關(guān)于高能重離子束輻射誘變北方粳稻育種方法的思考

楊福 李景鵬 余麗霞 周利斌

（1 中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，長(zhǎng)春 130012；2 中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所，蘭州 730000；第一/通訊作者：yangfu@iga.ac.cn）

農(nóng)作物輻射誘變是指利用各種射線對(duì)生物體進(jìn)行輻射誘發(fā)產(chǎn)生變異，然后根據(jù)育種目標(biāo)對(duì)后代突變材料進(jìn)行篩選鑒定，直接或間接選育新品種的過(guò)程。常見(jiàn)的輻射誘變主要有x 射線、γ 射線、中子、離子束及多種因素結(jié)合的空間誘變[1]。在重離子束輻射農(nóng)作物誘變育種方面，1989年余增亮等[2]首創(chuàng)了低能重離子束（30 MeV/u 以下）注入技術(shù)用于農(nóng)作物品種改良，之后研究人員先后培育出水稻、小麥、玉米等農(nóng)作物新種質(zhì)及品種，取得了較好的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益[3-4]。20世紀(jì)90年代，中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所利用蘭州國(guó)家重離子加速器（HIRFL）裝置對(duì)農(nóng)作物干種子進(jìn)行重離子束輻射，先后培育出優(yōu)良的小麥及甜高粱等農(nóng)作物品種，并得到了推廣應(yīng)用[5-6]。重離子是指重于元素周期表中2 號(hào)元素He 并被電離的粒子[7]，將其通過(guò)大型加速器裝置加速而形成具有較高能量的射線就是高能重離子束（80 MeV/u 以上）[8]。實(shí)踐證明，高能重離子束輻射作為一種新的誘變技術(shù)，在穿過(guò)生物介質(zhì)時(shí)，將大量能量沉積在其徑跡上，引起DNA 單鏈或雙鏈斷裂、堿基突變和缺失[7，9]，造成DNA 鏈的錯(cuò)誤修復(fù)或非同源末端重組[8]；它不僅具有能量高、穿透能力強(qiáng)、生物效應(yīng)高、損傷小等特點(diǎn)，與以往輻射技術(shù)相比，輻射誘變的效率比60Co-γ 射線等要高出10 倍[1，10]，可大幅度提高突變率，使突變率達(dá)到5.7%以上[11]。2013年中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所與中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所緊密合作、優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，開(kāi)展了高能重離子束（12C6+）輻射北方粳稻的誘變育種工作。經(jīng)過(guò)10年的研發(fā)，創(chuàng)建了高能重離子束輻射北方粳稻“少而精”誘變育種技術(shù)體系，開(kāi)辟了一條水稻育種新途徑。首先，精選親本，選擇遺傳背景豐富、一般配合力高、抗稻瘟病、綜合性狀優(yōu)良的材料作輻射親本；其次，輻射親本種子量少，一般為200～250 粒，而60Co-γ 射線輻射通常需要幾千?；蚋郲12]；再次，M1、M2種植群體小，一般M1幾十株，M22 000 株左右；最后，后代材料盡早抓住少數(shù)有益突變性狀，跟蹤不放。目前，利用該技術(shù)已獲得1 000 多份突變體，變異類型豐富，優(yōu)良性狀多。自2020年開(kāi)始，先后有輻射優(yōu)良突變品系東稻122、東稻275、東稻812等通過(guò)吉林省農(nóng)作物品種審定。為了凝練研究成果，使高能重離子束輻射北方粳稻“少而精”誘變育種技術(shù)體系得到更好應(yīng)用，筆者將高能重離子束輻射北方粳稻誘變育種的經(jīng)驗(yàn)及技術(shù)層面的一些問(wèn)題歸納總結(jié)，期望為今后水稻高能重離子束輻射誘變育種工作提供一些參考。

1 輻射親本的選擇

大量育種實(shí)踐證明，親本的選配是育種成敗的關(guān)鍵。優(yōu)良作物品種的培育必須站在“巨人的肩膀”上，高能重離子束輻射親本的選擇也是一樣。常規(guī)育種中，玉米有骨干自交系，水稻也有骨干親本之說(shuō)法，目前最先進(jìn)的作物分子設(shè)計(jì)育種也需要引用“底盤(pán)品種”的概念。理想的親本是各育種單位經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期育種實(shí)踐篩選、總結(jié)出來(lái)的，一般親本之一都具有在生產(chǎn)上應(yīng)用時(shí)間較長(zhǎng)、推廣面積大、綜合性狀好等特點(diǎn)。但長(zhǎng)期的育種實(shí)踐表明，綜合性狀好的品種不一定是好的親本，而好的親本除綜合性狀優(yōu)良之外，一般配合力也要高?？傊?，輻射親本選擇的“試金石”應(yīng)該是輻射后能夠誘變出符合水稻育種目標(biāo)的優(yōu)異突變性狀相對(duì)要多，短時(shí)間內(nèi)能培育出優(yōu)良突變新種質(zhì)或新品種。這需要長(zhǎng)期育種實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的積累，更需要從分子水平上系統(tǒng)分析骨干親本/品種的重要基因區(qū)段、關(guān)鍵基因及等位基因（群）的遺傳變異規(guī)律，并開(kāi)發(fā)高效的分子標(biāo)記，做長(zhǎng)期的基礎(chǔ)或應(yīng)用基礎(chǔ)研究工作。

目前，高能重離子束輻射北方粳稻親本的選擇與其它育種方法一樣，應(yīng)傾向于選擇綜合優(yōu)勢(shì)強(qiáng)、抗稻瘟病、品質(zhì)優(yōu)且一般配合力高的材料。筆者結(jié)合多年常規(guī)雜交組配后代親本分布情況分析發(fā)現(xiàn)，吉林省通化市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院選育的通禾899 綜合性狀優(yōu)良，且一般配合力高，后代材料遺傳性好。2013年選用通禾899作為高能重離子束輻射親本，輻射誘變后代材料變異類型豐富，獲得了大量的突變種質(zhì)資源和優(yōu)良品系，并從2020年開(kāi)始，陸續(xù)審定了東稻122、東稻275、東稻812 和東稻862，還有大量后代材料正在抗稻瘟病、耐鹽堿及品質(zhì)鑒定過(guò)程中。此外，近些年還選擇了30 多個(gè)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中推廣面積較大、國(guó)內(nèi)優(yōu)質(zhì)水稻獲獎(jiǎng)品種作輻射親本，也取得了良好的誘變成果，創(chuàng)制了許多優(yōu)異突變后代。

2 輻射方法

2.1 輻射部位

主要以輻射水稻種子的胚為主。水稻主要靠種子繁殖，胚是由受精卵（合子）發(fā)育而成的新一代植物體的雛型（即原始體），具有胚芽、胚根和盾片等器官，是種子中最重要的組成部分，水稻的遺傳信息通過(guò)胚傳遞給后代；另外，種子還具有容易攜帶、輻射方便、體積小、易保存、繁殖系數(shù)高等特點(diǎn)，是最佳的輻射部位。

2.2 輻射數(shù)量

不同的輻射源輻射處理種子的數(shù)量有很大的差異。如60Co-γ 射線等，一般輻射幾千粒種子甚至更多，而利用高能重離子束輻射處理水稻種子的數(shù)量較少。按照筆者的經(jīng)驗(yàn)，如果每個(gè)M1單株分蘗10～15 個(gè)，每穗100 粒，按照每穗結(jié)實(shí)率5%計(jì)算，每穗結(jié)實(shí)5 粒，1個(gè)M1的半不育株大約結(jié)實(shí)50～75 粒，如果有50 個(gè)M1單株，可產(chǎn)生至少2 500 粒種子。按出苗率80%計(jì)算，可得苗2 000 株，可插100 m2本田，按平均突變率5%計(jì)算，可產(chǎn)生100 份突變株。因此，一般處理200～250粒為宜。如2013年3月采用高能重離子束（12C6+）輻射通禾899 種子150 粒，播種成活23 棵苗并插秧，結(jié)實(shí)均為半不育植株，平均結(jié)實(shí)率5%，共收獲種子1 400粒左右，下年種植成M2代，出現(xiàn)大量變異株，秋季選拔了78 份變異單株，突變率5.7%。

2.3 輻射劑量

適宜的輻射劑量是獲得良好誘變效果的前提和保證。如60Co-γ 射線等引起的輻射誘變，在一定劑量范圍內(nèi)，突變率與劑量呈正相關(guān)。近幾年，利用蘭州重離子加速器裝置（HIRFL）生物輻射終端（TR4），采用高能重離子束碳（12C6+）輻射水稻種子，胚部朝上，能量80 MeV/u，劑量率20 Gy/min，摸索出150～180 Gy 為適宜輻射劑量。目前，在輻射劑量的選擇上一般廣泛采用半致死劑量，即照射后植株的成活率與死亡率各占50%左右，結(jié)實(shí)率在30%以下[12]。半致死劑量是對(duì)大量被誘變材料M1代植株的成活率或死亡率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)而得出的，在對(duì)一個(gè)新的植物或農(nóng)作物材料進(jìn)行輻射誘變時(shí)，必須先摸索出半致死劑量，做到有的放矢。但半致死劑量只是體現(xiàn)在M1植株的成活率上，并不說(shuō)明只有采用半致死劑量輻射后代就一定能夠出現(xiàn)較多的有益突變，輻射誘變育種的最終目標(biāo)是使被輻射材料發(fā)生更多的有益突變，從中選擇符合當(dāng)前育種目標(biāo)需要的材料進(jìn)而培育出新品種。因此，在高能離子束輻射誘變育種實(shí)踐中不需過(guò)分關(guān)注半致死劑量，半致死劑量只作為輻射劑量的參考，至于半致死劑量與出現(xiàn)有益突變的概率有沒(méi)有直接的相關(guān)性還有待進(jìn)一步研究。“因事而宜”，無(wú)論劑量如何，只要在誘變后代材料中出現(xiàn)有益突變，就抓住不放，跟蹤到底。如在進(jìn)行高能重離子束碳（12C6+）輻射誘變北方粳稻的育種科研工作中，一般采用輻射劑量150～180 Gy，M1植株的成活率及結(jié)實(shí)率都明顯降低，一般成活率在10%～30%之間，結(jié)實(shí)率在30%以下，但后代材料都有不同類型的突變體出現(xiàn)，只是突變率高低有差異。至于哪個(gè)輻射劑量產(chǎn)生的有益突變多還需要今后進(jìn)一步跟蹤調(diào)查并進(jìn)行科學(xué)的統(tǒng)計(jì)分析。

3 后代材料的種植與選擇

確定M1代種植群體大小是根據(jù)M2代群體所需數(shù)量來(lái)決定，而M2代群體大小以是否能出現(xiàn)符合育種目標(biāo)要求的優(yōu)良類型和植株為依據(jù)，一般M2群體要10 000 株以上[12]。從以往的經(jīng)驗(yàn)看，采用60Co-γ 射線輻射水稻后代材料的種植規(guī)模相對(duì)較大，尤其是M2群體。昭道祖[13]報(bào)道的我國(guó)著名水稻品種原豐早是采用60Co-γ 射線輻射科字6 號(hào)干種子，從M1每個(gè)主穗上收取幾粒種子，M2代種植群體達(dá)到14 400 個(gè)單株，從中選出4 個(gè)早熟株，其中1 單株比原品種早熟40 多d，性狀良好（代號(hào)692-1），經(jīng)過(guò)5 個(gè)世代、2年多的時(shí)間育成比原品種早熟45 d 的原豐早；夏英武等[14]報(bào)道了水稻品種浙輻802 在M1代共收獲6 kg 種子，M2代種植成20 萬(wàn)株，采用混合法經(jīng)多次早熟性選擇育成。后代材料種植群體，除了需要增加育種試驗(yàn)田面積之外，更重要的是大大增加育種工作者田間選種的工作量，尤其是在東北進(jìn)行水稻育種，秋季決選是一年中重要的環(huán)節(jié)，秋季田間決選應(yīng)該下“繡花”功夫。但東北秋季初霜期早，如黑龍江省第二積溫帶常年初霜期為9月25日，吉林省長(zhǎng)春地區(qū)常年初霜期為9月28日[15]，每年秋季決選時(shí)間非常短，如果群體過(guò)大、不同生態(tài)區(qū)試驗(yàn)點(diǎn)次多，難以集中精力對(duì)好的材料進(jìn)行耐心細(xì)致選拔，會(huì)導(dǎo)致“走馬觀花”，甚至搞“突擊”，嚴(yán)重影響決選效果。采用高能重離子束輻射誘變技術(shù)M1、M2代種植群體規(guī)模較小，一般M1種植幾十株，M2代種植2 000 株左右。如水稻新品種東稻122、東稻275 等的選育是利用高能碳重離子束（12C6+）輻射150 粒通禾899 種子，M1成活23 株苗，成活率15.3%，M2代種植1 400 株，按變異性狀如抽穗期、株高、穗型、粒型、芒的有無(wú)等選拔了78 份變異單株，再經(jīng)3 代種植穩(wěn)定后選育出來(lái)的。每個(gè)世代選擇都從群體著眼，個(gè)體入手，一旦出現(xiàn)優(yōu)良株系就跟蹤不放，一跟到底。此外，既要選品種，也要選中間材料，兩條腿走路，同時(shí)開(kāi)展多點(diǎn)試驗(yàn)，邊試驗(yàn)、邊示范、邊推廣。

4 其他一些問(wèn)題

4.1 輻射親本的敏感性

同一作物的不同品種對(duì)輻射的敏感性不同[5]。水稻種子輻射后M1植株損傷程度因處理材料不同也表現(xiàn)不同，有的材料對(duì)輻射有較高耐性，反應(yīng)遲鈍，有的則表現(xiàn)高度敏感。如綏粳18、中科發(fā)5 號(hào)、通禾66 等表現(xiàn)鈍感，龍稻18、吉粳809 等表現(xiàn)敏感。但無(wú)論是敏感還是鈍感，不同材料對(duì)輻射敏感性差異的產(chǎn)生原因還不十分清楚。王佳琪等[16]選取了12 個(gè)東北粳稻品種進(jìn)行高能碳離子束（12C6+）輻射處理，結(jié)果表明，與通禾66相比，吉粳809 對(duì)高能碳離子束輻射更敏感，而抗氧化系統(tǒng)如其H2O2、O2·-和丙二醛（MDA）含量在二者輻射敏感性差異中起著重要作用。

4.2 M1 材料的天然雜交

水稻雄性不育是指雄性器官發(fā)育不完善，花粉異常，不能自交結(jié)實(shí)，而雌性器官發(fā)育正常，能夠接受外來(lái)花粉正常結(jié)實(shí)的現(xiàn)象。利用EMS 誘變水稻品種黃花占種子，經(jīng)過(guò)M1、M2代連續(xù)田間篩選得到雄性不育突變體材料[17]；利用60Co-γ 射線輻射誘變粳稻品種松香早粳種子也獲得了水稻雄性不育突變體[18]。在誘發(fā)小麥突變后代過(guò)程中也難以避免受竄粉造成的天然異交混雜[19]，CALDECOTT 等[20]的實(shí)驗(yàn)證明，在利用熱中子對(duì)燕麥Markton 品種進(jìn)行輻射誘變后代中，很多突變體可能不是輻射來(lái)的，而是由于輻射導(dǎo)致雄性器官不育而雌性器官還具有生理功能、可接受外來(lái)授粉引起的。以此推測(cè)，水稻種子經(jīng)高能重離子束輻射后，一般生理?yè)p傷將在M1代出現(xiàn)，如果種植時(shí)不設(shè)置隔離，個(gè)別M1單株也很可能出現(xiàn)小穗雌性器官發(fā)育正常而雄性器官發(fā)育受阻或花粉敗育等現(xiàn)象，也可接受外來(lái)可育花粉進(jìn)行隨機(jī)天然雜交。把這部分材料種植成M2代時(shí)實(shí)際就是雜交的F1，而真正的高能重離子束輻射導(dǎo)致的半不育M1，在種到M2代時(shí)會(huì)出現(xiàn)突變株，這種天然雜交的F1很可能也當(dāng)作突變材料被選出來(lái)，下一年種植成M3代實(shí)際是雜交的F2代，會(huì)發(fā)生分離。而真正選出來(lái)的M2代變異單株下一年種植成M3代，按照誘變育種的一般規(guī)律M3應(yīng)該是基本穩(wěn)定的，可推斷這個(gè)M2代單株來(lái)源的M3株系行是真正的輻射誘變來(lái)的，因此，由所選的M2代單株下一年全部種成M3株系行，從其穩(wěn)定情況來(lái)推測(cè)M2代真實(shí)的突變率。如果是單基因引起的“隱性大突變”，往往突變性狀在早期世代的M3、M4就基本穩(wěn)定了，這部分突變基本可以斷定是由高能重離子束輻射誘變來(lái)的；如果在M5、M6代才開(kāi)始穩(wěn)定，不排除突變是天然雜交來(lái)的。確切的結(jié)果，還需要把被高能離子束輻射處理的M1代隔離和不隔離種植，分析下一年M2代的突變情況才能得出令人信服的結(jié)論。

4.3 高世代的“瘋狂分離”

從筆者的研究來(lái)看，一般高能重離子束輻射后代大多數(shù)在早代（M3～M4）就基本穩(wěn)定，也有在M5～M6代穩(wěn)定的，這部分材料不排除有外來(lái)花粉天然雜交的可能，但仍然有少部分在高世代如M9代及以后世代發(fā)生分離或瘋狂分離的現(xiàn)象。推測(cè)，如果輻射導(dǎo)致花粉敗育雌蕊正常從而產(chǎn)生了天然雜交，按照一般的后代分離規(guī)律在M5～M6代也基本穩(wěn)定了（排除天然遠(yuǎn)緣雜交），而M9代以后仍然分離或瘋狂分離的現(xiàn)象很難用常規(guī)雜交育種后代的分離規(guī)律來(lái)解釋。筆者認(rèn)為，這部分材料很有可能還是高能重離子束輻射誘變來(lái)的，因?yàn)楦吣苤仉x子束能量高、穿透能力強(qiáng)，能夠引起被輻射水稻DNA 單鏈或雙鏈斷裂等團(tuán)簇?fù)p傷[25]，從而引起遺傳物質(zhì)發(fā)生復(fù)雜變化而導(dǎo)致的。

4.4 突變材料的變異性狀

據(jù)統(tǒng)計(jì)，與其輻射親本通禾899 相比，突變材料在抽穗期、株高、株型、穗型、粒型、穗粒數(shù)、千粒重等性狀上普遍發(fā)生了變異[11]。親本生育期為146 d，突變材料生育期變異在130～151 d 之間，如2020年通過(guò)吉林省品種審定的水稻新品種東稻122 生育期為132 d，比通禾899 早熟14 d，且耐鹽堿性突出；2022年審定的東稻812 生育期138 d，比通禾899 早熟8 d，且穗粒數(shù)更多。

4.5 突變材料的分子選擇

通過(guò)人為對(duì)突變材料進(jìn)行田間表型選擇是有效的，但增大了育種者的工作量，有時(shí)還把環(huán)境因素影響的性狀選擇出來(lái)，準(zhǔn)確性不高。高通量測(cè)序鑒定技術(shù)是未來(lái)突變體篩選的發(fā)展趨勢(shì)，應(yīng)逐步建立基于定向誘導(dǎo)基因組局部突變技術(shù)（TILING）和高分辨溶解曲線分析技術(shù)（HRM）等突變新基因的篩選技術(shù)體系。按我們的經(jīng)驗(yàn)，在突變體早期M2代對(duì)單基因控制的質(zhì)量性狀，如長(zhǎng)粒、香味、抗稻瘟病等性狀開(kāi)展分子標(biāo)記輔助選擇，能夠減少工作量，縮短育種時(shí)間。

4.6 輻射親本的重復(fù)處理

目前，輻射誘變的缺點(diǎn)是突變的方向不確定，帶有較大的隨機(jī)性，但輻射誘變具有廣譜性，即一次誘變能夠獲得多個(gè)材料同一位置多種不同程度變異及同一材料不同位置突變。是否利用輻射誘變的廣譜特性，對(duì)如通禾899 這種在以往的輻射育種實(shí)踐中被證明是好的受體親本的材料進(jìn)行高能重離子束重復(fù)輻射，這方面也需要今后做一些有益的嘗試。

總之，高能重離子束輻射誘變育種技術(shù)與其它誘變方法（化學(xué)、60Co）和常規(guī)雜交育種相比，簡(jiǎn)單、快捷、高效，能創(chuàng)造新的材料。一旦輻射受體親本選擇正確，突變體豐富，有益突變多，一次輻射能培育出多個(gè)水稻品種，能夠彌補(bǔ)雜交育種工作量大、周期長(zhǎng)，“千個(gè)組合、萬(wàn)里挑一”的不足。