牛流行熱檢測方法及疫苗研究現(xiàn)狀

石亞楠，李小龍，鮑顯偉，王雪妍，許立華

（ 寧夏大學農(nóng)學院，寧夏 銀川 750021 ）

牛流行熱（bovine ephemeral fever，BEF）又稱三日熱、暫時熱，是一種由節(jié)肢動物傳播的病毒性疾病[1-2]。BEF的主要癥狀表現(xiàn)為突發(fā)高熱（41~42 ℃）、食欲不振、關(guān)節(jié)腫脹、跛行。該病的特點是發(fā)病快，病程僅持續(xù)1~3 d，恢復迅速。1867年，BEF首次在南非被報道，隨后傳入中東、澳大利亞、日本、中國等國家及地區(qū)[3]。BEF病死率低，發(fā)病率高，主要導致泌乳牛產(chǎn)奶量突然下降、肉牛狀況不良、役用牛癱瘓，造成養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟損失慘重。近年來，BEF的發(fā)病率和病死率不斷升高。2002年，河南省BEF流行病學報告病死率達到17%~18%；2012年，土耳其一牧場BEF病死率高達20%；2015年，西藏和甘肅天祝地區(qū)牦牛BEFV抗體陽性率為23.8%~45.09%[4-7]。因此，檢測和防控BEF已成為畜牧業(yè)的首要任務(wù)。

牛流行熱病毒（bovine ephemeral fever virus，BEFV）屬于彈狀病毒科暫時熱病毒屬，由負義單鏈RNA基因組組成。BEFV共編碼5種結(jié)構(gòu)蛋白，包括核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、糖蛋白（G）、RNA依賴RNA聚合酶大蛋白（L）[8]。G蛋白是一類跨膜糖蛋白，負責病毒細胞黏附、進入和致病性，表面有4個抗原中和位點（G1~G4），能夠誘導抗體分泌和保護性體液免疫[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，G1位點僅與BEFV的血清發(fā)生反應，而G2、G3、G4抗原位點與同科其他病毒會產(chǎn)生血清學交叉反應[11]。G蛋白作為中和抗體的靶標，廣泛應用于BEFV檢測方法建立和新型BEF疫苗開發(fā)。本文對BEF的檢測方法以及疫苗開發(fā)的研究近況進行梳理總結(jié)，以期為BEF的防控提供一定參考。

1 BEF檢測方法的研究近況

1.1 病原學檢測方法

臨床上常將采集的患病?？鼓准毎臃N于1~3日齡的乳鼠腦中，經(jīng)鼠腦傳代分離得到病毒后，進行病毒中和試驗鑒定；或?qū)⒇撊痉蛛x的白細胞置于電鏡下，觀察病毒顆粒的形態(tài)。BEFV可在牛腎細胞（MDBK）、倉鼠腎細胞（BHK-21）、非洲綠猴腎細胞（Vero）、白紋伊蚊細胞（C6/36）等細胞系中分離培養(yǎng)。Karayel-Hacioglu等[12]將疑似感染BEFV的牛血樣品中的白細胞層接種于Vero細胞培養(yǎng)物中，盲傳2代，感染后48 h內(nèi)觀察到特異性細胞病變反應（CPE），后續(xù)的傳代中接種后24 h內(nèi)即可觀察到CPE，最終經(jīng)過RT-PCR確認分離株是BEFV。病毒分離鑒定是最傳統(tǒng)也是最準確的診斷方法，但該方法對實驗室條件要求過高，且操作復雜，不適用于BEFV快速診斷，無法在基層養(yǎng)殖場推廣應用。

1.2 血清學檢測方法

1.2.1 微量血清中和試驗

微量血清中和試驗（neutralization test）是檢測病毒常用的方法。1988年，白文彬等[13]應用BEF北京毒株制備了微量血清中和試驗抗原和高免血清，進行特異性和重復性試驗，結(jié)果表明，BEF微量中和試驗特異性強、敏感性高，與常量中和試驗對比，結(jié)果一致。BEF微量中和試驗是我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部首次推薦檢測BEFV的標準方法，但該方法操作煩瑣，結(jié)果誤差較大，難以應用于臨床大批量血清樣品檢測。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunoadsordent assay，ELISA）是血清學檢測最常用的檢測方法，靈敏度高、檢測結(jié)果相對準確、適用范圍廣。目前以體外表達重組BEFV G蛋白建立了幾種ELISA方法。黃德萱[2]以BEFV G 蛋白制備的兔源多克隆抗體作為捕獲抗體，以G1表位單克隆抗體為檢測抗體，建立了BEFV抗原捕獲ELISA。采用該方法對彈狀病毒科其他病毒以及牛病毒性腹瀉病毒進行特異性驗證，結(jié)果顯示，該方法特異性較好，可為BEFV臨床樣品的篩查提供技術(shù)支持。但該方法制備抗體成本較高，且BEFV感染病程較短時會影響檢測結(jié)果的準確性。汪祥斌[14]基于原核表達的重組蛋白BEFV G1，建立了檢測BEFV抗體的間接ELISA方法，利用該方法驗證微量中和試驗檢驗的牛血清，結(jié)果顯示，臨界值為0.347，敏感性為96%，特異性為92%，表明該方法具有較好的敏感性和特異性，為BEF的防控提供一定幫助。

1.3 分子生物學檢測

1.3.1 聚合酶鏈式反應

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)檢測速度快、敏感性和特異性高，尤其適用于鑒定體外分離不到病原的情況。國內(nèi)外研究人員針對BEF開發(fā)了一系列高靈敏度和特異性的PCR方法，如反轉(zhuǎn)錄PCR、一步式反轉(zhuǎn)錄PCR和實時熒光定量PCR。由于RNA病毒易降解，為簡化試驗步驟，避免操作過程中的污染，廖承球等[15]建立了BEFV一步法RT-PCR，并使用該方法對采集的17份疑似BEF患牛全血進行檢測，與常規(guī)PCR檢測結(jié)果完全一致。該方法中反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增均在一個反應管中進行，與常規(guī)PCR相比，不僅可縮短檢測時間，還可節(jié)約試劑、降低污染。

近年來，在RT-PCR的基礎(chǔ)上，實時熒光定量PCR（RT-qPCR）的應用更加廣泛。因RT-qPCR具有交叉污染率低、反應時間短和檢測結(jié)果精確等特點，多應用于獸醫(yī)診斷實驗室。汪祥斌等[11]基于BEFV G蛋白的保守序列設(shè)計探針和引物，建立了BEFV TaqMan實時定量PCR檢測方法，最低檢測限為1×101copies/μL，與牛藍舌病毒、牛赤羽病毒無交叉反應，表明該方法特異性強，穩(wěn)定性、重復性良好，可節(jié)省病毒核酸用量。Gao等[16]基于SYBR green Ⅰ技術(shù)開發(fā)了一種低成本的RT-qPCR檢測方法，并對BEFV G設(shè)計了簡并引物，能夠檢測廣譜BEFV毒株，其靈敏度與TaqMan RT-PCR檢測不分高下，比常規(guī)PCR高百倍，而且可應用于定量分析牛體內(nèi)病毒動力學。

LUXTM熒光RT-PCR是一種擴增體系簡單，成本比TaqMan探針技術(shù)低，特異性比核酸染料技術(shù)強，但敏感性和特異性與TaqMan探針技術(shù)不相上下的實時核酸擴增技術(shù)[17]。劉志玲等[18]在BEFV G基因保守區(qū)設(shè)計了特異LUXTM熒光RT-PCR引物，首次建立了特異性BEFV LUXTM熒光RT-PCR快速檢測方法，其敏感性比傳統(tǒng)RTPCR方法高100倍，對臨床BEF的檢測具有應用價值。雖然RT-qPCR具有高通量擴增的能力，但熱循環(huán)儀價格昂貴并且需要專業(yè)的技術(shù)人員，導致該方法在應用上存在局限性，難以在基層推廣使用。

1.3.2 等溫擴增技術(shù)

環(huán)介導逆轉(zhuǎn)錄等溫擴增技術(shù)（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）是一種新型核酸擴增方法。RT-LAMP擴增的各個步驟均在同一溫度進行，不需特定的儀器設(shè)備，其靈敏度、特異性和檢測范圍等指標優(yōu)于PCR技術(shù)，檢測成本遠低于RT-PCR。賈坤等[19]建立了一種高效、簡便、可視化的RT-LAMP檢測方法，與傳統(tǒng)PCR相比，RT-LAMP的檢測靈敏度提高至10倍以上。由于RT-LAMP反應本身特異性強、靈敏性高，所以對于操作環(huán)境要求嚴格，稍有不慎便可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

重組酶聚合酶擴增技術(shù)（recombinase polymerase amplification，RPA）被認為是可取代PCR實現(xiàn)便攜式快速核酸檢測的一種等溫擴增技術(shù)，具有操作簡便、靈敏度高、設(shè)備要求低等優(yōu)點，但準確檢測RPA產(chǎn)物還需進一步優(yōu)化。側(cè)流層析試紙條檢測法（recombinase polymerase amplification combined with lateral flow dipstick，RPALFD）可對RPA產(chǎn)物進行可視化檢測，與其他檢測方法相比，該方法用時短，5~10 min內(nèi)即出可視化檢測結(jié)果，適用于基層養(yǎng)殖場檢測。Hou等[20]以BEFV G基因為目標對象設(shè)計RPA引物和LF探針，建立應用于檢測BEFV的可視化RPA-LFD檢測技術(shù)，通過肉眼直觀判斷橫向流動試紙條上的擴增產(chǎn)物；結(jié)果表明，擴增產(chǎn)物在38 ℃下進行20 min即可被檢測到，其臨床檢測結(jié)果與RT-PCR相比，符合率高達96.09%（123/128），高于常規(guī)PCR的符合率。RPA比其他BEFV核酸檢測方法快，不需要昂貴且復雜的熱循環(huán)儀，非常適合BEFV核酸現(xiàn)場快速檢測。

1.4 其他檢測方法

國內(nèi)外學者一直在開發(fā)和應用傳感器技術(shù)，利用動物身上的傳感器檢測皮毛、體溫和行為指標實現(xiàn)特定傷害或疾病的自動診斷[21]。Tobin等[22]利用牛身上加速度傳感器遠程監(jiān)測BEF相關(guān)行為變化，通過分析加速度計讀數(shù)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用加速度計讀數(shù)具有診斷BEF和其他疾病的潛力，有望成為新的有力檢測工具。

2 BEF疫苗的研究近況

疫苗接種是預防和控制BEF最有效的措施。迄今為止，國內(nèi)外已經(jīng)研究出多種候選疫苗應用于預防BEF感染，并在臨床實踐中發(fā)現(xiàn)不同疫苗的保護效果不同。

2.1 滅活疫苗

滅活疫苗是將病原體在細胞基質(zhì)上進行培養(yǎng)，通過加熱或用化學劑（福爾馬林、甲醛、β-丙內(nèi)酯、結(jié)晶紫等）使病原體失去致病力而保留抗原性的一類疫苗。BEFV只有一個血清型，但已分離了多種變異BEFV毒株，一些分離株滅活后，免疫牛表現(xiàn)出良好的免疫原性和保護效力。國內(nèi)市售的BEFV滅活疫苗使用的是1976年在中國分離的JB76H毒株。朱雁等[23]對淮海經(jīng)濟區(qū)多個縣市養(yǎng)殖場進行了BEF流行病學調(diào)查分析及BEFV疫苗免疫效果評估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2011年之前未免疫BEF滅活疫苗的縣市出現(xiàn)了暴發(fā)式流行；2011—2017年免疫BEF滅活疫苗的縣市只出現(xiàn)了零星病例；而其他未免疫BEF滅活疫苗的縣市均多次發(fā)生BEF，連續(xù)兩次免疫BEF滅活疫苗后，免疫中和抗體合格率達到了80%，表明BEF滅活疫苗具有良好的保護作用。近年來，也有研究報道了接種BEFV滅活疫苗的牛群出現(xiàn)疫苗接種失敗[24]的案例。研究人員使用不同佐劑的滅活疫苗誘導產(chǎn)生高效價的抗體，從而提高BEF滅活疫苗的保護效力。Aziz-Boaron等[25]基于以色列當?shù)囟局觊_發(fā)了水包油滅活疫苗，并對其進行測試，結(jié)果顯示，接種3次或4次疫苗后，中和抗體滴度保持穩(wěn)定（1∶256），但4個月后檢測到中和抗體滴度有所下降。Yang等[26]通過桿狀病毒表達系統(tǒng)表達缺失重組弧菌鞭毛蛋白制備的滅活赤羽病毒（AKAV）＋BEFV疫苗，結(jié)果顯示，在小鼠和豚鼠試驗中，滅活AKAV+BEFV疫苗對AKAV和BEFV的VNA滴度略高于活BEFV疫苗；在豬和牛中抗AKAV和BEFV可誘導高VNA滴度（1∶64~1∶512），表明AKAV+BEFV滅活疫苗具有高免疫原性和良好的安全性，但仍需進一步開展田間試驗，研究疫苗的免疫效力和持久性。

2.2 減毒活疫苗

減毒活疫苗是通過傳統(tǒng)方式減弱病原體的毒性或敲除病原體的毒力基因，但保留了病原體在宿主體內(nèi)增殖的一類疫苗。已有商品化減毒活疫苗在BEF流行的國家使用，如澳大利亞、日本、南非。南非通過每年給易感牛皮下接種由Onderstepoort Biological Products（OBP）生產(chǎn)的減毒B-Phemeral疫苗控制BEF疫情[27]。BEF減毒活疫苗免疫力持久，但存在安全隱患，可能出現(xiàn)毒力返強、RNA病毒易突變等情況。

2.3 基因工程疫苗

與傳統(tǒng)滅活疫苗和減毒疫苗相比，基于BEFV抗原基因進行開發(fā)的基因工程疫苗更安全且成本更低。因此，開發(fā)高效、安全、平價的基因工程疫苗是目前BEF疫苗研發(fā)的重要方向。

2.3.1 亞單位疫苗

BEF亞單位疫苗是通過微生物或哺乳動物表達系統(tǒng)表達BEFV的保護性抗原，經(jīng)分離純化后加入佐劑制備而成。此類疫苗無感染性成分，不需要滅活，也不具有致病性，安全性高，但保護效力有待提高。目前，市面上的疫苗僅限于局部毒株，保護有限，而抗原表位的預測鑒定有助于設(shè)計BEFV表位疫苗。Pyasi等[28]基于BEFV結(jié)構(gòu)蛋白（N、P、M、G），利用綜合免疫信息學方法設(shè)計了第一個針對BEFV的多表位亞單位疫苗，該模型理論上具有刺激細胞和體液免疫反應的特征，有助于開發(fā)BEFV的潛在疫苗。Mollazadeh等[29]從不易突變和基因組多樣性的BEFV G蛋白序列區(qū)域設(shè)計出具有高免疫原性的多表位，可作為設(shè)計所有BEFV毒株的候選疫苗。

2.3.2 病毒活載體疫苗

病毒活載體疫苗是利用基因工程技術(shù)將BEFV抗原基因重組至病毒載體內(nèi)，激發(fā)高水平的細胞免疫和細胞毒性T淋巴細胞反應。目前已被報道的有以狂犬病病毒、新城疫病毒、牛痘病毒和牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒為載體表達BEFV G蛋白的活載體疫苗。Zheng等[30]以改良的SAD B19疫苗株（LBNSE）為載體表達BEFV-G的重組狂犬病病毒LBNSE-BG，結(jié)果顯示，單劑量LBNSE-BG免疫小鼠，8周后體內(nèi)誘導出1∶63.3滴度的BEFV中和抗體。Zhang等[31]利用重組新城疫病毒系統(tǒng)表達BEFV的糖蛋白，結(jié)果顯示，rL-BEFV-G在牛中誘導中和抗體滴度為1∶128。上述研究結(jié)果表明，病毒活載體疫苗可以作為開發(fā)針對BEFV感染的疫苗一種選擇。

2.3.3 核酸疫苗

BEF核酸疫苗是將編碼BEFV G蛋白的外源基因直接導入動物體細胞內(nèi)，經(jīng)宿主細胞表達系統(tǒng)合成抗原蛋白，從而誘導宿主產(chǎn)生對該抗原蛋白的免疫應答[32]。疫苗接種后，僅針對疫苗靶向的抗原產(chǎn)生免疫反應。核酸疫苗因具有不存在毒力反強的潛在風險，免疫應答持久，易生產(chǎn)等優(yōu)勢得到了更為廣泛的關(guān)注。

Pasandideh等[9]成功表達了pcDNA3.1-G1構(gòu)建體并在小鼠免疫中證實該表達質(zhì)粒能夠誘導抗BEFV中和抗體。Abayli等[33]以pcDNA4-G質(zhì)粒免疫BALB/c小鼠，結(jié)果顯示，動物機體產(chǎn)生了一定的免疫反應，但pcDNA4-G免疫小鼠的體液免疫反應比BEFV免疫小鼠低且晚，這可能與疫苗接種途徑、免疫耐受性有關(guān)。綜上，未來研制BEF核酸疫苗需優(yōu)化表達載體，有效結(jié)合體液免疫和細胞免疫，尋找更好的免疫途徑，提高疫苗的保護率。

3 結(jié)論

BEF是一種因病程短、癥狀輕而在疫情防控中常被忽視的疾病。隨著國際牲畜貿(mào)易愈加頻繁，極大增加了BEF的傳播風險。據(jù)有關(guān)研究報告顯示，近年來BEF的病死率顯著增高，因而應對BEF的防控應引起足夠重視。由于BEF尚無特效藥治療，防控該病的前提條件是建立快速、準確有效的檢測方法。

目前，國內(nèi)外學者對BEF建立了各種檢測方法，這些方法各有優(yōu)、缺點，如病毒分離鑒定是病原學檢測的金標準，但耗時耗力；酶聯(lián)免疫吸附試驗靈敏度高、簡便，常應用于大規(guī)模檢測；分子生物學檢測方法敏感性高、特異性強，如RT-qPCR、RT-LAMP和RPA等檢測方法。因此，需根據(jù)實際情況選擇和結(jié)合使用不同的診斷技術(shù)，從而提高診斷該疾病的準確性，為BEFV的早期診斷、流行病學調(diào)查以及進出口檢疫提供技術(shù)保障。BEF疫苗的研發(fā)現(xiàn)已取得了諸多可觀的進展，已開發(fā)了多種試驗性和商業(yè)性疫苗。為得到更安全、高效、經(jīng)濟、適用性廣的BEFV疫苗，今后的研究應側(cè)重解決減毒活疫苗毒力反強等問題，提高重組活載體疫苗免疫效力，提升滅活疫苗免疫持久性。