間充質(zhì)干細(xì)胞在寵物臨床疾病治療中的應(yīng)用

杜佳欣，李巴侖，趙獻(xiàn)軍，3，吳禮平，張選民，華進(jìn)聯(lián)*

（ 1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物工程分院，陜西 楊凌 712100 ；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 陜西省干細(xì)胞工程技術(shù)中心，陜西 楊凌 712100 ；3.百歐派（天津）生物技術(shù)有限公司，天津 300000 ； 4.麟游縣畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣站，陜西 寶雞 721599 ）

隨著寵物生活質(zhì)量提高和壽命延長(zhǎng)，寵物慢性病及代謝性疾病的患病率顯著升高，主要包括寵物糖尿病、腎衰、皮膚病、骨科、眼科、腫瘤和免疫性的疾病等。目前，針對(duì)這些寵物“難治病”尚無(wú)靶向性強(qiáng)、治療效果顯著的特效藥，許多患病寵物僅能夠得到基礎(chǔ)的保守型治療以緩解疾病的癥狀，但最終會(huì)因多器官的衰竭而慢性死亡。

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類具有自我更新、多向分化潛能的細(xì)胞類群[1]，具有分化潛能多、來(lái)源途徑多、旁分泌功能強(qiáng)大等特征，能夠通過(guò)調(diào)節(jié)全身性功能的方式恢復(fù)機(jī)體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。MSCs的多分化潛能主要體現(xiàn)在其具有向肌肉細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和其他細(xì)胞分化的能力[2]，多來(lái)源途徑體現(xiàn)在MSCs可以從多種組織中分離獲得。目前，大部分有關(guān)MSCs的研究聚焦于臍帶血的MSCs、骨髓MSCs、脂肪間MSCs及牙髓MSCs等。此外，MSCs在治療心肌梗死、自身免疫性疾病[3-4]、糖尿病[5]、肝損傷[6]及腎臟損傷[7]等方面也具有顯著作用。MSCs可以通過(guò)旁分泌許多細(xì)胞因子促進(jìn)機(jī)體的自我修復(fù)和疾病恢復(fù)。MSCs治療機(jī)制涉及多種途徑，包括抗炎[5,8]、抗氧化應(yīng)激[8]、抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[5]、激活免疫系統(tǒng)[9]及促進(jìn)受損部位再生[5]等。

1 間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)于治療寵物疾病的應(yīng)用

最初，MSCs主要作為骨科疾病的治療措施，但目前已經(jīng)迅速擴(kuò)展到其他領(lǐng)域，包括糖尿病、肝臟疾病、腎臟疾病及眼科疾病等。

1.1 糖尿病

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是一種因胰島素分泌不足或作用缺陷所引起的，以糖脂代謝紊亂為主要特征的內(nèi)分泌疾病，迄今為止尚無(wú)治愈的方法。DM可分為1型糖尿?。═1DM）、2型糖尿病（T2DM）以及由其他原因引起的特定類型的糖尿病。DM典型臨床癥狀包括多尿、多飲、多食和體重減輕。目前，DM已成為伴侶動(dòng)物中常見(jiàn)的疾病。伴侶動(dòng)物患DM與許多潛在的病因有關(guān)，包括肥胖、免疫介導(dǎo)的炎癥、藥物、胰腺炎和其他并發(fā)疾病等[10]。在寵物DM臨床治療中，終身胰島素治療是目前患病寵物唯一的選擇，但由于其需要終身注射，消耗了寵物主大量的時(shí)間及經(jīng)濟(jì)成本。有研究通過(guò)將干細(xì)胞誘導(dǎo)成為胰島素分泌型細(xì)胞的方法，達(dá)到恢復(fù)動(dòng)物胰島功能、降低血糖水平的目的[11]。2010年，朱沙俊等[12]將MSCs移植至DM患犬肝臟，有效降低了DM患犬的血糖水平。2012年，王立梅等[13]將MSCs移植至DM患犬胰腺，減少了DM患犬胰島素的用量并改善了血清中C-肽的水平[13]。2017年，董松等[14]將MSCs經(jīng)動(dòng)脈移植治療T2DM患犬，結(jié)果顯示，MSCs不僅能夠有效改善患犬糖脂代謝紊亂的問(wèn)題，同時(shí)恢復(fù)了胰島β細(xì)胞的功能，減輕了胰島素的抵抗效果和胰島素的用量。楊立娜等[15]研究表明，MSCs移植數(shù)量超過(guò)1×106時(shí)可有效緩解犬的DM癥狀。2021年，Li等[5]將犬脂肪MSCs靜脈移植治療犬DM，結(jié)果顯示，MSCs能夠有效降低患犬血糖的水平，促進(jìn)胰島再生，恢復(fù)胰島素的分泌水平及機(jī)體糖原的代謝。此外，該研究還將MSCs移植于正常犬體內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)犬出現(xiàn)任何不良反應(yīng)[5]。綜上所述，MSCs能夠安全有效地治療犬DM，相關(guān)研究人員已初步建立了利用MSCs治療犬糖尿病的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 肝損傷

肝損傷是一種發(fā)病率及病死率均非常高的寵物臨床常見(jiàn)病，通常伴隨嚴(yán)重的并發(fā)癥。目前，在人類臨床醫(yī)學(xué)中，治療肝損傷最有效的方法是原位肝移植。但這種治療方式由于成本高昂、供體難匹配、終身免疫抑制等原因，很難應(yīng)用于寵物臨床治療。

近年來(lái)，已經(jīng)有幾項(xiàng)研究將MSCs應(yīng)用于治療犬的肝損傷疾病。Yan等[6]對(duì)犬肝臟靜脈注射同種異體MSCs治療犬肝損傷疾病，結(jié)果顯示，同種異體MSCs能夠使損傷的肝臟組織結(jié)構(gòu)得到恢復(fù)，肝臟相關(guān)指標(biāo)有所改善，表明MSCs可用于治療寵物的肝臟疾病。同時(shí)，MSCs也可應(yīng)用于治療犬肝硬化的疾病。有研究表明，靜脈注射MSCs顯著降低了肝纖維化程度，改善了肝功能[16]。Gardin等[17]將MSCs靜脈移植于肝損傷犬的肝臟中，結(jié)果顯示，所有患犬的肝功能指標(biāo)均得到顯著改善。Nishimura等[18]研究表明，肝內(nèi)注射MSCs較靜脈移植具有更持久的療效，可能與MSCs靜脈移植的“肺部首過(guò)效應(yīng)”有關(guān)。此外，MSCs還被用于治療患有肝皮綜合征（hepatocutaneous syndrome）的犬病例，結(jié)果顯示，MSCs具有良好的治療效果[19]。

1.3 腎損傷

由于飲食結(jié)構(gòu)、飼養(yǎng)習(xí)慣等因素，犬、貓急慢性腎損傷的發(fā)病率持續(xù)升高，嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)腎衰的情況。目前，腎移植是唯一可以恢復(fù)腎功能的療法[20]，MSCs移植成為寵物腎臟疾病治療的新選擇。He等[7]研究表明，MSCs移植恢復(fù)了急性腎損傷犬的腎功能，并促進(jìn)了腎臟受損部位的恢復(fù)。Vidane等[21]研究表明，MSCs改善了慢性腎損傷的腎臟功能，并緩解了患貓的癥狀表現(xiàn)。

1.4 皮膚病

由于各種因素導(dǎo)致的寵物皮膚及皮膚損傷是臨床多發(fā)的寵物常見(jiàn)病。MSCs因具有抗炎及再生的功能，可為皮膚損傷病例提供一種可行的治療措施。多項(xiàng)研究表明，MSCs對(duì)治療山羊[22]、綿羊[23]、馬[24]及犬[25]等多種動(dòng)物的傷口具有較好的效果。此外，將MSCs衍生的外泌體用于治療犬皮膚損傷，可促進(jìn)犬皮膚愈合的速度[26]。除了能夠促進(jìn)傷口愈合外，MSCs還可應(yīng)用于治療犬的特異性皮炎。研究表明，經(jīng)MSCs治療，患犬臨床癥狀顯著減輕，且療效能夠維持6個(gè)月[27]。

1.5 骨關(guān)節(jié)疾病

MSCs針對(duì)骨關(guān)節(jié)疾病的恢復(fù)能夠發(fā)揮良好的治療作用。一項(xiàng)對(duì)203只患嚴(yán)重骨關(guān)節(jié)炎犬的治療試驗(yàn)結(jié)果顯示，應(yīng)用MSCs療法促進(jìn)了90%患病幼犬及60%患病老年犬的恢復(fù)[28]。在一項(xiàng)持續(xù)4年的回訪研究中，使用MSCs治療犬的關(guān)節(jié)炎預(yù)后效果良好[29]。Zhang等[30]研究表明，MSCs促進(jìn)了軟骨神經(jīng)再生和骨關(guān)節(jié)損傷的修復(fù)，改善了周圍組織的愈合情況，并減弱了炎癥反應(yīng)。此外，大量研究表明，將生物工程材料與MSCs結(jié)合能夠有效改善犬的骨關(guān)節(jié)疾病癥狀[31-33]。

1.6 眼科疾病

在犬角膜炎及眼干燥癥的相關(guān)研究中，MSCs已經(jīng)被證實(shí)為一種有效的治療方法。Villatoro等[34]研究表明，MSCs移植顯著促進(jìn)了犬角膜炎臨床癥狀恢復(fù)。Villatoro等[35]研究表明，MSCs同樣能夠緩解貓患角膜炎病的臨床癥狀。

2 間充質(zhì)干細(xì)胞療法的治療機(jī)制

最初研究人員認(rèn)為，MSCs能夠定向分化和取代受損部位細(xì)胞；而近年來(lái)有大量研究表明，MSCs主要通過(guò)旁分泌、細(xì)胞外囊泡傳遞分子方式實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)功能，從而達(dá)到治療效果。

2.1 旁分泌作用

大量研究表明，MSCs治療機(jī)制主要依賴旁分泌，通過(guò)旁分泌釋放的細(xì)胞因子在體內(nèi)激活免疫細(xì)胞的功能，包括單核巨噬細(xì)胞[36]、樹(shù)突狀細(xì)胞[37]、T細(xì)胞[38]、B細(xì)胞[39]和自然殺傷細(xì)胞[40]。通過(guò)旁分泌釋放的細(xì)胞因子中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-beta，TGF-β）、吲哚胺-2、3-雙加氧酶（indolamine-2,3-dioxygenase，IDO）、白細(xì)胞介素-10（interleukin 10，IL-10）等促進(jìn)了MSCs的免疫調(diào)節(jié)。TGF-β提高了MSCs的遷移和歸巢能力，并促進(jìn)了MSCs的增殖和分化[5,41-42]。此外，TGF-β在體內(nèi)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞[43-45]從“促炎”轉(zhuǎn)換到“抗炎”狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)[46]。MSCs在炎癥環(huán)境下分泌大量的吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO）[39]，IDO催化導(dǎo)致了T細(xì)胞和B細(xì)胞的周期停滯[47]，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的生成[48]，并促進(jìn)巨噬細(xì)胞抗炎性極化[49]。而IL-10是一種抗炎細(xì)胞因子，能夠在體內(nèi)抑制T細(xì)胞擴(kuò)張并促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的生成[50]。

2.2 細(xì)胞外囊泡

MSCs具有通過(guò)細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，ECV）傳遞各種分子的功能。ECV是一種膜限制性囊泡，含有各種蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸[51]。ECV的囊泡結(jié)構(gòu)促使ECV能夠在體內(nèi)進(jìn)行長(zhǎng)距離傳遞[52-53]。ECV包含外泌體（30~150 nm內(nèi)吞來(lái)源囊泡）、微囊泡（100~1 000 nm非內(nèi)吞來(lái)源囊泡）及凋亡小體（50 nm~5 μm的大囊泡）[54]。Hyv?rinen等[55]研究表明，ECV以與MSCs相同的方式，通過(guò)前列腺素E2（PGE2）激活M2型巨噬細(xì)胞。ECV還可以通過(guò)TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)抑制T細(xì)胞[56]。在豬、小鼠和大鼠等動(dòng)物疾病模型中，MSCs衍生的ECV有益于治療糖尿病[57]、腎病[58]、肝病[59]及骨關(guān)節(jié)炎[60]等。此外，ECV可促進(jìn)犬血管的形成、膠原蛋白的合成和皮膚傷口的愈合[26]。

3 間充質(zhì)干細(xì)胞治療的安全性評(píng)價(jià)

由于MSCs具有體外擴(kuò)增及自我更新能力，相關(guān)研究開(kāi)始質(zhì)疑并關(guān)注MSCs的致瘤性和安全性等問(wèn)題。截至2018年，以MSCs作為DM的治療手段已有40多項(xiàng)臨床試驗(yàn)注冊(cè)[61]。Hu等[62]通過(guò)對(duì)T1DM患者使用MSCs的治療方式研究了MSCs療法的安全性及可行性。通過(guò)對(duì)患者輸注MSCs（每月1次，平均輸注細(xì)胞數(shù)為2.6×107），結(jié)果顯示，在輸注的9~24個(gè)月之間，患者餐后血糖水平降低，并且MSCs組的胰島素使用量及C肽水平得到改善。Jiang等[63]通過(guò)對(duì)10例持續(xù)時(shí)間大于3年、胰島素依賴[≥0.7 U/（kg·d）]至少1年，且血糖控制不良的T2DM患者輸注MSCs治療6個(gè)月，結(jié)果顯示，患者胰島素水平及糖化血紅蛋白（HbA1c）測(cè)定均得到改善；此外，經(jīng)MSC治療后患者的C肽水平得到改善。Carlsson等[64]研究表明，接受MSCs治療的DM患者耐受情況良好，且在之后一年的觀察中未被診斷出腫瘤或慢性疾病感染，所有患者均未出現(xiàn)高血糖酮癥酸中毒或輔助性低血糖等癥狀。Liu等[65]研究發(fā)現(xiàn)，MSCs移植中出現(xiàn)部分患者輕、中度發(fā)熱的情況，但在移植1 d后恢復(fù)到正常水平；在治療1個(gè)月后患者C肽及β細(xì)胞功能暫時(shí)減弱，這可能與MSCs的注射方式有關(guān)。Li等[5]研究發(fā)現(xiàn)，MSCs移植60 d，患犬體內(nèi)未檢測(cè)到殘留的MSCs，且MSCs移植對(duì)患犬的生理指標(biāo)無(wú)影響，表明寵物MSCs治療方法安全可行。

4 結(jié)論

MSCs作為一種新的治療手段，能夠?yàn)槿祟惡蛯櫸锛膊≈委熖峁┒嗤緩降闹委煼桨浮SCs的作用機(jī)制包括抗炎、抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、激活免疫系統(tǒng)和促進(jìn)受損器官再生等。MSCs療法的面世可能解決目前人類和寵物醫(yī)療行業(yè)的一些關(guān)鍵問(wèn)題，但仍需更投入更多研究，包括確定MSCs的培養(yǎng)方案、探索MSCs的治療機(jī)制、改進(jìn)MSCs劑型、優(yōu)化MSCs治療方案及建立MSCs產(chǎn)品的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量評(píng)價(jià)體系等。