病毒宏基因組在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用與未來(lái)展望

梁志坤 李可勝 蔣析文

感染性疾病仍是危害人類健康和全球公共衛(wèi)生安全的重要問(wèn)題，而感染性疾病有許多來(lái)源于病毒。根據(jù)以往的經(jīng)驗(yàn)來(lái)看，發(fā)現(xiàn)和鑒定新病毒以及確定新病毒與疾病的關(guān)系是預(yù)防、診斷和治療新發(fā)病毒性傳染病的首要任務(wù)。傳統(tǒng)意義上有很多用于發(fā)現(xiàn)新病毒的方法，如病毒分離、核酸檢驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)等，但是這些方法有較大的局限性。21世紀(jì)以來(lái)，隨著測(cè)序技術(shù)快速發(fā)展，尤其是下一代測(cè)序技術(shù)（Next-generation sequencing technology，NGS）的廣泛應(yīng)用和新興學(xué)科宏基因組學(xué)（Metagenomics）的出現(xiàn)為探索未知病毒提供了技術(shù)支持和理論依據(jù)。此外，但是近些年隨著人類基因組和微生物組深入研究表明，病毒與人體之間存在更廣泛的相互作用，并且有希望應(yīng)用在臨床治療上。本文主要就近些年來(lái)對(duì)病毒宏基因組的興起與發(fā)展，研究的策略以及在醫(yī)學(xué)上的一些應(yīng)用前景進(jìn)行綜述，并提出病毒宏基因組的一些未來(lái)展望。

1 病毒宏基因組的發(fā)展由來(lái)

宏基因組學(xué)于20世紀(jì)90年首次由Schmidt等［1］提出，最初是應(yīng)用于海洋微生物的研究。直到2003年，Breitbart M 才首次將病毒宏基因組應(yīng)用于人糞便中病毒信息研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了大量的新的基因型病毒，并揭示存在人體中的新病毒與人類疾病可能的關(guān)系［2］。病毒宏基因組直接以環(huán)境中所有病毒的遺傳物質(zhì)為研究對(duì)象，能夠快速準(zhǔn)確的鑒定出環(huán)境中所有的病毒組成，在病毒發(fā)現(xiàn)、病毒溯源、微生物預(yù)警等研究方面具有重要作用。截至2018年，已知來(lái)自25 個(gè)病毒家族約263種病毒可以感染人類，但是，這只占到所有可能感染人類病毒的不到0.1%，還存在大約167 萬(wàn)種病毒尚未被發(fā)現(xiàn)，而在這167 萬(wàn)種病毒中被估計(jì)大概有63.1 萬(wàn)至82.7 萬(wàn)種病毒有可能感染人類［3］，這說(shuō)明對(duì)病毒的研究具有非常廣闊的前景和現(xiàn)實(shí)意義。此后，一個(gè)國(guó)際研究團(tuán)隊(duì)，通過(guò)廣泛地研究脊椎動(dòng)物，包括魚類、兩棲動(dòng)物和爬行動(dòng)物，發(fā)現(xiàn)了超過(guò)200 種以前不為人知的病毒，而且某些病毒能夠?qū)е掳鞲泻统鲅獰岬仍趦?nèi)的疾病［4］，進(jìn)一步證明了許多未知的病毒可能感染人類。

2 宏基因組的研究策略

2.1 靶向mNGS 分析

靶向mNGS 指的是靶向富集樣本中特定類型的微生物，通過(guò)增加序列數(shù)據(jù)中病原體讀取的數(shù)量和比例來(lái)提高對(duì)目標(biāo)微生物的檢測(cè)靈敏度的一項(xiàng)技術(shù)。目前，靶向富集主要有幾種思路：①設(shè)計(jì)特定的引物來(lái)靶向擴(kuò)增：這種靶向擴(kuò)增可以是特定區(qū)域，例如16s/18s［5-7］；也可是橫跨整個(gè)基因組的，例如完整病毒擴(kuò)增［8-9］。②設(shè)計(jì)捕獲探針富集［10］，即通過(guò)捕獲探針富集對(duì)文庫(kù)進(jìn)行雜交。這些技術(shù)被證明在研究環(huán)境中提高了宏基因組檢測(cè)的靈敏度，特別是對(duì)于病毒。比如，Deng 等［11］設(shè)計(jì)的帶有靶向引物富集（MSSPE）的宏基因組測(cè)序，該方法相比于普通mNGS 可富集目標(biāo)RNA 病毒序列含量約10 倍，同時(shí)保留對(duì)其他病原體的宏基因組敏感性。Hayden 等［12］提出了一種計(jì)算方法（CATCH），可實(shí)現(xiàn)完整病毒基因組探針的設(shè)計(jì)，高效用于病毒檢測(cè)、序列捕獲，有助于實(shí)現(xiàn)更敏感和更經(jīng)濟(jì)有效的宏基因組捕獲測(cè)序。

2.2 非靶向mNGS 分析

非靶向mNGS 放棄使用特異性引物或探針，針對(duì)環(huán)境樣本中全部DNA 和/或RNA 進(jìn)行測(cè)序。臨床樣本的非靶向mNGS 可能是綜合診斷感染最有希望的方法。原則上，幾乎所有的病原體，包括病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲，都可以在一次檢測(cè)中識(shí)別。但是這種策略的一個(gè)局限性就是其靈敏度嚴(yán)重依賴于背景水平，這種情況尤其在組織樣本中特別明顯，因?yàn)椴煌跓o(wú)細(xì)胞體液，組織的樣本增加了人類宿主背景，導(dǎo)致微生物讀長(zhǎng)的數(shù)量和比例減少，從而降低了對(duì)mNGS 的敏感性［13］。此外，從一些復(fù)雜的樣本如呼吸道分泌物、糞便等中鑒定或者診斷與疾病相關(guān)的微生物也比較困難［14］。目前，非靶向mNGS 已經(jīng)有不少在臨床實(shí)驗(yàn)室成功診斷感染的案例，包括腦膜炎或腦炎、膿毒癥和肺炎等［15］，這些案列可以對(duì)實(shí)際臨床試驗(yàn)提供寶貴的參考價(jià)值。

3 病毒宏基因組在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

3.1 在臨床病原檢出中的應(yīng)用

目前，臨床上尚有一些病因不明的急性或慢性感染性疾病，給特異性診療帶來(lái)了巨大困難。相對(duì)于傳統(tǒng)的病原診斷方法，病毒宏基因組技術(shù)自發(fā)展以來(lái)，在臨床病原的鑒定上發(fā)揮了極大的優(yōu)勢(shì)。目前，已經(jīng)有大量的研究將病毒宏基因組學(xué)應(yīng)用于臨床并成功地進(jìn)行病原體檢測(cè)［16-21］。比如近些年，有許多病毒展現(xiàn)出具有感染神經(jīng)系統(tǒng)的潛力，臨床多表現(xiàn)為腦炎，研究人員通過(guò)宏基因組技術(shù)成功地鑒定出了這些病毒，其中包括埃博拉，寨卡，基孔肯雅，濃核，卡什谷，西尼羅和玻瓦桑病毒等［16-19，22-23］。宏基因組因其測(cè)序具有無(wú)偏倚性、高覆蓋和高效性的特點(diǎn)，使得與其他檢測(cè)技術(shù)如多重PCR、檢測(cè)芯片等相比，其在某些樣本中病毒感染的診斷有更高的檢出率，且能發(fā)現(xiàn)被遺漏未檢出的病毒［20-21］，說(shuō)明了病毒宏基因組在臨床上病原的鑒定具有很大的優(yōu)勢(shì)。

3.2 在公共衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用

病毒宏基因組還在公共安全衛(wèi)生方面發(fā)揮著重要作用。歷史上，利用宏基因組測(cè)序技術(shù)研究人員已經(jīng)成功鑒定多起由病毒引起的流行病，比如由埃博拉病毒引起的烏干達(dá)出血熱［24］，H1N1 型流感病毒引起的豬流感［25］、寨卡病毒感染疫情［26］和H7N9 流感病毒疫情［27］等。此外，通過(guò)追蹤溯源發(fā)現(xiàn)許多病毒很可能來(lái)源于動(dòng)物，表現(xiàn)出病毒向人類快速擴(kuò)張的跡象。比如在2019年新冠爆發(fā)初期，Wu 等［28］利用宏基因組技術(shù)，從新冠肺炎病人的支氣管肺泡灌洗液中檢測(cè)出了病原體，并通過(guò)的與之前的SARS 病毒比較，最終確定了這是一種全新的冠狀病毒SARS-CoV2，為全世界迅速展開冠疫防控、開發(fā)診斷試劑和疫苗提供不可或缺的基礎(chǔ)。因此，加大病毒宏基因組在全球的廣泛應(yīng)用將有助于我們更加了解病原感染信息，提供預(yù)防措施信息和防控疫情。

3.3 在臨床治療上的應(yīng)用

以往大多數(shù)的病毒宏基因組研究都集中在有害病原的檢測(cè)當(dāng)中，但是人體中還存在著一種感染細(xì)菌的病毒-噬菌體。噬菌體約100年前被發(fā)現(xiàn)，人們對(duì)噬菌體的研究極大的改變了生命科學(xué)的基礎(chǔ)認(rèn)知和相關(guān)研究［29］。近些年的研究表明噬菌體在人體健康中也可能發(fā)揮著重要的作用。例如，在某些疾病如炎癥性腸炎以及多種類型糖尿病患者腸道內(nèi)，其噬菌體的含量和種類都有明顯的差異，揭示腸道噬菌體組和一些疾病可能產(chǎn)生關(guān)聯(lián)［30-32］。更令人興奮的是，研究人員發(fā)現(xiàn)對(duì)小鼠通過(guò)糞便病毒體的移植可以減少Ⅱ型糖尿病和肥胖癥狀［33］。相信通過(guò)宏基因組技術(shù)，未來(lái)可以非常清楚噬菌體在其環(huán)境中的作用，并且可以通過(guò)移植噬菌體來(lái)獲得對(duì)某些疾病的治療。此外，利用噬菌體可以特異感染并殺死細(xì)菌的特性，在臨床上可用噬菌體來(lái)控制、治療超級(jí)耐藥菌的感染，并且已經(jīng)有了相關(guān)成功的案例［34］，這將有助于人類進(jìn)入后抗生素時(shí)代［35］。目前對(duì)于噬菌體的鑒定非常依賴于公共數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的噬菌體信息，但是據(jù)統(tǒng)計(jì)，在2020年之前公共數(shù)據(jù)庫(kù)噬菌體的數(shù)量還不超過(guò)1 萬(wàn)株，而據(jù)報(bào)道一個(gè)人的腸道里面就有1015-16個(gè)，所以對(duì)噬菌體的認(rèn)識(shí)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)的缺乏。而通過(guò)宏基因組技術(shù)可以從復(fù)雜的樣本中獲得噬菌體的基因組序列，并針對(duì)特定病原菌構(gòu)建更多有效的專一噬菌體數(shù)據(jù)庫(kù)，為臨床上噬菌體的應(yīng)用提供支持。例如，最近研究人員就通過(guò)宏基因組技術(shù)構(gòu)建起迄今最大的人類腸道噬菌體基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（GPD）［36］，獲得約14.2 萬(wàn)個(gè)人腸道噬菌體，大大地豐富了噬菌體的數(shù)據(jù)庫(kù)。

4 病毒宏基因組局限性

宏基因組學(xué)作為一項(xiàng)新的技術(shù)，在許多臨床實(shí)驗(yàn)中被證明是病原檢測(cè)的有效工具，特別是在病毒學(xué)當(dāng)中得到了很好的應(yīng)用。但是，目前病毒宏基因組還存在著一些局限性：①病毒宏基因組在樣本處理的時(shí)候由于過(guò)濾可能會(huì)損失一些病毒粒子，為后續(xù)分析增加難度；②病毒宏基因組的基因組比真核和原核基因組小，更容易受測(cè)序偏好的影響，有可能在實(shí)驗(yàn)過(guò)程引入外源核酸污染；③宏基因組的樣本在取樣過(guò)程中，病毒的完整性和覆蓋度，容易受到隨機(jī)引物和擴(kuò)增結(jié)果的影響；④病毒宏基因組數(shù)據(jù)庫(kù)信息缺乏，大量的病毒序列無(wú)法匹配到數(shù)據(jù)庫(kù)；⑤病毒宏基因組需要處理海量的測(cè)序數(shù)據(jù)，并且仍然缺乏一些統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的生物信息處理工具。

5 未來(lái)與展望

在過(guò)去十幾年，病毒宏基因組被證明在公共衛(wèi)生和傳染病防控方面發(fā)揮著重要的作用。目前，我國(guó)的宏基因組技術(shù)在臨床的應(yīng)用也正在完善規(guī)范的管理以及相關(guān)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的制定，并且隨著測(cè)序成本持續(xù)降低，測(cè)序規(guī)模更大，該技術(shù)在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用將越來(lái)越廣泛。此外，隨著研究的深入，未來(lái)將會(huì)產(chǎn)生了大量的測(cè)序數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)將不限于單一的宏基因組數(shù)據(jù)，而是將宏基因組學(xué)與宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)、宏蛋白組學(xué)等技術(shù)結(jié)合起來(lái)在多組學(xué)研究的層面上探索環(huán)境微生物的多樣性以及與人類健康的關(guān)系。