山藥皮殘?jiān)嗵墙Y(jié)構(gòu)表征及抗氧化活性測(cè)定

杭書(shū)揚(yáng) 楊留枝,2,3 史苗苗,2,3 閆溢哲,2,3 劉延奇，2，3

(1. 鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2. 食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450001；3. 河南省冷鏈?zhǔn)称焚|(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450001)

山藥是薯蕷屬的一種藥食兩用植物[1]，富含多糖、類(lèi)黃酮、多酚、尿囊素和其他活性成分[2]。在亞洲，尤其是日本和中國(guó)，山藥被研磨成粉制成面條食用[3]，傳統(tǒng)的食用過(guò)程中所產(chǎn)生的山藥皮是其主要?dú)埩粑?，約占山藥總重量的10%～20%[4]。已有研究表明，山藥皮生物活性物質(zhì)含量(尿囊素、黃酮、多酚等)均高于其果肉[5]，在保健食品開(kāi)發(fā)利用方面具有巨大的潛力[6]。

多糖是由單糖縮合聚合物組成，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中。近年來(lái)，有關(guān)山藥中非淀粉多糖的提取、化學(xué)結(jié)構(gòu)及生物活性的研究較多[7]，植物源的非淀粉多糖已成為一類(lèi)重要的生物活性天然產(chǎn)物，在自由基清除劑中發(fā)揮重要作用，并逐漸成為一類(lèi)新型的有效抗氧化劑[8]。山藥多糖是山藥的主要活性成分，主要由甘露糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖等單糖組成，是一種具有免疫活性的植物多糖[9]。

目前，對(duì)山藥多糖的研究主要集中于其果肉多糖，有關(guān)山藥皮及其抗氧化活性的研究較少。研究擬以山藥皮和經(jīng)乙醇提取多酚、黃酮的山藥皮殘?jiān)鼮樵?，進(jìn)行多糖提取，得山藥皮多糖(P1)和山藥皮殘?jiān)嗵?P2)，同時(shí)對(duì)P1和P2的單糖組成、結(jié)構(gòu)特征及抗氧化活性進(jìn)行分析，以期為研發(fā)新型天然抗氧化產(chǎn)品，增加山藥皮經(jīng)濟(jì)效益提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮鐵棍山藥：市售；

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、無(wú)水乙醇、溴化鉀、硝酸鈉、疊氮化鈉、抗壞血酸、DPPH、復(fù)合磷酸鹽、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫、水楊酸等：分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

循環(huán)水式多用真空泵：SHB-Ⅲ型，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；

色差儀：CR400型，日本美能達(dá)公司；

高速離心機(jī)：LG10-2.4A型，北京醫(yī)用離心機(jī)廠(chǎng)；

掃描電子顯微鏡：TESCAN MIRA4型，日本Rili公司；

紅外光譜儀：Bruker TENSOR27型，德國(guó)布魯克公司；

X-射線(xiàn)衍射儀：Bruker D8型，德國(guó)布魯克公司；

差式掃描量熱儀：DSC Q20型，美國(guó)TA公司；

綜合熱分析儀：TG/DTA-A型，德國(guó)耐馳公司；

多角度激光散射凝膠滲透色譜：DAWNHELEOS Ⅱ型，美國(guó)懷雅特公司。

1.3 方法

1.3.1 提取工藝 山藥皮和山藥皮殘?jiān)シ?，過(guò)80目篩網(wǎng)，分別稱(chēng)取兩種粉末10 g，加入200 mL去離子水，磁力攪拌混勻，50 ℃萃取3 h，過(guò)濾，重復(fù)3次，合并上清液并濃縮至一定體積。自然冷卻后，加入4倍體積的無(wú)水乙醇，靜置24 h，離心，沉淀加少量去離子水溶解，冷凍干燥得粗多糖。

將兩種粗多糖按m粉末∶V水為1∶10 (g/mL)溶于去離子水，采用Sevage法去除蛋白質(zhì)2次(V多糖溶液∶V氯仿∶V正丁醇為15∶3∶1)。將多糖溶液離心，收集上層水溶液，得到不含蛋白質(zhì)的多糖溶液，透析，減壓濃縮，加入無(wú)水乙醇沉淀24 h，離心，沉淀于去離子水中復(fù)溶，凍干，得精制多糖P1和P2[10]。

1.3.2 多糖含量及顏色測(cè)定

(1) 多糖含量：采用苯酚硫酸法[11]。

(2) 顏色：采用色差儀。

1.3.3 單糖組成 參考文獻(xiàn)[12]。

1.3.4 掃描電鏡觀(guān)察(SEM) 用膠帶粘取干燥的多糖均勻涂開(kāi)，并吹去表面多余的樣品粉末，然后在真空環(huán)境中進(jìn)行噴金，加速電壓3.0 kV，選擇合適的放大倍數(shù)進(jìn)行拍攝[13]。

1.3.5 X-射線(xiàn)衍射測(cè)試(XRD) 在工作電壓30 kV，電流20 mA，衍射角(2θ)掃描范圍10°～50°下，進(jìn)行XRD譜圖掃描[14]。

1.3.6 紫外掃描測(cè)試(UV) 稱(chēng)取多糖樣品5 mg，加入5 mL 去離子水配成1 mg/mL樣品溶液，掃描范圍200～400 nm，去離子水作空白對(duì)照[15]。

1.3.7 傅里葉紅外光譜測(cè)試(FTIR) 參考文獻(xiàn)[16]，分辨率為0.4 cm-1，光譜范圍為400～4 000 cm-1。

1.3.8 剛果紅試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[17]，使用紫外分光光度計(jì)掃描400～700 nm范圍內(nèi)的最大吸收波長(zhǎng)(λmax)。

1.3.9 同步熱重分析(TG) 根據(jù)文獻(xiàn)[18]，升溫范圍為50～600 ℃，升溫速率10 ℃/min，負(fù)載氣體為N2。

1.3.10 分子量測(cè)定 采用多角度激光散射凝膠滲透色譜法，將樣品溶于去離子水中，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的水溶液，流動(dòng)相為50 mmol/L NaNO3和0.02% NaN3的混合溶液，待測(cè)樣品及流動(dòng)相經(jīng)超聲、抽濾(0.2 μm抽濾膜)后進(jìn)行分析測(cè)定[19]。

1.3.11 抗氧化能力測(cè)定

(1) DPPH自由基清除率：參考文獻(xiàn)[20]并修改。取2 mL多糖溶液與2 mL 0.1 mmol/L的DPPH-乙醇溶液混勻，37 ℃避光反應(yīng)30 min，以維生素C作陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定517 nm處吸光度，按式(1)計(jì)算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

C1——DPPH自由基清除率，%；

A0——去離子水代替樣品的吸光度；

Al——樣品溶液吸光度；

A2——無(wú)水乙醇代替DPPH的吸光度。

(2) 羥自由基清除率：參考文獻(xiàn)[21]并修改。向試管中分別加入1 mL不同濃度的多糖溶液、硫酸亞鐵溶液(6 mmol/L)和過(guò)氧化氫溶液(6 mmol/L)，混勻，靜置10 min，加入1 mL水楊酸，輕輕搖動(dòng)并保持30 min，測(cè)定510 nm處吸光度，并按式(2)計(jì)算羥自由基清除率。

(2)

式中：

C2——羥自由基清除率，%；

A0——對(duì)照組(無(wú)樣品)吸光度；

Al——試驗(yàn)組(無(wú)水)吸光度；

A2——空白組(不含水楊酸)吸光度。

(3) 還原力：參考文獻(xiàn)[22]。

(4) 總抗氧化能力：參考文獻(xiàn)[23]。

1.3.12 數(shù)據(jù)分析 各試驗(yàn)重復(fù)3次，采用Excel整理數(shù)據(jù)，IBM SPSS Statistics 22.0軟件程序Duncan檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)，采用Origin 2021軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 多糖含量及顏色

經(jīng)測(cè)定，P1、P2得率分別為(2.6±0.2)%和(2.4±0.1)%，經(jīng)苯酚硫酸法檢測(cè)得P2的多糖含量(33.5%)約為P1(17.8%)的兩倍。經(jīng)色差儀檢測(cè)，P2的L*(70.33)值大于P1(64.09)的，而其b*值(11.72)小于P1(13.93)的，說(shuō)明P2的顏色比P1白，可能是因?yàn)樯剿幤堅(jiān)谔崛↑S酮、多酚過(guò)程中被乙醇脫去了部分顏色。

2.2 單糖組成

由表1可知，兩種多糖均檢測(cè)出5種單糖成分(阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖及半乳糖)。P1中主要的單糖為甘露糖、葡萄糖及半乳糖，占比分別為(32.61±0.68)%，(33.46±0.59)%，(22.19±0.87)%，此外還含有少量的阿拉伯糖[(7.70±0.47)%]和木糖[(4.10±0.28)%]。而P1的單糖主要為甘露糖和葡萄糖[(13.80±0.52)%]，其中甘露糖含量最高，約占P2總單糖的(70.61±0.95)%，阿拉伯糖、木糖和半乳糖的含量相對(duì)較少，分別為(5.55±0.25)%，(6.44±0.18)%，(3.72±0.23)%。二者單糖成分差異很大，可能是提取山藥皮多酚、黃酮時(shí)，提取溶液對(duì)P2的單糖組成有一定的影響，需后續(xù)進(jìn)一步探究。

表1 P1、P2的單糖組成?

2.3 SEM結(jié)果

由圖1可知，P1、P2均為疏松、多孔狀結(jié)構(gòu)，P2表面有著密集細(xì)小的孔洞，可能是因?yàn)樯剿幤堅(jiān)谝掖继崛《喾印ⅫS酮過(guò)程中，多糖與多酚之間作用力消失所造成的。多糖表觀(guān)結(jié)構(gòu)的不同可能造成其分子量差異[24]，P1、P2表面樣貌的差異也可能導(dǎo)致兩種樣品分子量的差異。

圖1 掃描電子顯微鏡圖Figure 1 Scanning electron microscope images (×1 000)

2.4 XRD結(jié)果

由圖2可知，兩種多糖在15°，20°，32°附近有較強(qiáng)的吸收峰，P2和P1有著相同的峰型，但P2各吸收峰強(qiáng)度大于P1，表明山藥皮多糖中不僅存在微晶結(jié)構(gòu)，還存在晶體和非晶結(jié)構(gòu)共存的多晶系統(tǒng)。

圖2 P1、P2的X射線(xiàn)衍射圖譜Figure 2 X-ray diffraction patterns of P1 and P2

2.5 紫外掃描結(jié)果

由圖3可知，兩種多糖在260～280 nm 處均未檢測(cè)到紫外吸收峰，說(shuō)明多糖中不存在蛋白結(jié)構(gòu)，表明經(jīng)Sevage試劑處理后，兩種多糖樣品均不含蛋白質(zhì)。

圖3 P1、P2的紫外光譜圖Figure 3 Ultraviolet spectra of P1 and P2

2.6 FT-IR圖譜分析

由圖4可知，P2峰型比P1的更加明確，特征官能團(tuán)更為突出，進(jìn)一步表明P2的多糖含量與品質(zhì)較P1有一定程度的提高。3 402 cm-1處有較寬、較強(qiáng)的譜帶，該譜帶歸屬于—OH的伸縮振動(dòng)；2 935 cm-1處弱峰屬于C—H 反對(duì)稱(chēng)拉伸振動(dòng)；1 625 cm-1處出現(xiàn)不對(duì)稱(chēng)的拉伸峰，表明多糖中存在羧基，這與多糖中的水有關(guān)[25]；1 413 cm-1處為C—H剪切振動(dòng)的特征吸收峰；1 200～1 000 cm-1的波段被指定為C—O—C鍵和糖苷橋[26]的價(jià)振動(dòng)，1 154 cm-1處為O—H剪切振動(dòng)峰值；1 024 cm-1處為C—O—C拉伸振動(dòng)峰值[27]。

圖4 P1、P2的紅外光譜圖Figure 4 Infrared spectra of P1 and P2

2.7 剛果紅試驗(yàn)結(jié)果

具有三螺旋結(jié)構(gòu)的多糖在堿性條件下能與剛果紅形成絡(luò)合物，其最大吸收波長(zhǎng)(λmax)隨堿溶液濃度的增加而紅移，分子間和分子內(nèi)氫鍵斷裂，并發(fā)生了從三螺旋到單螺旋的構(gòu)象轉(zhuǎn)變[28]。由圖5可知，與對(duì)照組相比，多糖溶液的λmax紅移，說(shuō)明P1、P2均存在三螺旋結(jié)構(gòu)。此外，隨著NaOH濃度的增加，各多糖的λmax下降。

圖5 不同濃度NaOH下剛果紅多糖混合物的最大吸收波長(zhǎng)

2.8 TG結(jié)果

由圖6可知，兩種多糖具有相似的失重曲線(xiàn)形態(tài)，其失重過(guò)程可分為3個(gè)階段：① 30～200 ℃階段，樣品重量略有下降，可能是多糖失去了束縛水[29]；② 200～480 ℃階段，多糖快速失重，其重量開(kāi)始急劇下降，可能是由多糖的解聚和分解引起的[30]，多糖的大部分重量損失發(fā)生在該區(qū)域；③ 400～600 ℃階段，由于多糖完全分解，樣品的失重變得緩慢。P1、P2最終重量分別降至其初始重量的61.11%，51.04%，說(shuō)明P2的熱穩(wěn)定性不如P1。

圖6 P1、P2的TG 圖Figure 6 TG diagrams of P1 and P2

2.9 分子量分析

多糖的分子量(Mw)是影響水溶液中多糖構(gòu)型和形態(tài)的主要因素之一，并參與蛋白質(zhì)—碳水化合物相互作用，影響其生物活性。由圖7可知，多糖P1、P2分別在橫坐標(biāo)為4.57，3.54時(shí)出峰，其重均分子量分別為37 153.52，3 467.37。

圖7 P1、P2的分子量分布圖Figure 7 Molecular weight distribution of P1 and P2

2.10 抗氧化試驗(yàn)

2.10.1 DPPH自由基清除率 由圖8可知，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為0.2～1.0 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除能力與多糖、維生素C質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，P2各濃度下的清除率均顯著強(qiáng)于P1，但是P1、P2的清除率均顯著低于維生素C。P1、P2和維生素C的IC50值分別為0.964，0.586，0.016 mg/mL，DPPH自由基清除率強(qiáng)弱順序?yàn)榫S生素C>P2>P1，說(shuō)明多糖具有一定的DPPH自由基清除率，與林軍等[30]的研究結(jié)論一致。

小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.10.2 羥自由基清除率 由圖9可知，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為0.2～1.0 mg/mL時(shí)，P1、P2和維生素C的羥自由基清除能力隨溶液質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，與張秋紅[31]的研究結(jié)論一致。P1、P2和維生素C的IC50值分別為0.962，0.711，0.450 mg/mL，表明P2的羥自由基清除能力強(qiáng)于P1，但不如維生素C。

小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.10.3 還原力與總抗氧化能力 由圖10和圖11可知，兩種多糖在各濃度水平下的還原力(抗氧化能力)均不如維生素C，在試驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增加，樣品的還原力(抗氧化能力)隨之顯著增強(qiáng)，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，P2的還原力(抗氧化能力)顯著強(qiáng)于P1。

小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(P<0.05)

小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(P<0.05)

3 結(jié)論

以山藥皮和山藥皮殘?jiān)鼮樵线M(jìn)行多糖提取，并對(duì)其提取物的結(jié)構(gòu)和抗氧化性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，山藥皮殘?jiān)卸嗵翘崛〉寐逝c山藥皮中相差不大，且山藥皮殘?jiān)嗵禽^山藥皮多糖有著糖含量高、色澤亮度強(qiáng)、比表面積大、重均分子量小、抗氧化能力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)。雖然山藥皮殘?jiān)嗵蔷哂辛己玫目寡趸芰Γ俏茨艽_定其發(fā)揮抗氧化活性成分的關(guān)鍵物質(zhì)，后續(xù)可通過(guò)分離純化技術(shù)來(lái)進(jìn)一步研究。