滲透壓對黑曲霉菌絲形態(tài)和葡萄糖氧化酶活力的影響

任文強(qiáng)，張鎮(zhèn)松，李春震，李潔，李紅華*

1(中國科學(xué)院 生態(tài)環(huán)境研究中心，北京，100085)2(北京化工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京，100029)

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，EC 1.1.3.4 GOD)是一種二聚體的蛋白酶，可以高度專一地催化β-D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸，同時生成過氧化氫[1-2]。GOD最早在黑曲霉的無細(xì)胞培養(yǎng)液中被發(fā)現(xiàn)，并由MULLER進(jìn)行了報道[3]。在隨后的研究中，多種微生物培養(yǎng)液都檢測到GOD，并且以曲霉屬和青霉屬為主，近年來基因工程技術(shù)的發(fā)展，也有助于高產(chǎn)GOD菌株的培育[4]。20世紀(jì)70年代，我國成立研究協(xié)作組，對GOD開展系統(tǒng)深入研究，內(nèi)容涉及到菌種選育、發(fā)酵工藝優(yōu)化、酶的分離純化以及特性研究等[5]。GOD在食品工業(yè)、畜禽養(yǎng)殖業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用[6]。

多種動物、植物、昆蟲、紅藻和微生物的體內(nèi)都有GOD存在，而微生物(黑曲霉屬和青霉菌屬)具有生長繁殖快、成本低等優(yōu)勢，常被用作GOD發(fā)酵生產(chǎn)的主要菌種[7]。黑曲霉(Aspergillusniger)滿足美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)在食品工業(yè)中的安全性要求[5]，并且我國農(nóng)業(yè)部在2013年12月發(fā)布的《飼料添加劑品種目錄(2013)》中，明確了飼料中的GOD可以使用青霉和黑曲霉進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)[8]。在過去的幾十年里，黑曲霉常被用于制醬、釀酒、制醋、抗生素、生產(chǎn)酶制劑和有機(jī)酸等有價值的生化產(chǎn)品的生產(chǎn)中[9]。

黑曲霉絲狀真菌是一種形態(tài)復(fù)雜的微生物，在整個生命周期中會表現(xiàn)出不同的生長形式：高度游離的菌絲、菌絲纏繞緊密的顆粒球和菌絲發(fā)散的菌絲團(tuán)[10]。不同的菌絲形態(tài)有利于不同發(fā)酵產(chǎn)物的積累，如菌絲顆粒球形態(tài)適宜生產(chǎn)糖化酶，發(fā)散菌絲團(tuán)適于生產(chǎn)檸檬酸[11]。除了菌體自身的特性之外，許多環(huán)境因素也會影響真菌的形態(tài)，比如孢子接種量和pH的調(diào)整，會影響菌體的群體效應(yīng)，有效控制黑曲霉的生長特征[12]；溶氧系數(shù)和攪拌條件的改變，可以控制菌絲球的結(jié)構(gòu)，增加發(fā)酵效率[13]。這些培養(yǎng)條件的調(diào)整都會間接導(dǎo)致滲透壓的改變，但是直接研究外部滲透壓對真菌菌絲形態(tài)影響的報道還很少。因此，本文深入研究了培養(yǎng)基中不同種類的底物所產(chǎn)生的滲透壓對菌絲體形態(tài)的影響，通過光學(xué)顯微鏡的圖像分析，得到了滲透壓和絲狀真菌形態(tài)之間的關(guān)系，采用分光光度法測定了不同滲透壓下葡萄糖氧化酶的活力。

1 材料與方法

1.1 菌株

黑曲霉(Aspergillusniger)FF11-01，為實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.2 培養(yǎng)基成分與試劑

合成培養(yǎng)基組成(g/L)：葡萄糖 25，KCl 0.2，KH2PO40.15，MgSO4·7H2O 0.24，(NH4)2HPO40.6，酵母膏 3.0，蛋白胨4.0，瓊脂 20。吖啶橙染色劑、鄰聯(lián)茴香胺、辣根過氧化物酶、GOD標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司。磷酸鈉緩沖液、葡萄糖、鹽酸(均為分析純)，國藥集團(tuán)。

1.3 主要儀器設(shè)備

SW-CJ標(biāo)準(zhǔn)潔凈工作臺，蘇凈集團(tuán)安泰空氣技術(shù)有限公司；STY-1A型滲透壓測定儀，天大天發(fā)科技有限公司；SW-CJ-1F回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜，上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司；501型恒溫水浴鍋，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；7200型分光光度計，尤尼柯上海儀器有限公司；DM-500型光學(xué)顯微鏡，徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司。

1.4 發(fā)酵培養(yǎng)

使用合成培養(yǎng)基在30 ℃下培養(yǎng)72 h，以保證孢子懸浮液濃度達(dá)到107孢子/mL?；罨蟮暮谇规咦右恨D(zhuǎn)移至盛有100 mL底液的500 mL三角瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，接種量5%(體積分?jǐn)?shù))，溫度30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速220 r/min，培養(yǎng)時間48 h。菌體外部滲透壓通過滲透壓測定儀測定，并采用生理鹽水作為對照組。

1.5 酶活力測定方法

根據(jù)葡萄糖氧化酶的催化反應(yīng)機(jī)制，酶活力的測定主要有以下3種方法：電化學(xué)法[14]、滴定法[15]和分光光度法[16]。分光光度法樣品處理簡便，反應(yīng)時間短，滿足快速實(shí)驗(yàn)的要求，是目前最普遍使用的酶活力測定方法。利用鄰聯(lián)茴香胺作為顯色供體，待測樣品的吸光值可以反映GOD酶活力的大小，且該方法得到了眾多科研工作者的認(rèn)可[16-18]。

1單位量的GOD指的是在25 ℃、pH 6.0條件下每分鐘氧化1 μmol葡萄糖需要的酶量。反應(yīng)液的體積為300 μL，其中包括20 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 6.0)、0.7 mmol/L 鄰聯(lián)茴香胺、100 mmol/LD-葡萄糖、20 μg/L辣根過氧化物酶和20 μL待測樣品。微體系在25 ℃下反應(yīng)10 min，用等體積的4 mol/L鹽酸溶液停止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后的上清液測定波長540 nm的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到葡萄糖氧化酶的活力[16]。

1.6 吖啶橙染色和菌絲形態(tài)觀察

將待測樣品與96%的乙醇混合，80 ℃條件下，混合液在顯微鏡的載玻片上固定1 h，再用吖啶橙溶液染色[19]，蒸餾水清洗多余的染色劑，并在室溫下干燥。使用DM-500型光學(xué)顯微鏡觀察黑曲霉的菌絲形態(tài)，經(jīng)吖啶橙染色后，核糖核酸(RNA)豐富區(qū)和貧乏區(qū)，分別會表現(xiàn)出橘黃色和綠色[20]。

2 結(jié)果與討論

2.1 滲透壓對黑曲霉生長形態(tài)的影響

能源物質(zhì)在微生物發(fā)酵培養(yǎng)過程中起到了至關(guān)重要的作用，選取葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油和聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)作為碳源[21]，NaCl為對照，探討了滲透壓對黑曲霉生長形態(tài)的影響。以質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%的生理鹽水模擬菌體內(nèi)環(huán)境，產(chǎn)生的滲透壓值OS為 287.28 mOsmol/(kg·H2O)。由于基質(zhì)組分、溫度等因素，滲透壓測定值會出現(xiàn)一定范圍內(nèi)的波動，較難推算出準(zhǔn)確的碳源濃度，因此以葡萄糖梯度增長的濃度值作為參考，對不同底物的滲透壓(OT)進(jìn)行了測定，結(jié)果見表1?？梢园l(fā)現(xiàn)，對于每一種底物而言，滲透壓與濃度都會呈現(xiàn)出明顯的正相關(guān)性，并且同一濃度不同底物會表現(xiàn)出差異性的結(jié)果。因此，液體培養(yǎng)基的滲透壓可以通過添加不同種類和劑量的底物來控制。

表1 不同培養(yǎng)基底物引起的滲透壓變化Table 1 Osmotic pressures by different compounds in substrate

參考表1中的滲透壓，以葡萄糖作為底物碳源，黑曲霉生長過程中菌體呈現(xiàn)出了圖1-a～1-f的多種形態(tài)。當(dāng)培養(yǎng)基滲透壓為900.71 mOsmol/(kg·H2O)時，黑曲霉菌絲團(tuán)開始逐漸形成，繼續(xù)增大滲透壓菌絲會出現(xiàn)明顯的擴(kuò)散現(xiàn)象。此外，其他5種底物的培養(yǎng)過程呈現(xiàn)出了圖1-g～x的多種形態(tài)，可以發(fā)現(xiàn)無論在哪種底物實(shí)驗(yàn)中，黑曲霉在低濃度的劑量下都會呈現(xiàn)出菌絲纏繞的顆粒球狀的生長形態(tài)，而隨著濃度的增加，會向著發(fā)散的菌絲團(tuán)狀轉(zhuǎn)變。除聚乙二醇(PEG)外，其他5種底物滲透壓大于2 000 mOsmol/(kg·H2O)時，菌落數(shù)量明顯下降，出現(xiàn)了畸形生長甚至死亡的現(xiàn)象。在90 g/L NaCl的平板培養(yǎng)基中(圖1-x)，未發(fā)現(xiàn)存活的菌株，而同樣高滲透壓(OT/OS=10.40)條件下，500 g/L蔗糖平板中(圖1-l)，卻有少量的絲狀菌體生長，這可能是因?yàn)檎崽强梢宰鳛樘荚从糜诤谇沟纳L，而NaCl卻不能作為能源物質(zhì)。這些結(jié)果說明黑曲霉在低滲透壓和高滲透壓下，會表現(xiàn)出菌絲纏繞的顆粒球狀和發(fā)散的菌絲團(tuán)狀的形態(tài)差異，可能也會進(jìn)一步影響到菌體的新陳代謝途徑[22]，導(dǎo)致葡萄糖氧化酶活力的改變。

a-20 g/L葡萄糖；b-100 g/L葡萄糖；c-200 g/L葡萄糖；d-300 g/L葡萄糖；e-400 g/L葡萄糖；f-500 g/L葡萄糖； g-20 g/L果糖；h-200 g/L果糖；i-500 g/L果糖；j-20 g/L蔗糖；k-200 g/L蔗糖；l-500 g/L蔗糖； m-20 g/L PEG；n-50 g/L PEG；o-80 g/L PEG；p-100 g/L PEG；q-200 g/L PEG；r-300 g/L PEG; s-20 g/L甘油；t-70 g/L甘油；u-200 g/L甘油；v-18 g/L NaCl；w-45 g/l NaCl；x-90 g/L NaCl圖1 滲透壓變化對黑曲霉形態(tài)的影響Fig.1 Effects of osmotic pressure changes on the morphology of Aspergillus niger

2.2 吖啶橙染色確定活性區(qū)域的分布

吖啶橙染色劑與單鏈的RNA和雙鏈的DNA相互作用時，會發(fā)出橘黃色和綠色的熒光。GOD等活性蛋白質(zhì)主要由單鏈RNA的翻譯合成，而吖啶橙可以鑒別出真菌微生物RNA的豐富區(qū)和貧乏區(qū)，因此可以確定出活性蛋白的分布區(qū)域。

選取濃度20和500 g/L葡萄糖培養(yǎng)的黑曲霉菌體，經(jīng)過吖啶橙染色可以明確區(qū)分菌體中的RNA豐富區(qū)(橘黃色)和RNA貧乏區(qū)(綠色)[20]。圖2和圖3分別展示了低滲透壓作用下菌絲纏繞的顆粒球狀和高滲透壓作用下發(fā)散菌絲團(tuán)狀的染色結(jié)果。低滲透壓作用下黃色熒光區(qū)域集中在球團(tuán)的外部邊緣，表明絲狀區(qū)域主要用來分泌GOD等活性蛋白，而球心綠色區(qū)域證實(shí)了菌體繁殖產(chǎn)生大量DNA的分布。高滲透壓作用下菌絲團(tuán)發(fā)散體積明顯膨脹，雖然活性區(qū)域仍然出現(xiàn)在絲狀的表面，但是貧乏區(qū)卻沒有明顯顯示效果。此外，溶解在培養(yǎng)基中游離的菌絲體上(圖3-d)沒有明顯的RNA豐富區(qū)和貧乏區(qū)的界限。由此可見，菌株形態(tài)的不同將會導(dǎo)致活性蛋白分布區(qū)域的不同，菌絲球芯越小，菌體的活性體積就越大。

2.3 葡萄糖調(diào)控滲透壓對菌體形態(tài)參數(shù)和GOD活力的影響

葡萄糖是黑曲霉培養(yǎng)的最佳碳源[5]，但是適宜的添加濃度以及相應(yīng)的滲透壓需要進(jìn)一步驗(yàn)證。表2總結(jié)了不同濃度葡萄糖控制的滲透壓導(dǎo)致菌體形態(tài)變化的參數(shù)。隨著滲透壓的增大，微球的直徑減小，相應(yīng)邊緣部位的菌絲長度增加。同時，菌絲體微球的數(shù)量也有明顯的增長。總表面積和總體積均呈現(xiàn)出了先下降后上升的趨勢，最低點(diǎn)出現(xiàn)在了滲透壓值OT/OS=3.13(質(zhì)量濃度為200 g/L)的實(shí)驗(yàn)組中，而值得注意的是，比表面積最大值也出現(xiàn)在該組實(shí)驗(yàn)中。結(jié)合本文之前得到滲透壓變化影響細(xì)胞形態(tài)的結(jié)論，可以進(jìn)一步確認(rèn)，滲透壓的增大會引起黑曲霉菌絲體生長形貌由大球團(tuán)狀向發(fā)散網(wǎng)狀的轉(zhuǎn)變。

a-×40，顆粒球狀；b-×100，顆粒球外層； c-×200，顆粒球外層；d-×200，顆粒球核心圖2 在低滲透壓下生長的顆粒球狀形態(tài)活性區(qū)域檢測Fig.2 Morphologically active regions of pellets grown of A.niger under low osmotic pressure

a-×40，發(fā)散菌絲團(tuán)狀；b-×100，絲狀外層； c-×200，絲狀外層；d-×200，培養(yǎng)基中游離菌絲圖3 在高滲透壓下生長的菌絲團(tuán)狀形態(tài)活性區(qū)域檢測Fig.3 Morphologically active regions of filamentous mass grown of A.niger under high osmotic pressure

表2 葡萄糖培養(yǎng)基控制的菌絲球團(tuán)參數(shù)Table 2 Summary of the key parameters of A.niger pellets obtained by different glucose concentration in substrate

圖4展示了與表2相應(yīng)梯度的葡萄糖濃度(相應(yīng)的滲透壓值列舉在表1中)對黑曲霉生物量和GOD活力的影響。經(jīng)過48 h的發(fā)酵培養(yǎng)，最低的GOD活力3.82 U/mL出現(xiàn)在滲透壓值OT/OS= 0.47實(shí)驗(yàn)組中，這可能是由于較低含量的葡萄糖不能為菌體生長和代謝提供充足的營養(yǎng)造成的。在滲透壓值OT/OS為3.13和4.64的實(shí)驗(yàn)組中，得到較高的GOD活力11.23和11.01 U/mL，菌體生物量為43.2和44.7 g/L，兩組實(shí)驗(yàn)的結(jié)果無明顯差異，為節(jié)約生產(chǎn)工藝的成本，選取200 g/L葡萄糖實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的參考依據(jù)。當(dāng)滲透壓值超過OT/OS=4.64時，菌絲體的生物量和GOD活力均呈現(xiàn)出明顯下降的趨勢。因此，葡萄糖不僅可以作為GOD基因轉(zhuǎn)錄的主要誘導(dǎo)劑，而且可以通過改變菌體形態(tài)來決定GOD的活力[23]。

圖4 不同滲透壓葡萄糖培養(yǎng)基的GOD活力和菌體生物量Fig.4 GOD activity and cell concentration of A. niger under different osmotic pressures regulated by glucose concentration in initial substrate

2.4 滲透壓對GOD活力影響

采用2種方法評估了滲透壓對GOD活力的影響，即不同濃度底物相似滲透壓實(shí)驗(yàn)和相同濃度底物不同滲透壓實(shí)驗(yàn)。

首先，確保滲透壓的一致性，以200 g/L葡萄糖產(chǎn)生的滲透壓900.71 mOsmol/(kg·H2O)為參考依據(jù)，底物中葡萄糖被果糖、蔗糖、甘油、PEG和NaCl替代后，5種替換底物的質(zhì)量濃度依次為100.0、200.0、70.0、200.0和18.0 g/L，相應(yīng)的滲透壓變化范圍在850～950 mOsmol/(kg·H2O)。通過分光光度法測定的GOD活力見圖5，果糖、蔗糖和甘油作為底物得到的GOD活力分別為 10.32、9.14和10.21 U/mL，與葡萄糖為底物的GOD活力最高值11.23 U/mL相比，大約下降了10%～20%，下降趨勢并不明顯，這也進(jìn)一步說明了發(fā)酵液滲透壓對菌絲體形態(tài)的影響是決定GOD活力的關(guān)鍵因素。然而，在PEG和NaCl為底物的實(shí)驗(yàn)中，GOD活力顯著下降，僅為3.29和0.48 U/mL，與葡萄糖為底物的GOD活力相比，分別下降了70.70%和95.73%。這可能是因?yàn)镻EG和NaCl對黑曲霉的代謝起到了嚴(yán)重的抑制作用[24]，這也與本文前面描述的菌體不能在高濃度NaCl培養(yǎng)基上生存相一致。

圖5 不同底物相似滲透壓培養(yǎng)的GOD活力Fig.5 GOD activity by A.niger under similar osmotic pressure maintained by different additions

其次，選取木糖、果糖和葡萄糖為底物，評估相同底物濃度控制的不同滲透壓對GOD活力的影響。底物中分別添加200 g/L的木糖、果糖和葡萄糖，得到滲透壓值依次為543.52、1 281.72和900.71 mOsmol/(kg·H2O)。如圖6所示，在木糖和果糖的實(shí)驗(yàn)組，GOD的活力僅為2.21和3.09 U/mL，而添加葡萄糖的實(shí)驗(yàn)組則表現(xiàn)出了較強(qiáng)的酶活力10.91 U/mL，大約提升了3～5倍。同時菌絲體生物量在葡萄糖作用下可以達(dá)到24.33 g/L，比木糖和果糖的實(shí)驗(yàn)組分別增加了59.87%和10.70%。這一現(xiàn)象與HATZINIKOLAOU等[23]報道的結(jié)果相一致，葡萄糖作為GOD轉(zhuǎn)錄基因的主要誘導(dǎo)物可能是造成這種顯著差異的主要原因。由此可見，培養(yǎng)基中的滲透壓對GOD的活力起到非常關(guān)鍵的控制作用。

圖6 相同濃度底物不同滲透壓培養(yǎng)的GOD活力Fig.6 GOD activity by A.niger using different carbon sources under different osmotic pressure

2.5 討論

黑曲霉自身生長特性與細(xì)菌和酵母不同，在液態(tài)發(fā)酵培育中傳質(zhì)和傳氧與菌體生長呈負(fù)相關(guān)性[25]。有研究表明，真菌生命周期中的顆粒化會導(dǎo)致培養(yǎng)基黏度的降低，進(jìn)而有助于底物混合效率和傳質(zhì)效果[26]，也有利于簡化下游的固液分離工藝流程。但是在顆粒球狀生長階段，由于質(zhì)量傳遞的局限性，微生物對溶解氧和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收受到抑制，會導(dǎo)致菌體內(nèi)部的自溶[27-29]。相比之下，在微球嵌入到絲狀真菌的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的生長階段，培養(yǎng)基的黏度會發(fā)生改變，菌絲吸收營養(yǎng)物質(zhì)的接觸面積將會增大[30]。

絲狀真菌在發(fā)酵培養(yǎng)過程中會呈現(xiàn)出菌絲球狀、發(fā)散網(wǎng)狀和游離絲狀的多種形態(tài)，形態(tài)學(xué)分析手段為控制菌絲特性，發(fā)酵液流變特性和代謝產(chǎn)物的研究提供了良好的依據(jù)。很多學(xué)者在黑曲霉產(chǎn)葡萄糖氧化酶的研究中，關(guān)注于常見工藝參數(shù)的優(yōu)化，如：培養(yǎng)基組成、pH、溫度、溶解氧和二氧化碳等[12]，這些因素都會間接影響菌體生長環(huán)境的滲透壓。本文通過直接控制滲透壓的方法，研究了黑曲霉菌絲體生長形態(tài)和GOD活力的變化。在一定滲透壓范圍內(nèi)，菌絲體呈現(xiàn)發(fā)散絲狀的生長形態(tài)并分泌較高活力的GOD。此項(xiàng)研究工作為GOD生產(chǎn)工藝放大和其他生物制品的發(fā)酵生產(chǎn)提供了參考依據(jù)。在今后的研究中，將以此為基礎(chǔ)繼續(xù)探究其他底物種類、pH、攪拌等引發(fā)的滲透壓改變對菌絲體形態(tài)和GOD活力的影響。

3 結(jié)論

培養(yǎng)基中的滲透壓會嚴(yán)重影響黑曲霉的生長形態(tài)和GOD活力。隨著滲透壓的增長，菌絲體形態(tài)呈現(xiàn)出了從菌絲纏繞的顆粒球狀向發(fā)散菌絲團(tuán)狀的轉(zhuǎn)變。吖啶橙染色的結(jié)果表明，RNA豐富的蛋白活性區(qū)域分布在絲狀形態(tài)中和顆粒球團(tuán)的外層上。菌絲體生長形態(tài)的改變會導(dǎo)致內(nèi)部代謝途徑的改變，進(jìn)而影響到GOD的活力。在200 g/L葡萄糖培養(yǎng)基中產(chǎn)生的滲透壓為900.71 mOsmol/(kg·H2O)，可以獲得最高的GOD活力(11.23 U/mL)。發(fā)酵工藝優(yōu)化研究中滲透壓參數(shù)通常被忽視，不同微生物對環(huán)境的適應(yīng)能力也存在著差異，在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中，穩(wěn)定適宜的滲透壓環(huán)境可以提高目標(biāo)物產(chǎn)量和增加經(jīng)濟(jì)效益。