基于核酸適配體的癌癥診斷新技術(shù)研究進展

黃曉明,陳勇,牛會敏

(1.福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系,福建福州 350007;2.廈門大學(xué)附屬東方醫(yī)院福建省適配體技術(shù)重點實驗室,福建福州 350025;3.聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院全軍臨床檢驗醫(yī)學(xué)研究所,福建福州 350025)

癌癥是導(dǎo)致死亡率最高的疾病之一,嚴重威脅著人類的健康和社會的發(fā)展。通過對癌癥的有效早期診斷,可以盡早進行治療以降低癌癥的病死率。盡管癌癥早期診斷技術(shù)近年來有了很大的進展,但這些方法大多存在侵入性、特異性低、靈敏度低、技術(shù)要求高、成本高等局限。因此,尋找新的癌癥早期診斷方法迫在眉睫。近年來,已有研究發(fā)現(xiàn)核酸適配體(Aptamer)具有獨特的三維結(jié)構(gòu),可特異性地結(jié)合各種靶標(biāo),具有分子量小、合成簡單、穩(wěn)定性好、免疫原性小等優(yōu)點,展現(xiàn)出傳統(tǒng)的免疫學(xué)分子和化學(xué)分子識別所無可比擬的優(yōu)勢,被視作可替代單克隆抗體的新型分子,在癌癥診斷方面具有廣闊的應(yīng)用前景。本文介紹核酸適配體在幾種常見癌癥診斷中的應(yīng)用進展。

1 核酸適配體概述

核酸適配體是長度為20～80個核苷酸的單鏈DNA或RNA,由于分子內(nèi)相互作用而折疊成獨特的二級結(jié)構(gòu),能夠以高親和力和特異性結(jié)合靶標(biāo)[1-3]。通常是利用體外篩選技術(shù)——指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX),從核酸分子文庫中得到寡核苷酸片段。自從SHANGGUAN等[4]首次開發(fā)了一種基于指數(shù)富集的全活細胞配體選擇新方法Cell-SELEX以來,適配體選擇的靶標(biāo)范圍從無機分子[5]、有機分子[6]、生物大分子[7]擴展到全活細胞[8]。

核酸適配體是基于核苷酸之間嚴格的堿基互補配對識別能力和親和力而設(shè)計的人工合成寡核苷酸,其特性十分類似于單克隆抗體的功能。與抗體相比,核酸適配體具有高特異性[9]、低毒性[10]、低成本[11]、易于合成[12]、易修飾[13]和低免疫原性[14]等優(yōu)點。與此同時,核酸適配體在結(jié)合親和力方面也可與抗體競爭,解離常數(shù)(Kd)可達pM水平[15]。此外,核酸適配體具有高度特異性,可以區(qū)分僅因小分子[16]中的一個甲基而不同的靶標(biāo),或大蛋白[17]中的一個氨基酸而不同的靶標(biāo)。

核酸適配體作為一類新型識別分子,目前已發(fā)展成為備受關(guān)注的新型檢測工具,廣泛應(yīng)用于癌癥的早期診斷,并顯示出巨大的應(yīng)用潛力和廣闊的應(yīng)用前景。

2 核酸適配體在癌癥診斷中的應(yīng)用

2.1 在胃癌診斷中的應(yīng)用胃癌是全球癌癥死亡的主要原因之一。盡管診斷方法不斷改進,但到目前為止,尚未實現(xiàn)早期檢測,而提高胃癌的早期診斷水平將有助于早期胃癌患者的良好預(yù)后。

循環(huán)腫瘤細胞在液體活檢中是腫瘤診斷和預(yù)后的重要生物標(biāo)志物。然而,循環(huán)腫瘤細胞數(shù)與胃癌之間的關(guān)系卻鮮有定量研究。LI等[18]提出了一種簡單、低成本、雙適配體(EpCAM和PTK7)修飾的免疫磁性Fe3O4顆粒(IMNs),用于胃癌患者異質(zhì)循環(huán)腫瘤細胞的高效捕獲和下游分析。原發(fā)性胃癌組織中可見PTK7高表達,且PTK7與EpCAM表達呈顯著負相關(guān)。以MGC-803和BGC-823細胞為循環(huán)腫瘤細胞模型,獲得的雙靶向IMNs能夠區(qū)分高表達或低表達EpCAM和PTK7的細胞,提高了胃癌循環(huán)腫瘤細胞識別的準(zhǔn)確性。此研究為進一步開展循環(huán)腫瘤細胞相關(guān)診斷和個體化治療的研究提供了重要參考。

外泌體是一種直徑為30～150 nm的納米囊泡,具有磷脂雙分子層膜結(jié)構(gòu),可以被各種細胞分泌并釋放到各種體液中,包括尿液、血液、眼淚、精液等,是液體活檢的理想對象。許多外泌體蛋白質(zhì)和miRNA被認為是潛在的癌癥生物標(biāo)志物,對外泌體進行液體活檢在癌癥的早期診斷、監(jiān)測和預(yù)后評估方面引起了廣泛關(guān)注。HUANG等[19]開發(fā)了一種基于分支滾圈擴增(BRCA)和靶向特異性外泌體的適配體的胃癌外泌體熒光檢測方法,該方法對目標(biāo)外泌體具有較高的特異性,檢出限為4.27×104/mL,這種基于適配體的生物傳感器在胃癌的早期診斷中具有潛力。HUANG等[20]提出了一種無標(biāo)簽的電化學(xué)適配體傳感器,用于胃癌外泌體的特異性檢測。該平臺包含抗CD63抗體修飾金電極和胃癌外泌體特異性適配體,該適配體傳感器對胃癌外泌體具有較高的選擇性和敏感性,檢出限為9.54×104/mL。雖然基于外泌體的液體活檢已被應(yīng)用于包括癌癥在內(nèi)的疾病的診斷和監(jiān)測,但基于代謝水平的外泌體的疾病檢測鮮有報道。CHEN等[21]構(gòu)建了特異的核酸修飾體耦合的金修飾多態(tài)碳(CoMPC@Au-Apt),用于捕獲早期胃癌患者和健康對照者的尿液外泌體,并在無需額外洗脫過程的情況下進行后續(xù)的外泌體代謝模式分析,這項研究說明了外泌體的高特異性和外泌體代謝分析在胃癌的早期診斷和監(jiān)測中具有廣闊前景。

2.2 在肺癌診斷中的應(yīng)用肺癌是世界上最常見和最致命的癌癥。肺癌患者預(yù)后較差,早期診斷和治療是提高肺癌患者生存率的關(guān)鍵。目前已經(jīng)發(fā)展出幾種檢測肺癌的常規(guī)方法,但這些方法大多成本高、耗時長、靈敏度低,而且還需要精密儀器[22-23]。為了克服這些因素,需要開發(fā)新的方法和試劑以實現(xiàn)肺癌的早期診斷。

BASHMAKOVA等[24]建立了一種基于一對適配體作為敏感元素和重組Ca2+調(diào)控光蛋白傳感元件作為高靈敏度生物發(fā)光報告的固相分析方法,用于檢測血液中循環(huán)的肺腫瘤元素。ZHAO等[25]使用了一種新的改良SELEX,稱為血清-SELEX,分離出可以特異性結(jié)合肺癌血清的適配體,而無需事先了解其靶點,該適配體在肺癌早期診斷中具有潛在的應(yīng)用價值。CHEN等[26]設(shè)計了一個末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)的延伸聚合適配體探針(TEPAP),該探針具有較高的靈敏性,能特異性識別NCI-H446細胞,在小細胞肺癌診斷中具有很大的潛力。

基于外泌體的體外液體活檢為快速、可靠地檢測肺癌提供了良機。ZHAO等[27]提出了一種結(jié)合功能化膜的自動化離心微流體盤系統(tǒng)(Exo-CMDS)分離和富集外泌體,然后通過一種新型的適配體熒光系統(tǒng)(Exo-AFS)處理外泌體表面蛋白,從而有效地檢測外泌體表面蛋白。與傳統(tǒng)技術(shù)相比,Exo-CMDS和Exo-AFS具有成本低、速度快、純度高、靈敏度高、特異性強等優(yōu)勢,為肺癌早期檢測提供一種切實可行的方法。

2.3 在乳腺癌診斷中的應(yīng)用乳腺癌是世界范圍內(nèi)女性最常見的癌癥,早期檢測對于改善預(yù)后和降低病死率至關(guān)重要。越來越多的研究表明,外泌體作為許多癌癥的早期診斷生物標(biāo)志物和調(diào)節(jié)因子有很大的潛力。ESPOSITO等[28]開發(fā)了一種新的差異SELEX策略,稱為Exo-SELEX,通過選擇一組抗核酸酶序列,優(yōu)化了一個高親和力適配體(ex-50.T),使其能夠特異性識別乳腺癌細胞或患者血清樣本中的外泌體。

乳腺癌的分子分型因其在個性化治療和預(yù)后方面的潛力而備受關(guān)注。然而,目前的方法不能用于精確的分型,因此在臨床實踐中提出了挑戰(zhàn)。LIU等[29]開發(fā)一種基于細胞特異性單鏈DNA(ssDNA)適配體的熒光探針,通過改進的Cell-SELEX方法對乳腺癌進行精確的分子分型。適配體sk6Ea對SK-BR-3乳腺癌細胞具有較高的特異性,不僅能在體外和體內(nèi)區(qū)分乳腺癌分子亞型,而且與其他和乳腺癌相關(guān)的適配體相比,還能將SK-BR-3乳腺癌細胞與其他癌細胞和正常細胞進行區(qū)分。這種基于適配體的探針是一種快速、高靈敏度的乳腺癌分子分型工具,在乳腺癌分子分型的鑒別、診斷和靶向治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

2.4 在結(jié)直腸癌診斷中的應(yīng)用結(jié)直腸癌(CRC)是人類最常見的癌癥類型之一。和大多數(shù)癌癥一樣,結(jié)直腸癌的存活率在很大程度上取決于疾病診斷階段。PU等[30]使用熒光標(biāo)記的抗EpCAM 19 DNA適配體(SYL3C-CY3)作為一種有效的分子探針,開發(fā)了一種基于適配體的免疫熒光方法,用于診斷來自結(jié)直腸癌患者的組織樣本中的EpCAM20陽性結(jié)直腸癌細胞。MAIMAITIYIMING等[31]基于細胞的SELEX方法篩選一種高親和力DNA適配體,能夠選擇性靶向結(jié)直腸癌Caco-2細胞。WANG等[32]基于氧化石墨烯(GO)-DNA適配體(CD63和EpCAM適配體)相互作用,開發(fā)了一種DNase I酶輔助熒光擴增結(jié)直腸癌外泌體檢測方法。

早期診斷轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌(mCRC)對改善治療和延長生存期至關(guān)重要。CHEN等[33]設(shè)計了一種基于氧化石墨烯的熒光適配體傳感器(FAM-W3-GO),用于無需洗滌流程的mCRC細胞的一步敏感檢測。在分析過程中,GO與FAM-W3結(jié)合,淬滅FAM的熒光。當(dāng)靶細胞加入后,隨著FAM-W3的釋放,綠色熒光會恢復(fù)。因此,一種用于mCRC細胞檢測的高靈敏度適配體傳感器是通過靶細胞有無時的熒光變化來實現(xiàn)的。由于對W3的特異性識別,FAM-W3-GO可用于復(fù)雜環(huán)境下mCRC細胞的檢測,檢測程序簡單,無需洗滌步驟即可實現(xiàn)一步定向檢測。

2.5 在前列腺癌診斷中的應(yīng)用前列腺癌(PCa)是世界上最常見的癌癥之一,也是許多國家男性癌癥相關(guān)死亡的主要原因。早期診斷對于PCa的治療和預(yù)后非常重要。GU等[34]利用聚乙二醇(PEG)和抗PSMA適配體修飾多壁碳納米管(MWCNTs),研制了一種新型納米聲造影劑。結(jié)果表明,與傳統(tǒng)造影劑相比,改進的多壁碳納米管具有更好的可視性和準(zhǔn)確性,能夠更有效地靶向前列腺癌細胞。ABRAHAM等[35]開發(fā)了一種與腫瘤特異性靶向DNA適配體生物偶聯(lián)的鈣-磷硅酸鹽納米顆粒,也稱為納米外套(NJs),用以增強前列腺癌的近紅外熒光成像,以提高早期癌癥的檢測。HASSANI等[36]使用絲網(wǎng)印刷碳電極(SPCE)修飾金納米顆粒(Au NPs)偶聯(lián)硫酰化適配體,設(shè)計了一種簡單、高靈敏度、經(jīng)濟的無標(biāo)簽電化學(xué)適配體傳感器,用于前列腺特異性抗原(PSA)的檢測(PSA是前列腺癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)生物標(biāo)志物),該法提供了準(zhǔn)確、可重復(fù)和高靈敏度的臨床血清樣本PSA最低水平的測定。

2.6 在其他癌癥診斷中的應(yīng)用除上述癌癥外,基于核酸適配體的檢測技術(shù)在其他人類常見癌癥診斷中也被廣泛應(yīng)用。ZHAO等[37]制備了一種基于磷脂酰肌醇-3(GPC3)適配體介導(dǎo)的超微超順磁性氧化鐵(USPIO)的靶向MRI分子探針,結(jié)果證實了該探針對表達GPC3的肝癌具有靶向成像作用。WANG等[38]以宮頸癌為模型,采用Cell-SELEX方法,以正常上皮細胞為對照進行篩選,發(fā)現(xiàn)了一種特異性與宮頸癌細胞高親和力結(jié)合的DNA適配體C-9S,該適配體具有成為宮頸癌早期檢測、體內(nèi)成像和靶向傳遞進一步研究的分子探針的巨大潛力。TSAI等[39]設(shè)計了一種集成微流體系統(tǒng),使用CX-BG1-10-A適配體檢測卵巢癌源性BG-1細胞,檢測步驟包括紅細胞裂解、白細胞耗盡和循環(huán)腫瘤細胞分離,這使其比基于抗體的檢測系統(tǒng)更加敏感。KIM等[40]報道了一種EN2特異性適配體,以及一種靈敏且特異的酶聯(lián)寡核苷酸測定法(ELONA),該法依靠適配體介導(dǎo)的雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)生成DNA納米結(jié)構(gòu),結(jié)合EN2并同時放大信號,用于膀胱癌生物標(biāo)志物EN2的快速靈敏比色檢測。GAO等[41]開發(fā)了一種基于適配體的癌胚抗原(CEA)微芯片電泳分析方法,該方法將CEA的特定適配體及其互補鏈與磁珠結(jié)合。在CEA存在的情況下,互補鏈從珠子中釋放出來,然后與另一個FAM標(biāo)記的DNA結(jié)合,開始信號傳遞過程。該方法對CEA具有較高的敏感性和特異性,檢出限為68 pg/mL,表明基于適配體的檢測方法可顯著提高胰腺癌的早期診斷率。

3 總結(jié)與展望

核酸適配體作為一類新型檢測工具,已被廣泛應(yīng)用于多種癌癥的早期診斷。但目前核酸適配體在實際應(yīng)用方面還有諸多問題需要解決,例如,在生物體液中發(fā)現(xiàn)大量核酸酶可以降解核酸適配體,且核酸適配體在體內(nèi)半衰期較短,因此,有必要設(shè)計更加穩(wěn)定的核酸適配體,以防止核酸酶的裂解。此外,核酸適配體的本質(zhì)是一段寡核苷酸,對其毒性研究實驗很少,對人體是否會產(chǎn)生不良影響還有待進一步研究。