趨化素樣因子超家族成員在腫瘤中的研究進展

謝剛 成婧 張俊萍

趨化素樣因子超家族成員（chemokine-like factorlike MARVEL transmembrane domain containing member/chemokine-like factor superfamily member, CMTM/CKLFSF）由北京大學人類疾病基因研究中心發(fā)現(xiàn)[1]，包括9個基因：CKLF和CMTM1-CMTM8（即CKLFSF1-CKLFSF8）。CKLF由四個外顯子組成，位于染色體16q22上，維持四種可供選擇的RNA剪接形式，因此又分為

CKLF1-CKLF4。MARVEL（MAL and related proteins for vesicle trafficking and membrane link）是一種新鑒定的四次跨膜結構域[2]，而CMTM則是以MARVEL結構域為特征的具有趨化活性的新型蛋白，在整個免疫系統(tǒng)中廣泛表達。起初認為CMTM家族成員與自身免疫性疾病有關，隨后發(fā)現(xiàn)在男性生殖系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)中CMTM也發(fā)揮著重要的生物學作用[3,4]。后來，諸多研究[5,6]表明腫瘤和正常組織的CMTM存在差異表達，且與腫瘤分級、分期、轉移和總生存期有關，對腫瘤的預后有一定的預測價值，但CMTM對腫瘤的作用并未引起人們的重視。

隨著Nature雜志報道[7,8]CMTM4/CMTM6可降低程序性死亡配體1（programmed cell death ligand 1, PD-L1）的泛素化，增加PD-L1蛋白的半衰期，增強PD-L1+腫瘤細胞抑制T細胞的能力，CMTM4/CMTM6可作為PD-L1的調(diào)控器，CMTM與腫瘤之間的關系逐漸成為研究熱點。進一步研究[9]發(fā)現(xiàn)，由于CMTM家族成員結構和功能的多樣性以及腫瘤之間的異質(zhì)性，不同的CMTM對多種惡性腫瘤的癌基因和腫瘤抑制因子的作用存在明顯差異。但總的來說，CMTM可作為治療人類癌癥的潛在治療靶點。本文旨在探索CMTM的結構和功能，重點綜述CMTM在參與腫瘤免疫微環(huán)境、介導信號轉導、調(diào)節(jié)腫瘤侵襲和轉移等方面的研究進展，總結CMTM與非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）之間關系的最新研究結果，并探討其作為生物標志物的臨床價值以及潛在的預后價值。

1 結構特點與表達

大多數(shù)CMTM基因轉錄的RNA產(chǎn)物具有多種可變剪接形式，但所有翻譯后的蛋白質(zhì)都包含髓鞘和淋巴細胞蛋白（myelin and lymphocyte protein, MAL）和MARVEL結構域[1]。與經(jīng)典四次跨膜蛋白相比，MARVEL結構域的兩個細胞外襻都較小，第三跨膜區(qū)起始部位的保守酸性殘基對其功能有重要影響，MARVEL結構域參與囊泡運輸、膜連接等多種生物學過程，其蛋白表達或功能異?？蓪е露喾N疾病的發(fā)生發(fā)展[2]。CKLF和CMTM1-CMTM8基因位于：人3號（CMTM6、CMTM7、CMTM8）、14號（CMTM5）和16號（CMTM1、CMTM2、CMTM3、CMTM4）染色體和小鼠8號、9號和14號染色體[1,10]。CMTM1-CMTM8編碼的蛋白質(zhì)與經(jīng)典趨化因子和四跨膜蛋白超家族（transmembrane 4 superfamily, TM4SF）的結構相似。CMTM1包含一個C-C基序，與其他CMTM相比，CMTM1和趨化因子具有更高的序列同一性，而CMTM8與趨化因子的序列同一性最低，CMTM2-CMTM7介于兩者之間[1]；但是，CMTM8與TM4SF的氨基酸相似性為39.3%。

CMTM1-CMTM4在睪丸、骨髓和外周血細胞的中高度表達，尤其是靜息CD19+細胞和活化的外周血單核細胞。CMTM3、CMTM5、CMTM7、CMTM8在正常成人和胎兒組織中可廣泛表達[6,11]，但在大多數(shù)癌細胞系中，其表達隨著啟動子區(qū)域DNA的甲基化逐漸降低[12]。有研究[9]發(fā)現(xiàn)除CMTM3外，7種CMTM家族成員在NSCLC中有差異表達并與其惡性進展密切相關。

2 CMTM與腫瘤免疫微環(huán)境

2.1 CMTM與免疫細胞 既往研究[13]表明，CKLF1可以通過MAPK途徑激活中性粒細胞，當加用抗-CKLF1抗體時，中性粒細胞的數(shù)量和活性隨之減少。C19和C27是CKLF1的兩個多肽，用C19和C27刺激未成熟樹突狀細胞（immature dendritic cell, ImDC），參與ImDC的抗原提呈，T細胞增殖和γ干擾素（interferon-gamma, IFN-γ）的產(chǎn)生也會受到影響。C19和C27也可作用于成熟DC細胞，上調(diào)HLA-DR的表達，促進白介素12（interleukin 12, IL-12）的分泌，而對CD80、CD83和CD86無明顯影響。在研究活化T淋巴細胞中CKLF1的表達譜時，Li等[14]證明CKLF1在活化的CD4+和CD8+細胞中上調(diào)，而在CD19+細胞中沒有明顯變化。

CMTM3和CMTM7高表達于免疫器官及造血系統(tǒng)，在B細胞上高表達，是B細胞連接蛋白（B cell linker protein,BLNK）的結合伙伴，與B細胞受體（B cell receptor, BCR）結合，參與BLNK介導的B淋巴細胞信號轉導，CMTM3可與DC2.4細胞中的SLP76蛋白結合，而CMTM7缺失導致B-1a細胞在過渡階段發(fā)育停滯[15]。

CMTM可能通過作用于免疫細胞和免疫分子，在抗磷脂綜合征（antiphospholipid syndrome, APS）的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮潛在作用。研究[16]發(fā)現(xiàn)，APS患者中性粒細胞的CMTM2和CMTM6表達上調(diào)。此外，CKLF1可能通過與C-C趨化因子受體4相互作用而參與關節(jié)炎的發(fā)生與發(fā)展[17]。

研究[18]表明CMTM可通過影響免疫細胞，如DCs、B細胞、共同淋巴樣祖細胞（common lymphoid progenitors,CLPs）、巨噬細胞、肥大細胞、Th2細胞和單核細胞的浸潤，改變腫瘤免疫微環(huán)境，對II級/III級腦膠質(zhì)瘤患者的預后產(chǎn)生一定影響。中山大學腫瘤中心發(fā)現(xiàn)高CMTM6水平與適應性免疫表型的腫瘤微環(huán)境的激活、活化CD4+、CD8+T細胞的浸潤、結直腸癌患者總生存率（overall survival, OS）和無進展生存期（progression-free survival, PFS）的延長有關[19]。CMTM可與多種免疫細胞相互作用，主要表現(xiàn)為參與DC細胞的抗原遞呈、激活中性粒細胞和B淋巴細胞的轉導信號、影響免疫細胞的浸潤。

2.2 CMTM4/CMTM6調(diào)控PD-L1 PD-L1高表達于腫瘤細胞，通過與T細胞膜上的程序性死亡受體1（programmed cell death 1, PD-1）相互作用，可有效抑制抗原特異性CD8+T細胞的功能，幫助腫瘤細胞逃避機體免疫系統(tǒng)的識別和攻擊。美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administraton, FDA）批準多種針對PD-L1、PD-1的抗體上市，在腫瘤免疫治療中取得了巨大成功，目前，阻斷PD-L1、PD-1的相互作用是腫瘤免疫治療的熱點。盡管PD-L1在腫瘤免疫微環(huán)境中癌細胞的免疫逃逸過程中起著關鍵作用，但我們對PD-L1蛋白調(diào)控的理解是有限的。

CMTM6是一種普遍表達的蛋白，與PD-L1結合并維持其細胞表面表達，在腫瘤微環(huán)境中有重要作用。通過單倍體遺傳篩選的3型跨膜蛋白CMTM6作為PD-L1蛋白的調(diào)節(jié)因子，可通過IFN-γ信號通路有效影響PD-L1的表達，CMTM6的表達下調(diào)會導致人腫瘤細胞和原代人樹突狀細胞中PD-L1蛋白的表達受損。值得注意的是，CMTM6可增加PD-L1蛋白含量，對PD-L1表現(xiàn)出明顯的特異性，但不影響PD-L1的轉錄水平，不影響細胞表面主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex, MHC）I類遞呈抗原。抑制CMTM6表達能夠下調(diào)PD-L1、顯著降低腫瘤細胞對T細胞活性的抑制能力，進一步研究[7]表明細胞表面的CMTM6與PD-L1蛋白結合，還可減少其泛素化，延長PD-L1蛋白的半衰期，在質(zhì)膜上的CMTM6與PD-L1結合，保護PD-L1在細胞內(nèi)體循環(huán)中免受溶酶體降解。

CMTM4是CMTM家族的另一個成員，與CMTM6具有55%的同源性，被鑒定為PD-L1表達的正調(diào)節(jié)劑。通過對CMTM6基因缺失細胞的單倍體遺傳修飾篩選和遺傳互補實驗發(fā)現(xiàn)CMTM4和CMTM6一樣，具有調(diào)節(jié)PD-L1的功能，而其他被測試的CMTM成員目前則不具有該功能。與CMTM6在調(diào)節(jié)PD-L1蛋白的作用一致，CMTM4增強了PD-L1+腫瘤細胞抑制T細胞的能力[8]。

結腸癌組織中CMTM6的表達明顯高于正常結腸組織，CMTM6的高表達與較低的病理分期和較多的CD4+/CD8+腫瘤浸潤淋巴細胞有關，PD-L1在結腸癌組織中呈低水平表達，而在腫瘤間質(zhì)中高表達，CMTM6和腫瘤間質(zhì)中PD-L1的共表達狀態(tài)將結腸癌患者分為低、中、高風險組，其中高表達組的患者生存時間最長，CMTM6/PD-L1在輔助化療組中比未化療組有著更好的預后價值[19]。在胃癌的研究[20]中，通過免疫組織化學檢查105例根治性手術切除的II期/III期胃癌患者CMTM6的表達，發(fā)現(xiàn)CMTM6高表達組的OS明顯低于CMTM6低表達組，并且CMTM6表達與PD-L1表達呈正相關。在肝細胞癌的研究[21]中發(fā)現(xiàn)CMTM4缺失的HCC腫瘤患者對抗PD-L1治療更敏感，這提示CMTM4表達水平可作為患者抗PD-L1治療反應的預測指標之一，干擾CMTM4表達可能有助于提高肝癌患者抗PD-L1免疫治療的臨床效益。同樣，CMTM4敲低則可抑制IFN-γ誘導的頭頸部鱗狀細胞癌中PD-L1的表達，CMTM4表達與基質(zhì)中CD8和PD-L1細胞密度呈正相關，研究[22]表明CMTM4可能在調(diào)節(jié)癌癥干細胞樣表型以及PD-L1的表達中起重要作用。這些研究數(shù)據(jù)表明PD-L1依賴CMTM4、CMTM6有效地發(fā)揮其抑制功能，CMTM4、CMTM6可作為潛在的免疫治療新靶點和預測預后的生物學標志物。PD-L1單抗（如阿替利珠單抗、度伐利尤單抗等）目前正廣泛應用于治療局部晚期或轉移性NSCLC，而CMTM4、CMTM6作為PD-L1的調(diào)節(jié)劑，其在提高PD-L1單抗治療NSCLC患者的長期有效率及克服PD-L1單抗的耐藥性方面需進一步深入探究。

3 CMTM介導的信號傳導

3.1 CMTM調(diào)節(jié)表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR） EGFR信號傳導調(diào)節(jié)上皮組織的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)，被認為是腫瘤抗藥性的生物標志物。當EGF作用于EGFR時，EGFR被磷酸化，從而導致控制細胞增殖、分化和遷移的細胞內(nèi)級聯(lián)信號的激活。EGFR信號起始于質(zhì)膜，經(jīng)內(nèi)化、泛素化和隨后的降解，參與負調(diào)控調(diào)節(jié)[23]。CMTM3、CMTM5、CMTM7在腫瘤中被認為是腫瘤抑制因子，通過調(diào)節(jié)EGFR信號在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮抑制作用。CMTM7通過參與調(diào)控EGFR的內(nèi)吞作用，抑制EGFR再循環(huán)，從而降低細胞表面EGFR水平，抑制下游PI3K/AKT信號通路，對ERK信號通路無影響；除此之外，研究[11]發(fā)現(xiàn)CMTM5和CMTM7具有協(xié)同作用，促進EGFR內(nèi)化并抑制EGFR介導的PI3K/AKT信號通路。CMTM3激活Rab5，促進早期內(nèi)體融合，下調(diào)細胞表面EGFR蛋白水平，從而調(diào)節(jié)EGFR內(nèi)吞作用[24]。研究[25]報道，脊索瘤組織的CMTM3表達下調(diào)，CMTM3通過激活TP53信號通路和阻斷EGFR/STAT3信號通路，抑制上皮間質(zhì)轉化（epithelialmesenchymal transition, EMT）過程，從而抑制脊索瘤的發(fā)生和發(fā)展。EGFR突變是晚期NSCLC常見的突變類型，也是NSCLC靶向治療的重要靶點，CMTM3、CMTM5、CMTM7通過調(diào)節(jié)EGFR信號而成為NSCLC治療領域的潛在靶點。

3.2 CMTM影響細胞周期 細胞周期包括G1期、S期、G2期、M期及G0期，有一個稱為細胞周期控制系統(tǒng)的復雜信號網(wǎng)絡精細調(diào)節(jié)，參與調(diào)控信號的主要成分是細胞周期蛋白和細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinase, CDK）。細胞周期失調(diào)可導致腫瘤中的異位細胞增殖。因此，細胞周期蛋白和CDK已成為腫瘤的治療靶點。CMTM4的過表達使G2期/M期細胞周期停滯和p21上調(diào)，顯著抑制腎細胞癌（renal cell carcinoma, RCC）細胞系786-O細胞的生長，并抑制細胞遷移[26]。在RCC中CMTM5表達下調(diào)，通過恢復CMTM5表達可誘導G0期-G1期細胞周期阻滯的發(fā)生，從而抑制RCC細胞的增殖[27]。體外研究[28]表明，CMTM7的過表達抑制肝癌細胞的生長和遷移。進一步分析顯示CMTM7抑制AKT信號傳導并誘導肝癌細胞G0期/G1期細胞周期停滯，可能是由于p27表達增加，細胞周期蛋白D1、CDK4和CDK6水平降低所致。CMTM7通過抑制細胞周期進程在肝癌中發(fā)揮腫瘤抑制劑的作用[28]。總的來說，CMTM4、CMTM5、CMTM7可使細胞停滯在不同周期，影響細胞生長和遷移。

4 CMTM參與EMT

EMT是一個上皮細胞失去其上皮特征，連接并重組其細胞骨架的發(fā)育過程。EMT增加細胞流動性，使癌細胞獲得侵襲性，這在耐藥性和腫瘤轉移中發(fā)揮重要作用。CMTM4可能在調(diào)節(jié)EMT、腫瘤干細胞表型和PD-L1表達中發(fā)揮重要作用，且EMT過程與PD-L1表達相關，敲除CMTM4可使EMT過程延緩，抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲能力[22]。CMTM3通過EGFR/STAT3調(diào)控EMT從而抑制脊索瘤的發(fā)生[25]。在肝癌的研究[29]中阻斷CMTM2的表達可顯著促進HUH-7和SMMC7721細胞增殖，其癌細胞轉移與CMTM2下調(diào)有關，CMTM2的低表達誘導EMT過程，增強肝癌細胞的侵襲和遷移能力。研究[30]發(fā)現(xiàn)CMTM3、CMTM6、CMTM7的表達與乳腺癌細胞系的EMT的相關評分呈正相關，EMT可通過誘導CMTM6和CMTM7調(diào)節(jié)乳腺癌表面PD-L1表達。總之，CMTM可通過影響EMT過程來調(diào)節(jié)腫瘤的侵襲和轉移。

5 CMTM與腫瘤預后

CMTM家族在評估病理分期、確定治療策略方面具有相當大的臨床價值，可作為預測NSCLC、乳腺癌、肝癌和胃癌等癌癥預后的生物學標志物。CMTM4在肝細胞癌、肺腺癌組織中表達下調(diào)，是影響肝細胞癌、肺腺癌患者OS的獨立預后因素，CMTM4陰性表達的患者的生存期短于CMTM4陽性表達的患者[31,32]。CKLF是CMTM家族中第一個被發(fā)現(xiàn)的成員，也是人類腫瘤中一個具有很大希望的治療靶點[33]。通過整理分析ONCOMINE、GEPIA、Kaplan-MeierPlotter和cBioPortal數(shù)據(jù)庫中乳腺癌患者CMTM的轉錄和生存數(shù)據(jù)，表明CMTM5、CMTM7可以作為預測乳腺癌預后的生物標志物和潛在的治療靶點[34,35]。CMTM的mRNA表達與胃癌患者的臨床參數(shù)（包括腫瘤分期、淋巴結轉移狀況、幽門螺桿菌感染狀況和腫瘤分級）密切相關，CMTM3/CMTM5 mRNA水平升高與較差的總體生存率、無進展生存率和進展后生存率顯著相關，提示CMTM的表達模式可能是一種新的影響胃癌患者預后的因素[36]。研究[37]利用免疫組化證實CMTM6、CMTM8在卵巢癌組織中高表達，CMTM6高表達與PD-L1密切相關，CMTM8高表達與Ki-67密切相關，并可顯著降低總生存率和無進展生存率，CMTM1、CMTM2、CMTM3、CMTM5、CMTM8可作為判斷卵巢癌預后的生物標志物?？傊?，CMTM作為預測患者預后和治療效果的新的生物標志物，在腫瘤方面具有潛在的研究價值。

6 CMTM與NSCLC

Si等[38]發(fā)現(xiàn)在NSCLC中，亞型CMTM1_V17的高表達會降低患者對新型輔助化療的藥物敏感性，同時對患者術后生存率造成嚴重影響。Li等[39]通過免疫組織化學染色的方法證明，與配對的相鄰正常肺組織相比，CMTM2在肺腺癌組織中的表達明顯減少，并在小鼠模型中證實CMTM2對腫瘤生長的抑制作用。在研究肺癌的模型中，Tian等[40]發(fā)現(xiàn)CMTM4表達可顯著影響肺鱗癌和腺癌患者的OS。而在人蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)CMTM5表達減少與肺腺癌和鱗狀細胞癌的較低存活率相關[9]。Zugazagoitia等[41]研究表明CMTM6和PD-L1的高共表達水平與NSCLC預后較好相關。Koh等[42]研究證明，高CMTM6蛋白表達的NSCLC患者比低CMTM6蛋白表達的患者具有更好的OS，CMTM6升高可預測NSCLC患者對PD-1抑制劑的臨床反應。并且，相關研究[43]在mRNA和蛋白兩個水平驗證了CMTM6與PD-L1存在正相關關系，下調(diào)的CMTM6導致肺腺癌細胞發(fā)生突變。CMTM7是NSCLC生存的獨立預后因素，進一步研究[44]發(fā)現(xiàn)CMTM7基因缺失導致Rab5活性降低，導致腫瘤細胞增殖。有研究[9,45]報道CMTM8經(jīng)常在肺癌中下調(diào)或缺失，其表達下調(diào)與肺鱗癌生存率降低有關。而CMTM3是否參與調(diào)控NSCLC分子機制仍需進一步研究。CMTM4、CMTM6作為抑癌基因對NSCLC患者的預后生存有明顯的影響，可能與PD-1/PD-L1途徑有關，但更深入的機制還有待探索。

7 總結與展望

CMTM在許多生物過程中發(fā)揮關鍵作用，比如維持腫瘤免疫微環(huán)境，調(diào)節(jié)PD-L1蛋白、EGFR信號通路、增殖信號傳導以及參與侵襲和轉移。CMTM在人類腫瘤和正常組織中有不同的表達譜，不同的CMTM成員在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中作用不同，可發(fā)揮腫瘤的雙向調(diào)節(jié)作用。CMTM在腫瘤發(fā)展和轉移中的作用已被初步探究，但要明確調(diào)節(jié)CMTM表達的分子機制還需要進一步研究。很多實驗數(shù)據(jù)表明CMTM在癌癥發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，但沒有證據(jù)表明異常CMTM表達是否直接干擾化學治療、放射治療和免疫治療的效果。我們對CMTM在腫瘤微環(huán)境中的作用的認識仍是冰山一角。臨床上應用不同CMTM家族成員或其促進/抑制劑是否能有效控制腫瘤的發(fā)生發(fā)展或轉移，如何將其應用于臨床治療中仍然是需要我們不斷探索的關鍵問題。此外，有必要進一步研究CMTM對其他重要膜分子尤其是免疫激活性受體、免疫抑制性受體是否具有調(diào)控作用，研發(fā)CMTM4、CMTM6的阻斷型抗體或小分子化合物可為腫瘤免疫治療提供新的思路和方法。