn)行發(fā)酵，多為固態(tài)發(fā)酵技術(shù)。由于固體發(fā)酵存在參數(shù)難控制，無(wú)法均勻混合，造成部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的浪費(fèi)、回收成本高等問(wèn)題，導(dǎo)致難以工業(yè)化生產(chǎn)木聚糖酶。農(nóng)業(yè)廢棄物作為原料，使用易于大量生產(chǎn)的液體發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)木聚糖酶的產(chǎn)量低[10]。為了提高農(nóng)業(yè)廢棄物生產(chǎn)木聚糖酶的產(chǎn)量，大都需要使用酸、堿等物質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理，在提高木聚糖酶的產(chǎn)量的同時(shí)，預(yù)處理步驟提高了生產(chǎn)的成本，造成環(huán)境污染[14]。而以果渣作為碳源，使用液體發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)木聚糖酶產(chǎn)量高[4]，同時(shí)還利用了廢棄果渣，避免了資源的浪費(fèi)。黑果腺肋花楸在東北地區(qū)生長(zhǎng)范圍廣，產(chǎn)量高，主要在工業(yè)上加工成果汁[15]，產(chǎn)生大量果渣。果渣質(zhì)量分?jǐn)?shù)占未加工生漿果的16%，其中纖維含量約為60 g/100 g，這些纖維大多是不溶性纖維，無(wú)法得到合理利用[16]。綜上可知，黑果腺肋花楸果渣作為木霉菌發(fā)酵的碳源用于生產(chǎn)木聚糖酶是合理利用黑果腺肋花楸的有效途徑。

本文在液體深層發(fā)酵條件下，以廢棄的黑果腺肋花楸果渣作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，利用黑果腺肋花楸果渣豐富的纖維素和木質(zhì)素作為碳源，誘導(dǎo)里氏木霉和綠色木霉共發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶，并通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，促進(jìn)木霉菌低成本發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶，為工業(yè)化生產(chǎn)木聚糖酶提供有效的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

1.1.1 菌種

里氏木霉(ATCC 24449)，瑞楚生物科技有限公司微生物菌種保藏中心；綠色木霉(ACCC 30206)，中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)，上海博微生物科技有限公司。

將綠色木霉和里氏木霉經(jīng)過(guò)活化后分別接種PDA上，在28 ℃下培養(yǎng)3 d。用無(wú)菌水分別將PDA上的孢子沖洗下來(lái)后，得到里氏木霉孢子液和綠色木霉孢子液，分別使用血球計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)后，稀釋到106CFU/mL，并于4 ℃儲(chǔ)存，備用。

1.1.2 試劑

1.00%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))木聚糖溶液按照馮培勇等[17]的方法配制；DNS試劑參考MILLER等[18]的方法配制。

1.1.3 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

黑果腺肋花楸(長(zhǎng)白山)的果實(shí)經(jīng)采摘后烘干，打粉，并過(guò)50目篩，得到黑果腺肋花楸果渣(后稱(chēng)果渣)，儲(chǔ)存?zhèn)溆?。果渣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%，pH值自然(pH 3.56)，置于錐形瓶中，121 ℃滅菌30 min。

10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))綠色木霉和里氏木霉孢子混合液(1×106CFU/mL，里氏木霉與綠色木霉按1∶1混合)接入已滅菌的培養(yǎng)基，28 ℃空氣浴搖床(160 r/min)培養(yǎng)1 d。

1.1.4 粗酶液的制備

通過(guò)液體深層發(fā)酵后，將培養(yǎng)基使用4層紗布初步過(guò)濾后，使用20 mL檸檬酸緩沖溶液沖洗后，得到的液體使用魏瑛等[19]的方法制備粗酶液。

1.2 測(cè)試方法

通過(guò)BAILEY等[20]的方法測(cè)定培養(yǎng)基中木聚糖酶的活性。將1.5 mL 1.00%木聚糖溶液置于50 ℃水浴鍋中預(yù)熱2 min，吸取0.5 mL使用檸檬酸緩沖溶液稀釋后的粗酶液加入木聚糖溶液中，立即計(jì)時(shí)，準(zhǔn)確反應(yīng)30 min后，迅速加入3 mL DNS試劑終止反應(yīng)。然后在沸水浴中顯色5 min，取出后用去離子水定容到50 mL，搖勻，冷卻，于550 nm測(cè)定吸光度值。空白對(duì)照：先向木聚糖溶液中加入DNS試劑，置于沸水浴中，隨后加入稀釋酶液，按上述方法測(cè)定。

1.3 不同培養(yǎng)條件對(duì)木聚糖酶產(chǎn)量的影響

在1.1.3所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的條件下，通過(guò)單因素試驗(yàn)分別探究氮源、接種質(zhì)量分?jǐn)?shù)、里氏木霉和綠色木霉的質(zhì)量比例、果渣質(zhì)量分?jǐn)?shù)、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基初始pH對(duì)木聚糖酶產(chǎn)量的影響。氮源包括賴(lài)氨酸、精氨酸、NaNO3、胰蛋白胨、NH4NO3、尿素、酵母提取物。綠色木霉接種質(zhì)量分?jǐn)?shù)設(shè)定為6%～16%，接種質(zhì)量比例(里氏木霉與綠色木霉的質(zhì)量比例)設(shè)定為5∶0，4∶1，3∶2，2∶3，1∶4，0∶5，果渣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14%～24%，培養(yǎng)時(shí)間設(shè)定為1～7 d，酸堿度設(shè)定為4.00～6.50。

1.4 正交優(yōu)化里氏木霉和綠色木霉共發(fā)酵的培養(yǎng)基

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，NH4NO3是里氏木霉和綠色木霉共發(fā)酵的培養(yǎng)基的最佳氮源；最佳培養(yǎng)時(shí)間為3 d；里氏木霉與綠色木霉的最佳質(zhì)量比例為3∶2。對(duì)氮源質(zhì)量濃度、果渣質(zhì)量分?jǐn)?shù)、接種質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH 4個(gè)培養(yǎng)條件進(jìn)行四因素三水平L9(34)正交試驗(yàn)，并測(cè)定木聚糖酶的活性，以確定不同條件相互組合的效果，并確定里氏木霉和綠色木霉共發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基，因素水平見(jiàn)表1。

表1 培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Orthogonal experiment factor level of culture conditions

1.5 無(wú)機(jī)離子對(duì)木聚糖酶產(chǎn)量的影響

為測(cè)定無(wú)機(jī)離子對(duì)木聚糖酶活性的影響，分別將MgSO4(0、3、6、9、12、15、18、21 mg/L)、FeSO4(0、3、6、9、12、15、18、21 mg/L)、MnSO4(1、1.4、1.8、2.2、2.6、3.0、3.4 mg/L)、ZnCl2(0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2、3.6 mg/L)、CoCl2(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/L)添加到培養(yǎng)基中，里氏木霉和綠色木霉共發(fā)酵后測(cè)定培養(yǎng)基中木聚糖酶活性，探究無(wú)機(jī)離子對(duì)木聚糖酶產(chǎn)量的影響。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(analysis of variance，ANOVA)進(jìn)行評(píng)估，圖中不同字母表示顯著差異(P<0.001)。每組實(shí)驗(yàn)3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 氮源種類(lèi)對(duì)木聚糖酶活性的影響

氮源用于構(gòu)成菌體細(xì)胞物質(zhì)，木聚糖酶的合成受氮源種類(lèi)和性質(zhì)的影響非常大。本研究為了選取最適合木霉菌產(chǎn)木聚糖酶的氮源，在培養(yǎng)基中添加相同氮濃度的氮源。由圖1-a可知，較未添加氮源的培養(yǎng)基相比，添加賴(lài)氨酸、精氨酸、NaNO3、胰蛋白胨、NH4NO3、尿素、酵母提取物7種氮源到培養(yǎng)基培養(yǎng)6 d后，木聚糖酶的活性顯著增加(P<0.001)。添加酵母提取物、蛋白胨、NH4NO3后，培養(yǎng)基中木聚糖酶的活性最高，分別為83.30、83.35、84.19 U/mL。考慮到培養(yǎng)基的成本及木聚糖酶的產(chǎn)量，選擇NH4NO3作為發(fā)酵的氮源。

2.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)木聚糖酶活性的影響

兩菌共發(fā)酵時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間通常會(huì)對(duì)發(fā)酵結(jié)果造成一定的影響。圖1-b反映了接入里氏木霉與綠色木霉后一周內(nèi)粗酶液中木聚糖酶的活性變化情況。隨著時(shí)間的增加，木聚糖酶的活性呈現(xiàn)先增加然后趨于平緩的趨勢(shì)。發(fā)酵4 d及以后，隨著時(shí)間的增加，木聚糖酶活性增加的不明顯。所以，接種后培養(yǎng)4 d為里氏木霉與綠色木霉共發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的最佳培養(yǎng)時(shí)間，木聚糖酶活性為83.14 U/mL。

2.3 接種質(zhì)量比例對(duì)木聚糖酶活性的影響

適合的接種質(zhì)量比例有助于在共發(fā)酵培養(yǎng)基中促進(jìn)里氏木霉和綠色木霉達(dá)到最佳共生狀態(tài)，促進(jìn)木聚糖酶的產(chǎn)生。如圖1-c所示，里氏木霉和綠色木霉按照不同質(zhì)量比接種后，發(fā)酵樣品中木聚糖酶的活性顯著變化(P<0.001)。當(dāng)里氏木霉和綠色木霉接種質(zhì)量比為3∶2時(shí)，溶液中木聚糖酶的活性最高，為85.36 U/mL。接種質(zhì)量比例為5∶0，即只接種里氏木霉時(shí)，木聚糖酶活性為82.25 U/mL。而接種質(zhì)量比例為4∶1時(shí)，培養(yǎng)基中里氏木霉在發(fā)酵初期吸收營(yíng)養(yǎng)及繁殖的能力強(qiáng)于綠色木霉，會(huì)迅速成為優(yōu)勢(shì)菌種，進(jìn)一步限制綠色木霉的生長(zhǎng)和繁殖，不利于2種菌共同發(fā)揮作用促進(jìn)木聚糖酶的產(chǎn)生，但是綠色木霉的加入在一定程度上也會(huì)增加木聚糖酶的產(chǎn)量。當(dāng)里氏木霉和綠色木霉接種質(zhì)量比為2∶3時(shí)，由于里氏木霉和綠色木霉對(duì)營(yíng)養(yǎng)及氧氣的競(jìng)爭(zhēng)及2株菌之間的拮抗作用，導(dǎo)致里氏木霉和綠色木霉的生長(zhǎng)緩慢，木聚糖酶的活性最小，為82.73 U/mL。而綠色木霉質(zhì)量比例越來(lái)越高時(shí)，綠色木霉菌大量繁殖，不利于里氏木霉生長(zhǎng)和代謝，所以溶液中木聚糖酶的活性增加，卻少于接種質(zhì)量比為3∶2時(shí)。綜上，可能是由于里氏木霉和綠色木霉接種質(zhì)量比為3∶2時(shí)，混合菌達(dá)到了一種良好的共生狀態(tài)，相互促進(jìn)彼此的生長(zhǎng)，增加了木聚糖酶的產(chǎn)量。

a-氮源；b-培養(yǎng)時(shí)間；c-接種質(zhì)量比圖1 氮源、培養(yǎng)時(shí)間和接種質(zhì)量比例對(duì)木聚糖酶活性的影響Fig.1 Effect of nitrogen source, culture time, and inoculated ratio on the xylanase activity

2.4 pH對(duì)木聚糖酶活性的影響

pH能夠改變微生物細(xì)胞膜的電荷屬性和培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度，從而促進(jìn)微生物吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力發(fā)生改變，對(duì)里氏木霉與綠色木霉的生長(zhǎng)和產(chǎn)木聚糖酶具有很大影響。圖2-a反映了隨著pH的增加(4.00～6.50)，木聚糖酶活性呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)(P<0.001)。當(dāng)培養(yǎng)基中pH為5.50時(shí)，培養(yǎng)基溶液中木聚糖酶活性最高，達(dá)到82.71 U/mL,與基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比，木聚糖酶產(chǎn)量增加了10.15%。當(dāng)培養(yǎng)基中pH<5.50時(shí)，隨著pH的增加，木聚糖酶的活性逐漸升高。pH>5.50后，木聚糖酶的活性隨著pH值的升高而降低。XIANG等[21]的研究表明，pH值5～6能夠有效地影響細(xì)胞膜所帶的電荷，使培養(yǎng)基中有機(jī)化合物分子很容易地進(jìn)入細(xì)胞，從而促進(jìn)細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，加快木聚糖酶的合成，使木聚糖酶的活性較其他pH值條件下更穩(wěn)定。

a-pH；b-氮源濃度;c-果渣質(zhì)量分?jǐn)?shù)；d-接種質(zhì)量分?jǐn)?shù)圖2 培養(yǎng)條件對(duì)木聚糖酶活性的影響Fig.2 Effect of culture conditions on the xylanase activity

2.5 氮源濃度對(duì)木聚糖酶活性的影響

為了節(jié)約氮源的使用，提高木聚糖酶活性，測(cè)試了在培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量濃度氮源對(duì)里氏木霉和綠色木霉共發(fā)酵產(chǎn)生木聚糖酶的影響(圖2-b)。隨著氮源質(zhì)量濃度的增加，木聚糖酶活性先增加后減少(P<0.001)，當(dāng)?shù)促|(zhì)量濃度為0.4 g/L時(shí)，木聚糖酶的活性最高，達(dá)95.31 U/mL，與基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比，木聚糖酶產(chǎn)量增加了26.93%。當(dāng)?shù)促|(zhì)量濃度<0.4 g/L時(shí)，木霉菌由于氮源不足，生長(zhǎng)緩慢，不利于酶的合成。當(dāng)?shù)促|(zhì)量濃度過(guò)高，木霉菌快速生長(zhǎng)，培養(yǎng)基中溫度過(guò)高，導(dǎo)致木聚糖酶合成水平下降。

2.6 果渣質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)木聚糖酶活性的影響

如圖2-c所示，隨著果渣質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，木聚糖酶的活性呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)(P<0.001)。當(dāng)果渣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%時(shí)，木聚糖酶活性最高，達(dá)到78.15 U/mL。當(dāng)果渣質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時(shí)，培養(yǎng)基中碳源質(zhì)量濃度太低導(dǎo)致木聚糖酶產(chǎn)量降低。當(dāng)果渣質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高時(shí)，培養(yǎng)基中水含量較少，里氏木霉和綠色木霉無(wú)法分散利用大量的碳源，且大量微生物聚集生長(zhǎng)導(dǎo)致培養(yǎng)基中溫度過(guò)高，溶解氧的濃度太低，菌體對(duì)水分及溶解氧的競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致木聚糖酶產(chǎn)量降低。

2.7 接種質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)木聚糖酶活性的影響

如圖2-d所示，隨著接種質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，木聚糖酶的活性表現(xiàn)為先增加后減少的趨勢(shì)(P<0.001)。當(dāng)接種質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%時(shí)，木聚糖酶的活性最高，達(dá)到78.00 U/mL。當(dāng)接種質(zhì)量分?jǐn)?shù)<12%時(shí)，生物量過(guò)低，使產(chǎn)酶周期延長(zhǎng)，產(chǎn)酶量降低。當(dāng)接種質(zhì)量分?jǐn)?shù)>12%時(shí)，發(fā)酵前期菌體生長(zhǎng)過(guò)快，造成培養(yǎng)基中溶解氧水平不足，且大量微生物生長(zhǎng)導(dǎo)致培養(yǎng)基中局部溫度過(guò)高，從而使產(chǎn)酶量下降。

2.8 正交優(yōu)化里氏木霉和綠色木霉共發(fā)酵的培養(yǎng)基

里氏木霉和綠色木霉共發(fā)酵培養(yǎng)基的正交試驗(yàn)與方差分析結(jié)果見(jiàn)表2、表3。從表2中的極差分析可知，里氏木霉和綠色木霉共發(fā)酵的培養(yǎng)基最佳條件是A3B3C3D2，即氮源0.5 g/L，果渣質(zhì)量分?jǐn)?shù)35%，接種質(zhì)量分?jǐn)?shù)14%，pH 5.50。正交試驗(yàn)中最佳培養(yǎng)基條件為A3B1C3D2，即氮源0.5 g/L，果渣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%，接種質(zhì)量分?jǐn)?shù)14%，pH 5.50。對(duì)A3B3C3D2和A3B1C3D2兩組培養(yǎng)條件進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明A3B1C3D2條件下木聚糖酶的活性更高，為121.62 U/mL，與第7組實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似(表2)。所以里氏木霉和綠色木霉共發(fā)酵的培養(yǎng)基最佳條件是氮源0.5 g/L，果渣質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%，接種質(zhì)量分?jǐn)?shù)14%，pH 5.50。

對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析(表3)，在里氏木霉和綠色木霉共發(fā)酵工藝正交試驗(yàn)所選擇的因素和水平范圍內(nèi)，因素A、B、C和D的影響均達(dá)到了極顯著性水平(P<0.001)，即氮源質(zhì)量濃度、果渣質(zhì)量分?jǐn)?shù)、接種質(zhì)量分?jǐn)?shù)和pH均對(duì)培養(yǎng)基中木聚糖酶的活性有顯著影響。從表2的極差分析可知，各因素對(duì)里氏木霉和綠色木霉共發(fā)酵培養(yǎng)基溶液中木聚糖酶的活性影響的主次順序?yàn)榈促|(zhì)量濃度(A)>pH(D)>接種質(zhì)量分?jǐn)?shù)(C)>果渣質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)。

表2 培養(yǎng)基條件的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental results of the medium conditions

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance results

2.9 無(wú)機(jī)離子對(duì)木聚糖酶產(chǎn)量的影響

如圖3所示，添加CoCl2，F(xiàn)eSO4，MgSO4，MnSO4，ZnCl2后，隨著無(wú)機(jī)離子濃度的增加，木聚糖酶活性均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。添加低濃度CoCl2后，木聚糖酶活性顯著增加。當(dāng)CoCl2質(zhì)量濃度為1 mg/L時(shí)，木聚糖酶活性最高，為77.57 U/mL。繼續(xù)添加CoCl2后，會(huì)抑制木聚糖酶的產(chǎn)生。只有FeSO4質(zhì)量濃度為12～15 mg/L時(shí)，添加FeSO4才會(huì)提高木聚糖酶的產(chǎn)量，木聚糖酶活性分別為75.35和76.65 U/mL。FeSO4濃度太低或者太高時(shí)都會(huì)抑制木聚糖酶的活性。添加少量的MgSO4會(huì)促進(jìn)木聚糖酶的產(chǎn)生，當(dāng)MgSO4質(zhì)量濃度為12 mg/L時(shí)，木聚糖酶的活性最高，為80.79 U/mL。當(dāng)MgSO4質(zhì)量濃度高于15 mg/L時(shí)，MgSO4的添加會(huì)抑制木聚糖酶的產(chǎn)生。當(dāng)MnSO4質(zhì)量濃度為1.4 mg/L時(shí)，木聚糖酶的活性最高，達(dá)84.74 U/mL。繼續(xù)添加MnSO4，木聚糖酶活性逐漸降低，當(dāng)MnSO4質(zhì)量濃度高于3 mg/L時(shí)，MnSO4的添加會(huì)抑制木聚糖酶的產(chǎn)生。當(dāng)ZnCl2質(zhì)量濃度<1.6 mg/L時(shí)，培養(yǎng)基溶液中木聚糖酶的活性均高于未添加時(shí)木聚糖酶的活性，分別為75.27、75.87和76.56 U/mL。當(dāng)ZnCl2質(zhì)量濃度高于1.6 mg/L時(shí)，木聚糖酶的活性逐漸降低，且培養(yǎng)基溶液中木聚糖酶的活性均低于未添加ZnCl2時(shí)木聚糖酶的活性，ZnCl2的添加抑制了里氏木霉和綠色木霉共發(fā)酵產(chǎn)生木聚糖酶。由于MgSO4和MnSO4的添加對(duì)木聚糖酶產(chǎn)量的影響相對(duì)于其他3種離子的影響較大，為了節(jié)約資源以及簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)，所以在培養(yǎng)基中添加12 mg/L MgSO4和1.4 mg/L MnSO4。

a-CoCl2；b-FeSO4；c-MgSO4；d-MnSO4；e-ZnCl2圖3 無(wú)機(jī)離子對(duì)木聚糖酶活性的影響Fig.3 The effect of inorganic ions on the xylanase activity

結(jié)合正交試驗(yàn)的結(jié)果，里氏木霉和綠色木霉共發(fā)酵產(chǎn)生木聚糖酶的最佳培養(yǎng)基為氮源(NH4NO3)質(zhì)量濃度0.5 g/L，果渣質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%，里氏木霉與綠色木霉的質(zhì)量比例3∶2，接種質(zhì)量分?jǐn)?shù)14%，pH 5.50，并添加12 mg/L MgSO4和1.4 mg/L MnSO4，28 ℃下培養(yǎng)4 d。在最優(yōu)培養(yǎng)基條件下重復(fù)培養(yǎng)3次，培養(yǎng)基溶液中木聚糖酶活性達(dá)(127.25±0.09) U/mL，與基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比，木聚糖酶產(chǎn)量增加了69.46%。

3 結(jié)論

木聚糖酶為誘導(dǎo)性酶，選擇合適培養(yǎng)基底物和最佳的培養(yǎng)基組成很關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)以黑果腺肋花楸作為主要培養(yǎng)基原料，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，優(yōu)化了里氏木霉和綠色木霉共發(fā)酵黑果腺肋花楸生產(chǎn)木聚糖酶的培養(yǎng)基，并探究了添加無(wú)機(jī)離子對(duì)木聚糖酶產(chǎn)量的影響。

方差分析結(jié)果表明對(duì)木聚糖酶的活性影響的主次順序?yàn)榈礉舛?A)>pH(D)>接種質(zhì)量分?jǐn)?shù)(C)>果渣質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)。極差分析表明最佳培養(yǎng)條件為A3B3C3D2，但正交試驗(yàn)中最佳條件是A3B1C3D2與極差分析結(jié)果不同。對(duì)A3B3C3D2和A3B1C3D2兩組條件進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，A3B1C3D2條件下木聚糖酶的活性更高，為121.62 U/mL，所以里氏木霉和綠色木霉共發(fā)酵黑果腺肋花楸生產(chǎn)木聚糖酶的最佳培養(yǎng)條件為A3B1C3D2，即氮源(NH4NO3)質(zhì)量濃度0.5 g/L，果渣質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%，里氏木霉與綠色木霉的質(zhì)量比例3∶2，接種質(zhì)量分?jǐn)?shù)14%，pH 5.50，培養(yǎng)4 d。CoCl2，F(xiàn)eSO4，MgSO4，MnSO4，ZnCl2分別在添加1、15、12、1.4和1.6 mg/L時(shí)效果最佳，過(guò)多或者過(guò)少的無(wú)機(jī)離子都會(huì)抑制木聚糖酶的產(chǎn)生。但是MgSO4和MnSO4對(duì)里氏木霉和綠色木霉共發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響高于CoCl2，F(xiàn)eSO4和ZnCl2。為了降低實(shí)驗(yàn)成本以及簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟，選擇添加量是MgSO4為12 mg/L和MnSO4為1.4 mg/L。在上述條件下28 ℃培養(yǎng)4 d后木聚糖酶的活性高達(dá)(127.25±0.09) U/mL，與基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比，木聚糖酶產(chǎn)量增加了69.46%。