達烏里芯芭質(zhì)量綜合評價方法研究

白碩雅 王秀梅 娜布其 其樂木格 辛 穎 王青虎

內(nèi)蒙古民族大學蒙醫(yī)藥學院，內(nèi)蒙古 通遼 028000

達烏里芯芭CymbariadahuricaL.為玄參科芯芭屬多年生草本植物，分布于中國黑龍江、內(nèi)蒙古、河北等省區(qū)。其味微苦，性涼，具有燥 “希日烏素”，清熱、止痛、止癢、消腫、止血等功效，用于治療類風濕關(guān)節(jié)炎、黃水瘡、皮膚瘙癢、陰囊瘙癢、陰道瘙癢癥、腫塊、外傷出血等癥[1-2]。文獻[3-7]報道達烏里芯芭主要化學成分有環(huán)烯醚萜及其苷、苯丙素苷、黃酮類、單萜、倍半萜及有機酸等。對達烏里芯芭質(zhì)量控制方面進行研究，劉淑貞等[8]以木犀草素為對照品，采用TLC法建立了芯芭的真?zhèn)舞b別方法，鄔國棟等[9]以C8柱為固定相，以0.1%磷酸水-甲醇(99∶1)流動相，采用高效液相色譜法測定芯芭中梓醇的含量，烏仁曹布道等[10]采用高效液相色譜法建立芯芭中6個環(huán)烯醚萜苷的含量測定方法，但按藥材質(zhì)量評價體系向多指標成分綜合評價發(fā)展要求，現(xiàn)已建立的達烏里芯芭質(zhì)量控制方法無法有效地評價達烏里芯芭的內(nèi)在質(zhì)量。本文擬將按照2020版《中國藥典》質(zhì)量標準內(nèi)容要求，建立達烏里芯芭定性定量方法，補充一般檢查項目，為綜合評價達烏里芯芭的質(zhì)量控制提供可靠依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀 (Agilent 1260 Quat Pump VL輸液泵，1260 DAD WR檢測器，LC OpenLab CDS 2工作站，1260 MCT柱溫箱)；AUW220D型電子天平(日本島津)；超聲KQ-600DB型波沖洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；納氏比色管(天津市奧淇洛譜商貿(mào)有限公司)；砷鹽檢查裝置(泰州市康之達實驗器材有限公司)；水分測定儀(北京若水合科技有限公司)。

1.2 材料 硅膠G(上海海洋化工廠)；標準砷溶液(100 μg/mL，批號：20200720，北京北方偉業(yè)計量技術(shù)研究院)；甲醇、乙腈(Fisher Scientific Inc, United States)；超純水為自制；其它試劑均為分析純。對照品：梓醇、桃葉珊瑚苷、8-表番木鱉和益母草苷均為自制，純度均大于98%以上。不同批次達烏里芯芭采集信息見表1，經(jīng)內(nèi)蒙古民族大學蒙醫(yī)藥學院藥用植物鑒定教研室紅艷副教授鑒定均為正品。

表1 達烏里芯芭采集信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 樣品液制備 稱取12批樣品粉末各2.0 g，放入錐形瓶(50 mL)中，加二氯甲烷(20 mL)，用超聲波清洗器處理30 min，過濾，藥渣自然晾干后加甲醇(20 mL)，超聲波清洗器處理30 min，過濾，濾液濃縮至10 mL，即得樣品液。

2.1.2 對照液制備 稱取益母草苷、梓醇和8-表番木鱉對照品適量，用甲醇配成10 μg/mL的對照液。

2.1.3 TLC條件 益母草苷和梓醇∶吸附劑為硅膠G，以三氯甲烷-甲醇-甲酸(14∶6∶1)為展開劑，以10%硫酸乙醇溶液為顯色劑。8-表番木鱉∶吸附劑為硅膠G，以三氯甲烷-甲醇-甲酸(14∶7∶1)為展開劑，以10%硫酸乙醇溶液為顯色劑。

2.1.4 TLC展開、顯色及分析 吸取12批樣品液20 μL和對照液8 μL點于同一硅膠板(長和寬為20 cm×10 cm, 厚度為2 mm)上，展開，取出，晾干，10%硫酸乙醇溶液顯色，結(jié)果如圖1～3所示。從圖1～3可知，在實驗優(yōu)化的薄層色譜條件下，供試液中與益母草苷、梓醇和8-表番木鱉對照品Rf值相同斑點存在，并其Rf值合理、斑點清晰、重現(xiàn)性好。

S.對照液；1～12.樣品液圖1 益母草苷的TLC圖

S.對照液；1～12.樣品液圖2 梓醇的TLC圖

S.對照液；1～12.樣品液圖3 8-表番木鱉的TLC圖

2.2 一般檢查

2.2.1 重金屬檢查

2.2.1.1 供試液制備 按2020版中國藥典有機破壞-硫代乙酰胺法項下，取本品粉末4.00 g，重金屬檢查要求處理，制備供試液。

2.2.1.2 標準鉛溶液制備 按有機破壞-硫代乙酰胺法要求，制備標準鉛貯備液。實驗開始前，用標準鉛貯備液配成濃度為10 μg/mL的標準鉛溶液。

2.2.1.3 檢查方法 分別吸取12批供試液和標準鉛溶液2.0 mL，放入納氏比色管中，依有機破壞-硫代乙酰胺法項下進行檢查，結(jié)果顯示供試液產(chǎn)生的顏色均淺于標準液，說明符合中國藥典的要求(含重金屬不得過10 mg/kg)。

2.2.2 砷鹽檢查

2.2.2.1 供試液制備 按2020年版《中國藥典》古蔡氏法項下，取本品4.0 g，按古蔡氏法要求進行有機破壞并制備供試液。

2.2.2.2 標準砷溶液制備 實驗開始前，將標準砷溶液稀釋成濃度為1.0 μg/mL。

2.2.2.3 檢查方法 吸取12批供試液各12.5 mL和標準鉛溶液(1.0 μg/mL)2 mL，放入A瓶中，依古蔡氏法進行檢查，結(jié)果(如圖4所示)顯示12批供試液產(chǎn)生斑點的顏色均淺于標準液，說明符合中國藥典的要求(含砷量不得過10 mg/kg)。

S.標準鉛溶液；1～12.供試液圖4 砷鹽檢查結(jié)果圖

2.2.3 水分測定 按2020年版《中國藥典》甲苯法水分測定要求，分別稱取12批供試品20.0 g，置于圓底燒瓶中，加甲苯適量，連接好水分測定裝置，加熱10 h，冷卻分層后讀出水分體積，計算其水分含量，結(jié)果見表2。如表2所示，12批供試品中水分含量變化在4.96 %～6.97 %。

表2 12批樣品中水分、灰分及浸出物測定結(jié)果 (n=3)

2.2.4 灰分測定 稱取12批供試品適量，經(jīng)馬弗爐有機破壞，按2020年版《中國藥典》灰分檢查項下進行總灰分與酸不溶性灰分的測定，結(jié)果見表2。如表2所示，12批供試品中灰分量變化在8.36%～13.10 %，而酸不溶灰分在1.16%～ 9.01%。

2.2.5 浸出物檢查 按2020年版《中國藥典》熱浸法項下要求，用水、乙醇作為溶劑進行測定，結(jié)果見表2。如表2所示，12批供試品中水溶性浸出物含量變化在24.50%～41.18%，而醇溶性浸出物在19.56%～35.25%。

2.3 含量測定

2.3.1 溶液制備

2.3.1.1 樣品液制備 12批次達烏里芯芭藥材粉末(過 60 目篩)各1.0 g，精密稱定，分別置于具塞錐形瓶(50 mL)中，加20 mL甲醇，超聲 30 min，過濾，濾液上加入活性炭1.0 g，放置2 h，過濾，濾液用 0.45 μm 有機微孔濾膜過濾，即得供試液。

2.3.1.2 對照品儲備液制備 精密稱取梓醇、桃葉珊瑚阿苷和益母草苷對照品各10 mg，分別加甲醇10 mL配成1.00 mg/mL的梓醇、桃葉珊瑚阿苷和益母草苷對照品儲備液。

2.3.2 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5μm)；流動相：乙腈(A)-水(B)；梯度洗脫，A：0～13 min，15%～25% ；13～20 min，25%～45%；檢測波長：210 nm；流速：1.0 mL/min。在上述色譜條件下，梓醇、桃葉珊瑚阿苷和益母草苷的系統(tǒng)適用性試驗結(jié)果顯示，分離度(R)大于1.5，達到基線分離效果，理論塔板數(shù)(n)均不低于7000，其HPLC圖(如圖5所示)。

A.樣品液；B.混合對照液；R1.梓醇；R2.桃葉珊瑚阿苷；R3.益母草苷圖5 樣品液和混合對照液HPLC圖譜

2.3.3 標準曲線繪畫及檢測范圍確定 利用微量移液器精密吸取梓醇、桃葉珊瑚阿苷和益母草苷對照品儲備液適量，分別置于量瓶(10 mL)中，用甲醇配成梓醇的濃度為0.50 mg/mL，而桃葉珊瑚阿苷和益母草苷的濃度為0.20 mg/mL，在“2.3.2”項下色譜條件下進行測定，進樣量分別為2.5 μL、5 μL、7.5 μL、10 μL、12.5 μL、15 μL，計算其回歸方程式。結(jié)果見表3。

表3 線性關(guān)系結(jié)果

2.3.4 精密度試驗 在上述色譜條件下，連續(xù)進梓醇、桃葉珊瑚阿苷和益母草苷對照品溶液6次，計算梓醇、桃葉珊瑚阿苷和益母草苷峰面積的相對標準偏差(RSD)，分別為0.61%、0.72% 和0.59 %，表明儀器精密度較好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 用液相進樣針吸取同一供試品溶液(TZ1)10 μL，在上述色譜條件下，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h進樣，測得峰面積，計算梓醇、桃葉珊瑚阿苷和益母草苷相對含量的RSD，分別為1.2 %、0.76%和1.3 %，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.6 重復性試驗 稱取同一供試品(TZ1)6份，每份1.0 g，精密稱定，照“2.3.1.1”項下制備樣品溶液，進樣測定，計算梓醇、桃葉珊瑚阿苷和益母草苷相對含量的RSD分別1.4 %、1.2 %和1.5 %。

2.3.7 加樣回收率試驗 取供試品(TZ1)0.50 g，共 6 份，精密稱定，按樣品中原有量與對照品加入量的比例為1∶1的要求分別加入梓醇、桃葉珊瑚阿苷和益母草苷對照品適量，按“2.3.1.1”項下供試品溶液的制備制備供試品溶液，進樣測定，計算加樣回收率和RSD。結(jié)果見表4。

2.3.8 樣品測定 取 10批樣品各適量，分別按“2.3.1.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.3.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結(jié)果見表5。

表5 樣品含量測定結(jié)果 (mg/g，n=3)

3 討論

薄層色譜鑒別時，石油醚-乙酸乙酯-甲酸，環(huán)己烷-丙酮-甲酸及三氯甲烷-甲醇-甲酸等不同梯度展開系統(tǒng)對益母草苷、梓醇和8-表番木鱉的影響進行了考察。當益母草苷和梓醇的展開劑為三氯甲烷-甲醇-甲酸(14∶6∶1)、8-表番木鱉的展開劑為三氯甲烷-甲醇-甲酸(14∶7∶1)時，益母草苷、梓醇和8-表番木鱉的的斑點清晰、Rf值合理和分離度好。按2020版中國藥典各檢查項下要求，開展了重金屬檢查、砷鹽檢查、水分測定、灰分測定及浸出物檢查等項目。從表2可以看出，12批達烏里芯芭中重金屬、砷鹽、水分均符合中國藥典標準。12批達烏里芯芭中總灰分在4.91%～ 8.36%，而酸不溶灰分在1.16%～8.39%。12批芯芭中水溶性浸出物24.50%～41.18%，而醇溶性浸出物在19.56%～35.25%。

實驗對流動相乙腈-水、甲醇-水、乙腈-磷酸水及甲醇-磷酸水等二元梯度洗脫系統(tǒng)進行了考察，結(jié)果乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫，A：0～13 min，15%～25% ；13～20 min，25%～45%為流動相時，被檢測成分梓醇、益母草苷和桃葉珊瑚阿苷的分離度效果好，分析時間合理。分梓醇、益母草苷和桃葉珊瑚阿苷在200～400 nm范圍內(nèi)進行掃描，在210 nm處均最大吸收。

從表3可以看出，梓醇、益母草苷和桃葉珊瑚阿苷的線性關(guān)系(r>0.9993)在較寬的濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好。從精密度、穩(wěn)定性和重復性實驗結(jié)果得出，該方法的精密度、穩(wěn)定性和重復性均較好，RSD均小于2.0 %；從表4看出，梓醇、益母草苷和桃葉珊瑚阿苷的平均回收率在96.53 %～97.27 %范圍內(nèi)，RSD也均小于2.0 %。從表5看出，梓醇、益母草苷和桃葉珊瑚阿苷在不同批次達烏里芯芭中相對含量變化分別為(10.32±0.13)～(11.81±0.16)、(4.03±0.05)～(4.91±0.07)、(2.54±0.03)～(2.93±0.05)mg/g。

綜述，通過本實驗研究，建立了達烏里芯芭的質(zhì)量綜合評價體系，為該藥材的質(zhì)量控制提供了有力依據(jù)。