單細(xì)胞基因測序在腫瘤研究中的應(yīng)用

香香 董輝 王利新

隨著分子生物學(xué)技術(shù)快速發(fā)展，人們對腫瘤的發(fā)生機(jī)制以及細(xì)胞凋亡的了解與日俱增，也研究出了一些針對腫瘤分子靶向性的治療藥物，但其治療效果并不理想。主要原因是對腫瘤的起始、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移的機(jī)制只是一知半解，對于很多潛在的治療性靶點的研究始終有所欠缺。傳統(tǒng)的測序方法只能揭示聚集的混合細(xì)胞的特征，單細(xì)胞測序從一定程度上解決了傳統(tǒng)測序固有的缺陷，包括單細(xì)胞基因組測序、轉(zhuǎn)錄組測序及表觀遺傳組測序，單細(xì)胞基因組測序可用來分析單細(xì)胞水平的點突變和拷貝數(shù)變異，用于揭示細(xì)胞群體差異、細(xì)胞進(jìn)化關(guān)系等，可最真實的獲得單克隆癌細(xì)胞的具體突變來源及精準(zhǔn)的突變頻率，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序可對單細(xì)胞中mRNA 進(jìn)行基因表達(dá)定量、功能富集、代謝通路等分析，可以解決傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在各研究領(lǐng)域中的樣品量極低或細(xì)胞異質(zhì)性的問題，表觀遺傳組測序可從單細(xì)胞水平獲得全基因組范圍內(nèi)的甲基化水平數(shù)據(jù)，對于表觀遺傳學(xué)的時空特異性研究具有重要意義。本文將綜述單細(xì)胞測序在腫瘤異質(zhì)性、發(fā)病機(jī)制和治療中的應(yīng)用。

1 單細(xì)胞測序在腫瘤異質(zhì)性的應(yīng)用

腫瘤細(xì)胞會出現(xiàn)不同于正常細(xì)胞的代謝變化，并形成不同的譜系，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。單細(xì)胞測序在單個細(xì)胞層面進(jìn)行高分辨率的分析，揭示單個細(xì)胞的狀態(tài)和功能，準(zhǔn)確的區(qū)分每個腫瘤組織中不同的細(xì)胞亞群。Dai 等［1］對大腸癌腫瘤的2 824 個細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序分析，將其分為5 個不同的亞簇，發(fā)現(xiàn)不同亞簇對大腸癌腫瘤的相關(guān)性不同，其中三個簇參與細(xì)胞的外周工作，包括能量傳遞、細(xì)胞外基質(zhì)生成等；其他兩個簇中的基因更多地參與免疫過程。Yehuda 等［2］對小鼠胰腺進(jìn)行了從侵襲前階段到腫瘤形成過程中的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，鑒定了起源于腺泡細(xì)胞的acinar cells，對化生腺泡細(xì)胞異質(zhì)性的進(jìn)一步分析定義了6 種腺泡化生細(xì)胞類型和狀態(tài)。乳腺癌（Breast cancer，BC）的組織學(xué)和分子分類正在被用于臨床治療。Yao 等［3］基于28 種免疫細(xì)胞類型的富集分?jǐn)?shù)，對單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，確定了3 個BC亞型：BC-imh、BC-imm 和BC-iml，發(fā)現(xiàn)BC 中免疫反應(yīng)強(qiáng)的腫瘤比免疫反應(yīng)弱的腫瘤有更好的臨床療效，三陰性乳腺癌和人表皮生長因子受體2 陽性的BC 免疫原性更強(qiáng)，而激素受體陽性的免疫原性更低。單細(xì)胞測序技術(shù)的應(yīng)用對腫瘤進(jìn)行了更細(xì)致的臨床分型以及發(fā)現(xiàn)了在腫瘤發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞亞群，極大推動了腫瘤的分型。

2 單細(xì)胞測序在腫瘤免疫浸潤的應(yīng)用

免疫治療使腫瘤治療發(fā)生革命性改變，并使腫瘤免疫煥發(fā)出新活力。然而，腫瘤微環(huán)境的高度異質(zhì)性和可變性阻礙了對腫瘤內(nèi)免疫細(xì)胞的準(zhǔn)確分離。隨著單細(xì)胞測序的最新進(jìn)展，使得系統(tǒng)地分析腫瘤微環(huán)境成為可能，并為解析腫瘤浸潤免疫細(xì)胞的功能多樣性提供機(jī)會。Dinh 等［4］對食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell cancer，ESCC）的微環(huán)境細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)ESCC 基質(zhì)細(xì)胞類型的異質(zhì)性，確定了具有預(yù)后價值和潛在生物學(xué)意義的腫瘤特異性CST1+肌成纖維細(xì)胞亞群。Nathan 等［5］通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序繪制了31 例異檸檬酸脫氫酶（Isocitrate Dehydrogenase，IDH）野生型和IDH 突變型膠質(zhì)瘤患者的腫瘤浸潤T 細(xì)胞的基因表達(dá)和克隆圖譜，并發(fā)現(xiàn)CD161 和其他NK 細(xì)胞受體是免疫治療的靶點。Zheng 等［6］在6 例肝細(xì)胞癌患者的外周血、腫瘤和鄰近正常組織中分離的5 063 個單個T細(xì)胞中進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，鑒定了11 個T細(xì)胞亞群，亞群有自己的發(fā)育軌跡，如耗竭型CD8+T 細(xì)胞和Treg 細(xì)胞的優(yōu)先富集和克隆擴(kuò)增。Guo 等［7］通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序分析了來自3 例左右兩側(cè)大腸癌患者的27 927 個單個人類大腸癌細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一個潛在的新的RBP4+NTS+癌細(xì)胞亞群，該亞群集中在左側(cè)大腸癌，而左側(cè)大腸癌的Treg 細(xì)胞水平較高，可能對免疫治療有更高的反應(yīng)性，并且發(fā)現(xiàn)M2 樣巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的抗體依賴性細(xì)胞吞噬和毒性在左側(cè)大腸癌中更為明顯，與大腸癌的良好預(yù)后相關(guān)。腫瘤浸潤免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的調(diào)控和治療發(fā)揮了關(guān)鍵的作用，進(jìn)一步了解它在腫瘤組織中的作用機(jī)制能為腫瘤治療提供十分重要的參考和幫助，而單細(xì)胞測序可以更細(xì)致的描述腫瘤免疫浸潤。

3 單細(xì)胞測序在腫瘤免疫治療的應(yīng)用

免疫治療的研發(fā)管線主要集中在組織水平的分子特征，對免疫治療藥物靶向的細(xì)胞和途徑等機(jī)制缺乏透徹的了解，因此限制了臨床試驗的成功率。如果獲得了免疫治療前后靶細(xì)胞和作用途徑的詳細(xì)圖譜，無疑可以大大促進(jìn)免疫療法的研究進(jìn)展。Kwon 等［8］采用全外顯子組測序聯(lián)合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序強(qiáng)調(diào)了單用彭布羅利珠單抗治療的MSI-H 胃癌的反應(yīng)異質(zhì)性，顯示不同的T 細(xì)胞受體與彭布羅利珠單抗的PFS 延長有關(guān)，yPD-1+CD8+T 細(xì)胞的增加與持久的臨床益處相關(guān)。Foltz等［9］通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)對復(fù)發(fā)/難治性惰性非霍奇金淋巴瘤患者皮下注射N-803 和利妥昔單抗可誘導(dǎo)外周血NK 細(xì)胞和CD8 T 細(xì)胞持續(xù)增殖、擴(kuò)張和激活，并且可以改變NK 細(xì)胞分子程序。Telli 等［10］通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)Tavo單藥治療CD8+t 細(xì)胞浸潤增強(qiáng)的患者中表現(xiàn)為CXCR3-GS的富集，并表現(xiàn)出臨床療效，提示這種治療方法可以增強(qiáng)抗原呈遞并招募CD8 T 細(xì)胞，這是抗腫瘤療效所必需的。總之，運(yùn)用單細(xì)胞測序系統(tǒng)化地將細(xì)胞對比情況展示出來，可以獲取腫瘤細(xì)胞的組合方式和基因數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)將為醫(yī)生的診斷提供依據(jù)，為治療腫瘤提供新思路，有針對性地開展治療，判斷患者接受治療后的病情發(fā)展程度及預(yù)后情況。

4 單細(xì)胞測序研究腫瘤微環(huán)境的應(yīng)用

在當(dāng)前腫瘤研究中，腫瘤免疫微環(huán)境已成為重要的研究關(guān)注點。傳統(tǒng)測序方法不能有效識別和描述腫瘤微環(huán)境中逐個免疫細(xì)胞的種類及其所處狀態(tài)，可能掩蓋了許多關(guān)鍵的信息。通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，Kfoury 等［11］分析骨轉(zhuǎn)移性前列腺腫瘤來定義微環(huán)境的不同特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)趨化因子CCL20 和CCR6 受體在髓樣細(xì)胞中顯著過度表達(dá)。Chen 等［12］通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序分析13 例前列腺腫瘤中的36 424 個細(xì)胞，確定了疾病侵襲性的上皮細(xì)胞，觀察到了與微轉(zhuǎn)移相關(guān)的KLK3 表達(dá)，并驗證了癌細(xì)胞改變T 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的能力，還發(fā)現(xiàn)了內(nèi)皮細(xì)胞亞群在去勢耐藥前列腺癌中富集，并促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲。Chen 等［13］通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序分析膀胱癌腫瘤樣本和腫瘤旁樣本，在微環(huán)境中識別出19 種不同的細(xì)胞類型，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞下調(diào)MHC-II 分子以及單核細(xì)胞在腫瘤區(qū)域經(jīng)歷M2 極化并分化。Bartoschek 等［14］通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序分析乳腺癌基因工程小鼠模型中768 個間充質(zhì)細(xì)胞，定義了三個不同的CAF 亞群，CAF 亞類的空間分離歸因于不同的來源，包括血管周圍生態(tài)位、乳腺脂肪墊和轉(zhuǎn)化的上皮細(xì)胞。腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞成分已經(jīng)成為腫瘤進(jìn)展、治療反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，單細(xì)胞測序可以鑒定實體瘤內(nèi)細(xì)胞的異質(zhì)性，從而使實體瘤的臨床診治和轉(zhuǎn)歸預(yù)測變得更加準(zhǔn)確。

5 單細(xì)胞測序在腫瘤精準(zhǔn)治療的作用

人類的疾病，大部分并不是基因組發(fā)生了改變，而是細(xì)胞發(fā)生了變化。單細(xì)胞測序能夠?qū)γ恳粋€細(xì)胞進(jìn)行精準(zhǔn)測量。Rao 等［15］對原發(fā)性小腸神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤與匹配的肝轉(zhuǎn)移之間的細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，分析顯示，肝轉(zhuǎn)移中的神經(jīng)內(nèi)分泌上皮細(xì)胞分化較低，SSTR2 表達(dá)相對較少，主要VEGF 受體的血管表達(dá)增高，這表明轉(zhuǎn)移的血管系統(tǒng)準(zhǔn)備擴(kuò)張，容易受到血管生成抑制劑的治療。Blombery 等［16］研究了89 例慢性淋巴細(xì)胞白血病患者在長期持續(xù)的venetoclax 治療期間髓室是否出現(xiàn)臨床和分子異常，單細(xì)胞基因組測序顯示BAX與DNMT3A或ASXL1共發(fā)生克隆突變，同一患者的CLL 細(xì)胞中同時發(fā)生BCL2突變和髓室中BAX突變，表明對venetoclax 治療有譜系特異性適應(yīng)?？傊?，單細(xì)胞測序可以對個體化進(jìn)行精準(zhǔn)的診療，從而對患者的用藥指導(dǎo)提供幫助。

6 單細(xì)胞測序在循環(huán)腫瘤細(xì)胞的應(yīng)用

作為腫瘤進(jìn)展的重要指標(biāo)，對實體瘤患者外周血進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating tumor cell，CTC）單細(xì)胞測序分析有助于了解腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。Zhao 等［17］通過單細(xì)胞甲基化組測序?qū)TC甲基組的綜合分析，發(fā)現(xiàn)了一種獨特的“CTC DNA甲基化特征”，分析表明，上皮基因的啟動子甲基化是穩(wěn)定的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的標(biāo)志，有助于成為臨床診斷的無創(chuàng)甲基化生物標(biāo)志物。Malihi等［18］對有或沒有侵襲性變異前列腺癌（Aggressive variant prostate cancer，AVPC）的患者在開始化療前進(jìn)行CTC 單細(xì)胞基因組測序，評估了CTC 基因組學(xué)與臨床特征、無進(jìn)展生存期和總生存期之間的關(guān)系，結(jié)果表明，CTC 的基因組不穩(wěn)定性是晚期前列腺癌侵襲性的一個標(biāo)志，并支持單CTC 測序作為非侵入性表征腫瘤異質(zhì)性的一個有力工具。CTCs 是液體活檢的主要靶點，是腫瘤預(yù)后的重要生物標(biāo)志物，通常與不良臨床結(jié)果有直接關(guān)系，也是研究腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移機(jī)制的最適模型。

7 單細(xì)胞測序解釋腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的分子機(jī)制

腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是腫瘤疾病最特殊的方式，往往導(dǎo)致臨床治療手段束手無策，Wang 等［19］通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序分析13 例低、高復(fù)發(fā)風(fēng)險和復(fù)發(fā)性膀胱癌患者的腫瘤，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌復(fù)發(fā)期間，腫瘤干細(xì)胞亞群豐富，EZH2表達(dá)升高，從而使細(xì)胞侵襲性和干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄程序失活。Carstens等［20］通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)Snail和Twist的聯(lián)合基因抑制導(dǎo)致胰腺導(dǎo)管腺癌上皮穩(wěn)定和肝轉(zhuǎn)移增加，證明了上皮細(xì)胞的穩(wěn)定導(dǎo)致癌細(xì)胞的集體遷移。利用單細(xì)胞測序鑒定腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的分子機(jī)制具有重要的研究價值，能夠識別侵襲轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞特有的基因突變，找出腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因子，為相關(guān)診斷生物標(biāo)記物及靶向治療藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。

8 總結(jié)與展望

單細(xì)胞測序的發(fā)展改變了腫瘤研究的方法及角度，解決了一系列廣泛的問題，能夠在單個細(xì)胞水平研究腫瘤的內(nèi)部異質(zhì)性、剖析腫瘤微環(huán)境及追溯腫瘤細(xì)胞源性，揭示腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的機(jī)制。然而，單細(xì)胞測序作為一項新興技術(shù)，仍存在較多的局限，如擴(kuò)增偏倚、等位基因脫扣、假陽性率及高額成本等，但隨著SCS 技術(shù)不斷改進(jìn)，成本降低及在單細(xì)胞水平上對異質(zhì)性細(xì)胞群體進(jìn)行的研究，學(xué)者們今后可更準(zhǔn)確、快速地識別腫瘤相關(guān)突變基因及克隆構(gòu)型，揭示發(fā)病及克隆演變機(jī)制，為腫瘤的診斷與治療提供指導(dǎo)。