基于高通量測序的湘派鹵牛肉細菌多樣性分析

車麗娜 趙良忠 周曉潔

(1. 邵陽學院食品與化學工程學院，湖南 邵陽 422000；2. 豆制品加工與安全控制湖南省重點實驗室，湖南 邵陽 422000)

脈沖鹵制是指利用真空和微壓條件，在低溫和中溫交替過程中完成新型鹵制方法。研究[1-2]表明，脈沖鹵制在生產(chǎn)過程中具有減少鹵汁用量，降低鹵制溫度，縮短鹵制時間，提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)能耗，保留食品風味，提高產(chǎn)品安全性等特點。采用脈沖鹵制工藝生產(chǎn)的湘派鹵牛肉風味濃郁、芳香四溢，營養(yǎng)豐富，大大降低了微生物的初始數(shù)量級，極大地提高了鹵牛肉的安全性[3]。湘派鹵牛肉作為湖湘人餐桌上不可或缺的即食性食品之一，其使用的湘派鹵汁是由八角、桂皮等十多種中藥材熬制而成，鹵制過程中不添加防腐劑、護色劑。其“藥鹵”“浸漬”“香辣”的特點深受消費者喜愛，具有廣大的消費市場，但其常在無包裝的情況下銷售，極易被微生物污染變質(zhì)[4]，進而影響食品的安全性，因此對其細菌多樣性進行研究十分必要?，F(xiàn)階段對鹵牛肉的研究多集中于加工工藝、品質(zhì)特性及風味物質(zhì)變化規(guī)律[5-8]等方面。

微生物作為鹵牛肉研究中常測指標之一，主要采用傳統(tǒng)的微生物學分析方法，研究方法較為繁瑣，無法較全面地探索鹵牛肉中細菌的菌群分布和變化情況。為系統(tǒng)研究鹵牛肉中細菌群落結(jié)構(gòu)組成及其多樣性變化，研究擬采用高通量測序技術對不同貯藏時間湘派鹵牛肉的細菌多樣性和菌群結(jié)構(gòu)進行分析，揭示湘派鹵牛肉貯藏過程中細菌菌群結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化，以期為湘派鹵牛肉的抑菌保鮮、保持風味和延長貨架期提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料

牛肉、豬筒子骨：當天新鮮樣品，市售；

鹵料：八角、桂皮、小茴香、香葉、甘草、花椒等，市售；

十六烷基三甲基溴化銨抽提液(CTAB)：北京諾博萊德科技有限公司；

高保真PCR預混液與GC緩沖液(Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer)、高保真DNA聚合酶(Phusion?High-Fidelity DNA polymerase)、DNA文庫制備試劑盒(NEB Next?Ultra DNA Library Prep Kit)：New England Biolabs；

DNA純化回收試劑盒：天根生化科技有限公司；

瓊脂糖：范德北京生物科技有限責任公司。

1.1.2 試驗儀器

脈沖鹵煮機(真空脈沖鹵制設備)：FYLZ-1型，北京康得利機械設備制造有限公司；

雙人單面垂直凈化工作臺：SW-CJ-2FD型，江蘇通凈凈化設備有限公司；

酶標儀：Multiskan FC型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

高速冷凍離心機：5084R型，德國Eppendorf公司；

PCR儀：PTC100TM型，美國MJ Research公司；

拍擊式均質(zhì)機：BagMixer400CC型，法國Interscience公司；

凝膠成像系統(tǒng)：GelDo-cEQ型，伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品(上海)有限公司；

立式高壓滅菌鍋：GI54DWS型，美國致微有限責任公司；

測序系統(tǒng)：NovaSeq 6000型，美國Illumina公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 湘味特色鹵制牛肉樣品的制備 湘派鹵汁熬制參照伍濤等[9]的方法，將鹵料加入筒子骨高湯中熬制3 h，過濾后加入菜籽油、自制焦糖、食鹽等配料。新鮮牛肉洗凈切塊，置于90 ℃左右的水中預煮3 min，冷卻后參照李海濤等[3]的方法進行鹵制，鹵制參數(shù)為鹵制溫度80 ℃，鹵制時間80 min，真空度0.03 MPa，脈沖次數(shù)為3。牛肉經(jīng)當日熬制好的鹵汁鹵制、晾涼后，用無菌袋密封包裝，放至4 ℃冰箱內(nèi)冷藏貯存。分別于冷藏0，4，8，12，16 d取樣，樣品于包裝內(nèi)拍擊粉碎均勻后，每個時間點取3組平行樣。其中貯藏0 d的樣品為對照組，分別記為LNR0d1，LNR0d2，LNR0d3，其余組為試驗組，分別冷藏4，8，12，16 d，標記為LNR4d1，LNR4d2，LNR4d3，LNR8d1，LNR8d2，LNR8d3，LNR12d1，LNR12d2，LNR12d3，LNR16d1，LNR16d2，LNR16d3。將拍擊粉碎均勻的樣品于無菌操作臺中稱取10 g，于20 mL無菌取樣杯中密封保存，置于-40 ℃冰箱冷凍，留樣待測。

1.2.2 基因組DNA的提取及PCR擴增 采用CTAB法[10]提取樣品基因組DNA，并使用質(zhì)量分數(shù)為1%的瓊脂糖凝膠對其純度和濃度進行電泳檢測，電泳電壓為100 V，電泳時間為40 min，再將適量樣品DNA采用10倍稀釋法，用無菌水稀釋至1 ng/μL，放入EP管中備用。以稀釋后的基因組DNA為模板，選擇16S rDNA序列引物[11]515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’)、806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)進行PCR。

PCR反應體系：15 μL 2×Phusion Master Mix、1 μL 1 μmol/μL PrimerF、1 μL 1 μmol/μL PrimerR、10 μL 1 ng/μL gDNA，ddH2O補足30 μL。

反應程序：98 ℃預變性1 min，循環(huán)一次；98 ℃變性10 s；50 ℃退火30 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸30 s；72 ℃延伸5 min，循環(huán)一次；維持在4 ℃。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的混樣和純化 取5 μL PCR產(chǎn)物使用質(zhì)量分數(shù)為2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，電泳電壓為80 V，電泳時間為40 min，結(jié)合膠圖上的marker，判斷分子量是否符合目的條帶，合格后，對目的條帶進行回收。

1.2.4 文庫構(gòu)建和數(shù)據(jù)處理 使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量，使用NovaSeq6000系統(tǒng)進行上機測序。測序完成后，截去Barcode和引物序列后使用FLASH(V1.2.7,http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)拼接得到原始Tags數(shù)據(jù)經(jīng)Qiime軟件(Version 1.9.1，http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)對Tags進行截取、過濾、去除嵌合體序列后，利用Uparse算法(Uparse v7.0.1001，http://www.drive5.com/uparse/)對獲得的有效序列進行聚類、利用blast方法(http://qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html)與Unit(v8.2)數(shù)據(jù)庫(https://unite.ut.ee/)進行物種注釋分析后，再使用MUSCLE(Version 3.8.31，http://www.drive5.com/muscle/)軟件進行序列比對，最后使用Qiime軟件(Version 1.9.1)、R軟件(Version 2.15.3，http://r-project.org)進行Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品基因序列質(zhì)量評估及Alpha多樣性分析

2.1.1 Alpha多樣性分析 經(jīng)高通量測序，15個樣品共獲得有效基因序列1 116 813條，平均每個樣品產(chǎn)生74 454條，有效序列平均長度在415～429，有效序列比例>87%，采用Chao1、Ace、Shannon、Simpson指數(shù)以及群落覆蓋度指數(shù)等對得到的有效優(yōu)化序列進行分析[12]，結(jié)果如表1所示。全部樣品的OTU覆蓋率為97%～99%，說明測序結(jié)果能夠準確反映全部樣品中的細菌組成。OTU數(shù)量與樣品中的細菌豐度呈正相關[13]，樣品LNR4d、LNR12d和LNR16d的OTU數(shù)量偏少，只有200左右，其他樣品中的OTU數(shù)量基本均在300以上，說明這3個樣品中細菌種類較少，其中LNR4d的OTU數(shù)量最少，可能是由于樣品由室溫轉(zhuǎn)至4 ℃冰箱冷藏，在其冷藏過程中，溫度驟降，抑制了細菌的生長繁殖，與孫丹丹等[14]的研究結(jié)果類似：4 ℃的溫度對微生物的生長繁殖有一定的抑制作用，也對延長食品的貨架期有一定的作用。而LNR12d和LNR16d的OTU數(shù)量驟降，可能是因為在貯藏前期，好氧微生物大量生長繁殖，消耗了包裝中的氧氣，導致貯藏后期，環(huán)境中氧含量降低，抑制了好氧微生物的生長繁殖，且內(nèi)源酶和外源酶降解了樣品中的蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，為優(yōu)勢菌種的生長提供營養(yǎng)物質(zhì)，使其大量繁殖并產(chǎn)生代謝物和毒素等引起了部分物種死亡[15-16]。Shannon指數(shù)大，Simpson指數(shù)小，表明樣本菌群多樣性指數(shù)高。LNR0d較LNR16d而言，菌群多樣性高；LNR8d較LNR12d而言，菌群多樣性高；LNR4d菌群多樣性最低。Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)越大，表明樣品中菌群豐度越高。5組樣品中，LNR8d中細菌菌群豐度最高，LNR4d中最低，與OTU數(shù)量的變化一致。

表1 樣品微生物多樣性指數(shù)

2.1.2 細菌群落OTU水平的Venn圖分析 如圖1所示，LNR0d，LNR4d，LNR8d，LNR12d，LNR16d樣品中的總OTU數(shù)分別為835，294，1 046，442，389，獨有的OTU數(shù)分別為547，136，793，236，220，5組樣品共有的OTU數(shù)量為70，而貯藏第0～4，4～8，8～12，12～16天的樣品中共有的OTU數(shù)分別為132，127，148，116。根據(jù)總OTU數(shù)量可知，LNR8d中的細菌多樣性最高，LNR4d中的細菌多樣性最低，與Alpha多樣性分析結(jié)果一致。樣本中獨有的OTU呈先降低后升高再降低的趨勢，與總OTU變化趨勢相似，且前后時間段之間共有的OTU變化幅度較小，說明湘派鹵牛肉在冷藏過程中其菌群結(jié)構(gòu)變化較大，但主要菌群變化較小[16]。

圖1 樣品中細菌群落OTU的維恩圖Figure 1 Venn diagram of OTU of the bacterial community in the sample

2.2.3 Shannon曲線分析 Shannon曲線趨于平坦，說明測序深度足夠[17]。由圖2可知，在對15份湘派鹵牛肉中的細菌進行高通量測序時，當測序深度達到50 000時，曲線均趨于平穩(wěn)。隨著測序增加，細菌的多樣性幾乎不變，表明測序深度達到50 000時已經(jīng)可以反映樣品中細菌的豐度信息。

圖2 Shannon曲線Figure 2 Shannon index curve

2.2 湘派鹵牛肉貯藏過程中細菌群落組成分析

2.2.1 門水平下的細菌群落組成分析 圖3(a)為15個樣品除去未分類的菌群，剩余細菌菌群在門分類水平下相對豐度排名前10的菌落結(jié)構(gòu)分布圖?？傮w來看：這15個樣品中的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和藍細菌門(Cyanobacteria)，在貯藏期間，厚壁菌門的相對豐度為46.27%～91.88%，變形菌門的相對豐度為3.21%～49.85%，藍細菌門的相對豐度為0.31%～34.46%，3種菌群的相對豐度呈動態(tài)變化趨勢。圖3(b)為15個樣品除去未分類的菌群，剩余菌群組間門水平上的物種相對豐度排名前10的柱形圖。由圖3(b) 可知，厚壁菌門基本上是湘派鹵牛肉低溫貯藏過程中的絕對優(yōu)勢菌門，在LNR0d、LNR4d、LNR8d、LNR12d樣品中，變形菌門為第二優(yōu)勢菌，而在LNR16d樣品中，藍細菌門超過變形菌門(12.63%)成為新的第二優(yōu)勢菌群，相對豐度到達32.43%。杜瑞等[18]研究發(fā)現(xiàn)厚壁菌門和變形菌門是發(fā)酵肉制品的優(yōu)勢菌門。黃鄭朝等[19]研究發(fā)現(xiàn)厚壁菌門、藍藻菌門(Cyanophyta)和變形菌門是發(fā)酵香腸中的優(yōu)勢菌門。鄧祥宜等[20]發(fā)現(xiàn)宣恩火腿發(fā)酵過程中細菌門水平上的微生物群落主要有：厚壁菌門、變形菌門等。王馨蕊等[21]在諾鄧火腿加工過程中細菌群落的動態(tài)變化研究中發(fā)現(xiàn)：厚壁菌門、變形菌門等細菌為發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌群。以上研究結(jié)果均與湘派鹵牛肉的研究結(jié)果類似。有研究[22-25]表明：厚壁桿菌門主要包括一些芽孢桿菌、乳酸菌和葡萄球菌等，其中包括影響食品貨架期有害菌，且近年來發(fā)現(xiàn)厚壁菌門微生物是高蛋白食品中常見的優(yōu)勢腐敗菌。因此，鹵牛肉作為高蛋白的動物性食品，需防范厚壁菌門微生物的污染。

圖3 各樣品和組樣品在門水平下的細菌群落結(jié)構(gòu)Figure 3 Bacterial community structure of the samples and groups at phylum level

2.2.2 屬水平下的細菌群落組成分析 圖4(a)顯示的是15個樣品中除去未分類細菌菌群外，剩余相對豐度排名在前10的細菌群落結(jié)構(gòu)分布情況；圖4(b)為15個樣品除去未分類菌群外，剩余細菌菌群組間排名前10的細菌群落結(jié)構(gòu)分布情況，在16 d的貯藏期內(nèi)，優(yōu)勢菌種呈不斷變化的趨勢。在LNR0d的3個樣品中，除了LNR0d1的優(yōu)勢菌種為腸桿菌屬(Enterobacter)以外，優(yōu)勢菌屬為芽孢桿菌屬(Bacillus)。在LNR4d的3個樣品中，除去LNR4d2的優(yōu)勢菌屬為芽孢桿菌屬外，其余兩個樣品的優(yōu)勢菌屬為巨大球菌屬(Macrococcus)。在LNR8d的3個樣品中，除去LNR8d3的優(yōu)勢菌屬為腸桿菌屬外，其余兩個樣品的優(yōu)勢菌屬為魏斯氏菌屬(Weissella)。在LNR12d的3個樣品中，除去LNR12d3的優(yōu)勢菌屬為腸桿菌屬外，其余兩個樣品的優(yōu)勢菌屬為芽孢桿菌屬。在LNR16d的3個樣品中，unidentified_Chloroplast為優(yōu)勢菌屬。由圖4(b)可知，在樣品LNR0d、LNR12d中，優(yōu)勢菌種為芽孢桿菌屬，相對豐度為28.36%，25.96%，且隨著貯藏時間的延長，芽孢桿菌屬呈動態(tài)變化趨勢，在樣品LNR4d、LNR8d、LNR16d中的相對豐度分別為29.10%，18.24%，14.19%，可能與其生物學特性有關。相關研究[26]也證實了芽孢桿菌屬中部分菌種為兼性厭氧菌，在真空包裝條件下可良好生長，芽孢桿菌的這一生物學特性可以很好地解釋為何其能成為貯藏期間的優(yōu)勢菌屬。腸桿菌屬作為優(yōu)勢菌屬之一，相對豐度為19.39%，15.56%，腸桿菌屬同樣也是樣品LNR8d的優(yōu)勢菌屬，相對豐度為19.50%。腸桿菌屬兼性厭氧，廣泛分布于自然界，普遍存在于人和動物中，鹵牛肉樣品中含有腸桿菌屬，其原因可能是在鹵制品鹵制好后的攤涼過程中，被空氣中的腸桿菌污染，因此，在鹵制品的冷卻過程中應該特別注意腸桿菌的污染。此外，魏斯氏菌屬(18.55%)、芽孢桿菌屬(18.24%)、巨大球菌屬(8.79%)也同樣是湘派鹵牛肉貯藏過程中的優(yōu)勢菌屬。樣品LNR4d中，優(yōu)勢菌種為巨大球菌屬，相對豐度為30.62%。且在樣品LNR4d中，芽孢桿菌屬的相對豐度僅次于巨大球菌屬。在樣品LNR16d中，優(yōu)勢菌種雖為unidentified_Chloroplast(32.41%)但其芽孢桿菌屬(14.19%)、巨大球菌屬(10.38%)的相對豐度>10%。其中芽孢桿菌屬、巨大球菌屬、魏斯氏菌屬均屬于厚壁菌門，而腸桿菌屬則屬于變形菌門。有研究[27]表明：芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、腸桿菌屬為肉類中的優(yōu)勢腐敗微生物。在屬水平上，隨著貯藏時間的延長，優(yōu)勢菌群呈動態(tài)變化趨勢。

圖4 各樣品和組樣品在屬水平下的細菌群落結(jié)構(gòu)Figure 4 Bacterial community structure at the genus level for each sample and group

2.2.3 主成分分析 由圖5可知，累計方差貢獻率為75.02%，其中PC1的貢獻率為47.08%，PC2的貢獻率為27.94%。在所有樣品中，LNR4d、LNR12d、LNR16d組內(nèi)樣品之間距離較小，表明其組內(nèi)細菌群落結(jié)構(gòu)差異較小，且LNR16d組內(nèi)細菌群落結(jié)構(gòu)相似度較LNR4d和LNR12d而言高；而LNR0d和LNR8d組內(nèi)樣品之間距離較大，表明其組內(nèi)細菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。這可能是由于菌群在樣品中分布不均導致的?？傮w來看，LNR0d和LNR8d樣品分布于第一、四象限，LNR4d樣品分布于第三、四象限，LNR12d樣品分布于第一、三、四象限，LNR16d樣品分布于第二象限。綜上，15個樣品之間的細菌結(jié)構(gòu)差異較大。

圖5 各樣品主成分分析圖Figure 5 Principal component analysis diagram of each sample

2.2.4 湘派鹵牛肉的LEfSe分析 LEfSe分析(圖6)表明，5組不同貯藏時間下的湘派鹵牛肉共有17個差異指示種，其中，LNR4d有4個，LNR8d有1個，LNR12d有3個，LNR16d有9個，LNR0d一組缺失，表明此組中并無差異顯著的物種。以LNR16d中差異指示種數(shù)量最多，豐度最高。其中，LNR4d～LNR16d樣品中屬水平下貢獻最大的細菌菌群分別為巨大球菌屬、微小桿菌屬(Exiguobacterium)、乳桿菌屬(Lactobacillus)。相關研究[19]表明：巨大球菌屬中的溶酪大球菌作為內(nèi)源發(fā)酵劑可提高對脂肪和蛋白質(zhì)的分解作用，可耐受一定濃度的食鹽。其可在鹵牛肉中生長繁殖，因?qū)ι矬w無致病作用[28]，故其存在于鹵牛肉中并不會對鹵牛肉的安全性造成影響。乳桿菌屬中的發(fā)酵乳桿菌有抑菌的功能特性[29-31]，這可能也是貯藏后期微生物豐度降低的原因之一。

圖6 LDA值分布柱狀圖和進化分支圖Figure 6 Histogram of LDA value distribution and evolutionary branching diagram

3 結(jié)論

采用高通量測序的方法對湘派鹵牛肉4 ℃貯藏期間的細菌多樣性進行分析可知：LNR8d中細菌多樣性和豐度最高，LNR4d最低；樣品貯藏過程中，15個樣品中的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門、變形菌門和藍細菌門，優(yōu)勢菌屬如下：LNR0d的樣品中優(yōu)勢菌屬為芽孢桿菌屬(28.36%)；LNR4d的樣品中優(yōu)勢菌屬為巨大球菌屬(30.62%)；LNR8d的樣品中優(yōu)勢菌屬為腸桿菌屬(19.50%)；LNR12d的樣品中優(yōu)勢菌為屬芽孢桿菌屬(25.96%)；LNR16d的樣品中優(yōu)勢菌屬為unidentified_Chloroplast(32.41%)。整體而言，15個樣品的組內(nèi)樣本之間距離較大，表明其菌群差異性較大；由LEfSe分析可知：樣品中屬水平下貢獻最大的細菌菌群分別為巨大球菌屬、微小桿菌屬、乳桿菌屬，進化分析圖表明細菌菌群結(jié)構(gòu)與貯藏時間有關。綜上，大致可以推斷出引起冷藏過程中鹵牛肉貨架期的微生物為芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、腸桿菌屬中的部分微生物。因此在鹵牛肉的貯藏過程中，可通過抑制上述菌屬的生長繁殖來延長鹵牛肉的貨架期，如在鹵牛肉包裝中充入CO2、N2等氣體[31]，或者可加入針對性的抑菌劑如ε-聚賴氨酸鹽酸鹽、乳酸鏈球菌素(Nisin)等[32]，從而達到抑菌的效果。由試驗結(jié)果可知：芽孢菌屬由于其耐高溫的特性使其在貯藏0 d時屬于優(yōu)勢菌屬，因此，可根據(jù)芽孢桿菌的生理特性適當調(diào)整鹵制工藝，從而起到抑制其初始菌的效果，其次還可根據(jù)芽孢萌發(fā)特性[33]調(diào)整其后期貯藏條件。脈沖鹵制對于其他菌群有較好的抑制效果，后期優(yōu)勢菌群的改變可能是在樣品鹵制后的冷卻過程中被環(huán)境中的微生物所影響，因此在冷卻過程中要特別注意冷卻環(huán)境中的微生物含量，可在冷卻前事先對冷卻環(huán)境采取一定的滅菌措施，如紫外殺菌等。