丁香-肉桂藥對揮發(fā)油的抗氧化作用研究

曾鵬輝 竇 晨 高家菊 金 月 侯安國，3 馬云淑,2*

1.云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，云南 昆明 650500；2.云南省高校外用給藥系統(tǒng)與制劑技術(shù)重點實驗室，云南 昆明 650500；3.云南省彝醫(yī)藥與傣醫(yī)藥重點實驗室，云南 昆明 650500

中藥丁香(CaryophylliFols)來源于桃金娘科植物的干燥花蕾，具有溫中降逆、溫腎助陽等功效[1]；肉桂(Cinnamomumcassia)來源于樟科植物肉桂的干燥樹皮，具有散寒止痛、溫經(jīng)通脈等功效[2]。丁香、肉桂的配伍使用是在遵守中醫(yī)藥理論指導(dǎo)的前提下，通過長期中醫(yī)臨床應(yīng)用實踐總結(jié)出來的經(jīng)典散寒止痛藥對，臨床上常用于各類治療關(guān)節(jié)炎性病癥的外用貼劑中配伍使用，如傷濕止痛膏、復(fù)方南星止痛膏、通絡(luò)祛痛膏等。研究[3]表明，炎性病變在骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機理中起著非常重要的作用，軟骨細胞、滑膜細胞以及浸潤的免疫細胞釋放的大量炎癥因子，都會對關(guān)節(jié)的合成代謝和分解代謝過程產(chǎn)生影響。此外，炎癥還會導(dǎo)致中性粒細胞的炎性浸潤，對機體造成氧化損傷并產(chǎn)生大量自由基，進而加速軟骨破壞[4]。

氧化應(yīng)激在關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程中也起到相當重要的作用，活性氧類(ROS)的過量積累不僅會影響軟骨細胞的合成代謝，加速軟骨細胞衰老和凋亡，還會導(dǎo)致軟骨基質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變從而喪失正常的生物功能，促進關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[5-7]。綜上所述，關(guān)節(jié)炎的形成發(fā)展與炎癥及氧化應(yīng)激有著密不可分的關(guān)系。

研究[8-9]表明，丁香中的丁香酚有良好的抗炎抗氧化作用，可降低細胞中多種炎癥因子的釋放，并有較好的清除自由基能力。肉桂的抗炎抗氧化作用主要體現(xiàn)在對炎癥細胞因子、環(huán)氧化酶、免疫細胞及相關(guān)信號通路的調(diào)節(jié)[10]。丁香、肉桂的主要活性成分丁香酚、肉桂醛等均為揮發(fā)性成分[11]，本文采用GC-MS對丁香-肉桂藥對混合提取的揮發(fā)油化學(xué)成分進行研究，探索藥對揮發(fā)油抗氧化作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，評價其抗氧化活性，為丁香-肉桂藥對臨床合理應(yīng)用于關(guān)節(jié)炎病癥及其作用機制分析提供實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 材料 丁香、肉桂均購自昆明德陽遠知中藥飲片有限責任公司，經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院張潔副教授鑒定為桃金娘科植物丁香的干燥花蕾和樟科植物肉桂的干燥樹皮。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、磷酸鹽緩沖液(PBS)均購買于美國BI公司；脂多糖(LPS)、二甲基亞砜(DMSO)為美國Sigma公司；MTT(貨號G4000，美國Progema公司)；乳酸脫氫酶(LDH)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)；抗壞血酸(VC)、過氧化氫、水楊酸鈉、七水合硫酸亞鐵、冰醋酸均為分析純，購自廣州光華科技股份有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、三吡啶基三嗪(TPTZ)、2，2-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、硫酸鐵、無水乙酸、三氯化鐵，無水乙醇、30%過氧化氫、鹽酸、水楊酸鈉、無水乙酸鈉均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。小鼠單核巨噬細胞RAW264.7，中國科學(xué)院上海細胞庫。

1.2 儀器 Agilent 7890a-5975c氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國Agilent公司)；酶標儀(美國Thermo Scientific公司)；4750E型CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國NUAIRE公司)；PX822ZHE電子天平(d=0.01 g，奧豪斯儀器有限公司)；10 L揮發(fā)油提取器(四川蜀玻有限公司)。

2 方法

2.1 揮發(fā)油的提取與GC-MS分析 取丁香和肉桂飲片適量，將其粉碎后各稱取200 g和600 g混合，加水量為6.4 L，浸泡8 h，回流提取6 h，收集上層的揮發(fā)油并加入無水硫酸鈉，靜置過夜以去除水分，離心得丁香-肉桂藥對混合揮發(fā)油(丁香-肉桂揮發(fā)油)。取0.2 mL丁香-肉桂揮發(fā)油，用正己烷定容至10 mL并超聲，過濾，備用。

氣相色譜條件：安捷倫DB-5MS柱(0.25 mm×30 m，0.25 μm)；初始柱溫為40 ℃(停留1 min)，先以10 ℃/min速率升溫9 min至130 ℃并保持5 min，再以8 ℃/min速率升溫15 min至250 ℃并保持5 min；設(shè)定進樣口端溫度為280 ℃，所使用載氣為高純氦氣，保持載氣流量為1 mL/min；采用分流進樣模式，分流比10∶1，進樣量1 μL；設(shè)置溶劑延遲時間為4 min，總分離時間為35 min。

質(zhì)譜條件：電離轟擊方式為EI，電子能量調(diào)整為70 eV，設(shè)定離子源溫度230 ℃，質(zhì)譜端溫度250 ℃，質(zhì)量掃描范圍：m/z 50～600。

2.2 ABTS+自由基清除能力的測定 參考文獻[12]的方法并稍作改進，將7 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L的過硫酸鉀混合，黑暗處靜置12 h，用無水乙醇稀釋生成的ABTS+溶液，使其在30 ℃，734 nm波長下的吸光度為(0.7±0.02)，即得到ABTS+工作液。取150 μL的ABTS+溶液加入50 μL不同濃度樣品液，空白組用甲醇代替樣品溶液，對照管用蒸餾水代替ABTS+工作液，重復(fù)試驗3次，室溫避光放置30 min，于波長734 nm下測定其吸光度。

2.3 DPPH自由基清除能力的測定 參考文獻[13]的方法并稍作改進，配制0.2 mmol/L DPPH工作液，取100 μL的DPPH溶液加入同體積不同濃度樣品液，空白組用甲醇代替樣品溶液，對照管用甲醇代替DPPH工作液，重復(fù)試驗3次，室溫避光放置30 min，于波長517 nm下測定其吸光度。

2.4 總還原力FRAP法測定 參考文獻[14]的方法并稍作改進，配置FRAP工作液，將300 mmol/L的醋酸鹽緩沖液，10 mmol/L-TPTZ和20 mmol/L的FeCl3按照10∶1∶1的比例混勻，37 ℃水浴30 min，現(xiàn)配現(xiàn)用。195 μL的FRAP試劑和5 μL不同的樣品液37 ℃孵育6 min，重復(fù)試驗3次，室溫避光放置30 min，于波長593 nm下測定其吸光度。

2.5 揮發(fā)油細胞毒性試驗 將RAW264.7細胞按5.0×104個/孔接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。棄去上清，實驗組加入不同濃度樣品溶液處理細胞；對照組細胞加入完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，每孔加20 μL的MTT溶液，置于恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去上清液后再加入150 μL二甲基亞砜，振蕩溶解10 min。492 nm下測定吸光值。

2.6 H2O2誘導(dǎo)巨噬細胞氧化損傷模型 將RAW264.7細胞按5.0×104個/孔接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，進行分組處理，對照組加入含0.1% DMSO的完全培養(yǎng)基，實驗組分別加入不同濃度的H2O2溶液，孵育8 h。采用MTT法檢測吸光度，操作同2.5。

2.7 丁香-肉桂揮發(fā)油對H2O2誘導(dǎo)的RAW264.7細胞存活率影響 取RAW264.7細胞按5.0×104/孔的細胞濃度接種在96孔板中，置于5%CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，進行分組處理，對照組加入含0.1% DMSO的完全培養(yǎng)基，實驗組分別加入不同濃度的丁香-肉桂揮發(fā)油溶液，每組6個復(fù)孔，24 h后全部組加入H2O2溶液孵育8 h。采用MTT法檢測吸光度，操作同2.5。

2.7 氧化因子測定 將RAW264.7巨噬細胞按照每孔4.0×105個的細胞濃度接種在6孔板中(每孔加入2 mL)，孵育24 h。去除培養(yǎng)基，對照組和模型組加入含0.1% DMSO的完全培養(yǎng)基，實驗組加入含有不同濃度揮發(fā)油的培養(yǎng)基孵育24 h，然后模型組和實驗組更換為含600 μmol/L H2O2的培養(yǎng)基處理8 h，對照組更換為完全培養(yǎng)基。按照試劑盒說明書要求收集培養(yǎng)基上清液或者細胞蛋白用于測定SOD、CAT、LDH和GSH的含量。

3 結(jié)果

3.1 GC-MS分析 如圖1所示，丁香-肉桂揮發(fā)油通過GC-MS檢測到了22種成分，依據(jù)NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索分析鑒定出20種揮發(fā)性成分，其峰面積之和占總峰面積的97.88%。其中丁香酚、α-古巴烯、β-石竹烯、肉桂醛這四種成分相對含量較高。具體成分信息見表1。

表1 丁香-肉桂揮發(fā)油的成分表

表1(續(xù))

圖1 丁香-肉桂揮發(fā)油總離子流圖

3.2 ABTS+法 如圖2所示，當丁香-肉桂揮發(fā)油濃度從6.25 μg/mL增加到50 μg/mL，對ABTS+自由基的清除率從4.81%增加到85.12%，后趨于穩(wěn)定，其IC50為(24.15±1.03)μg/mL。隨著揮發(fā)油濃度的增加，其對ABTS+自由基的清除率也隨之增加，表明丁香-肉桂揮發(fā)油對ABTS+自由基有較好的清除作用，其抗氧化作用在低濃度時弱于維生素C(VC)，高濃度時相當。

圖2 丁香-肉桂揮發(fā)油對ABTS+自由基的清除率圖

3.3 DPPH法 如圖3所示，隨著丁香-肉桂揮發(fā)油濃度的增加，其對DPPH自由基的清除率也隨之增加，當丁香-肉桂揮發(fā)油濃度從6.25 μg/mL增加到100 μg/mL，對DPPH自由基的清除率從5.11%增加到78.82%，其IC50為(47.23±1.89)μg/mL，表明丁香-肉桂揮發(fā)油對DPPH自由基有一定的清除作用，但抗氧化作用弱于VC。

圖3 丁香-肉桂揮發(fā)油對DPPH自由基的清除率圖

3.4 FRAP法 抗氧化劑可以通過提供單個電子的可以使Fe3+-TPTZ配合物還原成藍色的Fe2+-TPTZ配合物，因此可以從吸光度值來判斷抗氧化劑的總抗氧化能力[15]。如圖4所示，總抗氧化能力與丁香-肉桂揮發(fā)油濃度呈現(xiàn)量效關(guān)系，丁香-肉桂揮發(fā)油具有一定的抗氧化能力，但其總抗氧化能力弱于VC。

圖4 丁香-肉桂揮發(fā)油的總抗氧化能力圖

3.5 丁香-肉桂揮發(fā)油對RAW264.7細胞的存活率檢測 如圖5所示，20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL丁香-肉桂揮發(fā)油對RAW264.7細胞的細胞活力具有較好的維持作用，分別達到95.73%、96.89%、92.77%；120 μg/mL丁香-肉桂揮發(fā)油給藥組細胞活力為69.14%，因此本實驗選擇給藥劑量為20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL。結(jié)果表明，0～80 μg/mL丁香-肉桂揮發(fā)油對RAW264.7細胞沒有毒性。

圖5 丁香-肉桂揮發(fā)油對RAW264.7細胞的存活率檢測圖

3.6 H2O2造模實驗 如圖6所示，使用H2O2刺激細胞后會使細胞的存活率下降，且隨著濃度增大，其對細胞的殺傷力越大。當H2O2濃度為600 μmol/L時，此時細胞存活率接近一半。因此后續(xù)實驗選擇600 μmol/L的H2O2刺激RAW264.7細胞產(chǎn)生氧化損傷模型。

圖6 H2O2對RAW264.7細胞存活率的影響圖

3.7 給藥后存活率檢測 丁香-肉桂揮發(fā)油對對氧化損傷模型細胞的存活率如圖7所示，與正常組相比，模型組細胞的存活率顯著降低；與模型組相比，不同濃度的丁香-肉桂揮發(fā)油組細胞存活率較模型組分別提高。表明丁香-肉桂揮發(fā)油可減少因H2O2刺激而引起的細胞死亡。

圖7 丁香-肉桂揮發(fā)油對氧化損傷模型細胞的存活率圖

3.8 氧化因子測定 乳酸脫氫酶(LDH)是葡萄糖酵解所必需的酶，LDH不僅可將葡萄糖催化脫氫為丙酮酸，還可進一步將丙酮酸還原為乳酸，故LDH活性與巨噬細胞激活程度相關(guān)，是巨噬細胞激活的標志之一[16]。由圖8可知，模型組與對照組相比，細胞內(nèi)的LDH水平顯著升高(P<0.01)；藥物組與模型組相比，丁香-肉桂揮發(fā)油各劑量組均能顯著降低巨噬細胞LDH活性(P<0.05)，且濃度越高，效果越好，呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。

圖8 丁香-肉桂揮發(fā)油對H2O2誘導(dǎo)的巨噬細胞內(nèi)LDH含量的影響圖

谷胱甘肽(GSH)是一種由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成的三肽，具有抗凋亡、抗炎、促進組織修復(fù)、清除自由基等多種重要生理功能[17-18]。由圖9可知，模型組與對照組相比，細胞內(nèi)的GSH水平顯著降低(P<0.01)；藥物組與模型組相比，丁香-肉桂揮發(fā)油各劑量組均能顯著提高巨噬細胞GSH活性(P<0.05)，且濃度越高，效果越好，呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。

圖9 丁香-肉桂揮發(fā)油對H2O2誘導(dǎo)的巨噬細胞內(nèi)GSH含量的影響圖

丙二醛(MDA)含量是反映機體抗氧化潛在能力的重要參數(shù)，MDA含量升高引發(fā)生物膜中的多不飽和脂肪酸發(fā)生氧化反應(yīng)，并且其分解產(chǎn)物會引起細胞損傷，改變細胞膜構(gòu)型、結(jié)構(gòu)和通透性進而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激[19]。由圖10可知，模型組與對照組相比，細胞內(nèi)的MDA水平顯著提高(P<0.01)；與模型組相比，丁香-肉桂揮發(fā)油各劑量組均能顯著降低巨噬細胞MDA活性(P<0.05)，且濃度越高，效果越好，呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。

圖10 丁香-肉桂揮發(fā)油對H2O2誘導(dǎo)的巨噬細胞內(nèi)SOD含量的影響圖

超氧化物歧化酶(SOD)是生物體內(nèi)的一種抗氧化金屬酶，它能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫，在機體氧化與抗氧化平衡中起到至關(guān)重要的作用[20]。由圖11可知，模型組與對照組相比，細胞內(nèi)的SOD水平顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，丁香-肉桂揮發(fā)油各劑量組均能顯著提高巨噬細胞SOD活性(P<0.05)，且濃度越高，效果越好，呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。

圖11 丁香-肉桂揮發(fā)油對H2O2誘導(dǎo)的巨噬細胞內(nèi)MDA含量的影響圖

4 討論

在正常情況下，需氧生物通過組織良好的酶和非酶的自我防御系統(tǒng)來維持細胞穩(wěn)態(tài)[21]。當機體內(nèi)氧自由基主要是ROS的過度表達，會使細胞受損，最終導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生[22]。巨噬細胞不僅參與宿主防御，有識別和清除微生物病原體的功能，同時也是ROS等促氧化劑作用的主要靶點[23]。因巨噬細胞易受ROS影響且在免疫系統(tǒng)中非常重要，故研究多采用巨噬細胞作為氧化損傷模型[24-26]。

研究結(jié)果顯示，丁香-肉桂揮發(fā)油對ABTS+自由基和DPPH自由基都有較好的清除作用，其總抗氧化能力與丁香-肉桂揮發(fā)油濃度呈現(xiàn)量效關(guān)系；且能顯著提高經(jīng)H2O2誘導(dǎo)損傷后的RAW264.7細胞存活率；細胞中SOD和GSH活性明顯提高，同時MDA和LDH含量顯著降低。因此丁香-肉桂揮發(fā)油是通過提高抗氧化酶活性，抑制脂質(zhì)過氧化酶反應(yīng)的活性來達到抗氧化的作用效果。

據(jù)文獻[27]報道，丁香揮發(fā)油中相對含量較高的成分有丁香酚、β-石竹烯、乙酸丁香酚酯和α-古巴烯等。肉桂揮發(fā)油中肉桂醛、α-古巴烯、α-蒎稀、β-蒎稀、α-依蘭油烯等的成分含量較高[28]。結(jié)合GC-MS分析結(jié)果可知，文獻[29-30]報道的丁香、肉桂各自揮發(fā)油中含量最高的幾個成分，在二者混合提取時均有出現(xiàn)，其中β-石竹烯、α-古巴烯等成分在揮發(fā)油中的相對含量較高，且有研究發(fā)現(xiàn)其單體成分均具有良好的抗氧化作用。有待進一步研究驗證丁香-肉桂揮發(fā)油發(fā)揮抗氧化作用是否主要與β-石竹烯、α-古巴烯等有關(guān)。

本文初步探究丁香-肉桂揮發(fā)油的體外抗氧化活性和對氧化損傷細胞的保護作用，為丁香-肉桂的聯(lián)合抗氧化應(yīng)用與抗骨關(guān)節(jié)炎提供了一定的依據(jù)，但該藥對配方應(yīng)用對其抗骨關(guān)節(jié)炎與抗氧化作用的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機制尚需開展進一步相關(guān)動物、細胞分子生物學(xué)等實驗研究，為該藥對在臨床合理應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。