微波消解ICP-MS法對(duì)活血止痛軟膠囊、片、膠囊中30種重金屬及無(wú)機(jī)元素分析

曹 玉 史 達(dá) 陳 潔,2 張 玲,2*

1.南京市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)院，江蘇 南京 210000；2.南京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 211166

活血止痛膠囊、活血止痛片、活血止痛軟膠囊均由當(dāng)歸、三七、乳香(制)、冰片、土鱉蟲、煅自然銅6味藥組成，具有活血散瘀、消腫止痛的功效，用于跌打損傷、瘀血腫痛[1]，臨床多用于治療急、慢性軟組織損傷類疾病。制劑中自然銅為礦物藥，存在伴生的重金屬及有害元素殘留風(fēng)險(xiǎn)，其中Pb、Hg、As、Cd、Cu是普遍存在的毒重金屬，研究[2-4]表明Pb在人體內(nèi)的清除速率較慢，長(zhǎng)期低劑量接觸對(duì)人體肝、腎、骨骼、神經(jīng)系統(tǒng)都會(huì)產(chǎn)生危害。目前自然銅的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版(以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》2020版)一部未對(duì)重金屬進(jìn)行控制，活血止痛制劑中僅膠囊劑《中國(guó)藥典》2020年版執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)收載了Pb、As、Hg三種重金屬及有害元素限度控制?；钛雇雌瑘?zhí)行標(biāo)準(zhǔn)(國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)YBZ01112005-2009Z、YBZ25062005-2010Z、YBZ25142005-2009Z、YBZ30222005-2009Z等)及軟膠囊《中國(guó)藥典》2020年版執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)均未對(duì)上述重金屬元素進(jìn)行控制。

本研究參照《中國(guó)藥典》2020年版、美國(guó)藥典15種重金屬元素限度[5-6]、《ICH Q3D元素雜質(zhì)指導(dǎo)原則》[7]中原料輔料元素相關(guān)限度規(guī)定，通過(guò)電感耦合等離子體質(zhì)譜法對(duì)活血止痛制劑的Pb、Hg、As、Cd、Cu等毒重金屬檢驗(yàn)，對(duì)比國(guó)際相關(guān)無(wú)機(jī)元素限度標(biāo)準(zhǔn)，深入研究其涵蓋的無(wú)機(jī)元素含量[8]，同時(shí)對(duì)制劑中存在的多種人體有益無(wú)機(jī)元素分析，進(jìn)一步明確活血止痛口服制劑質(zhì)量安全及藥效量化元素基礎(chǔ)，為合理評(píng)價(jià)含自然銅礦物藥活血止痛口服制劑質(zhì)量提供參考價(jià)值。

1 儀器與試劑

Agilent 7900 ICP-MS儀；CPA225D 十萬(wàn)分之一電子天平 (Sartorius 公司)，Milli-Q 純水儀(默克公司)；MARS 6型微波消解儀(美國(guó)CEM公司)；聚四氟乙烯微波消解管(CEM)。

多元素標(biāo)準(zhǔn)混合溶液[Ag、Al、As、B、Ba、Be、Ca、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、K、Li、Mg、Mn、Mo、Na、Se、Sr、Tl、V、Zn,質(zhì)量濃度：100 μg/mL；唯一標(biāo)識(shí)：21D60453]；[Au、Hf、Ir、Pd、Rh、Ru、Sb、Sn、Te,質(zhì)量濃度：100 μg/mL；唯一標(biāo)識(shí)：21D60005]；單元素標(biāo)準(zhǔn)混合溶液[Mg，質(zhì)量濃度：1000 μg/mL；唯一標(biāo)識(shí)：206034-5；Na，質(zhì)量濃度：1000 μg/mL；唯一標(biāo)識(shí)：1906024-7；Os，質(zhì)量濃度：100 μg/mL；唯一標(biāo)識(shí)：21D4200；K，質(zhì)量濃度：1000 μg/mL；唯一標(biāo)識(shí)：206033-4；Hg，質(zhì)量濃度：1000 μg/mL；唯一標(biāo)識(shí)：20A038-7；Pb，質(zhì)量濃度：1000 μg/mL；唯一標(biāo)識(shí)：20C002-6；Ca，質(zhì)量濃度：1000 μg/mL；唯一標(biāo)識(shí)：203049-8；Ni，質(zhì)量濃度：1000 μg/mL；唯一標(biāo)識(shí)：21D50216；Fe，質(zhì)量濃度：1000 μg/mL；唯一標(biāo)識(shí)：214038-6；Cu，質(zhì)量濃度：1000 μg/mL；唯一標(biāo)識(shí)：20C013-3];內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)混合溶液[Bi、Ge、In，質(zhì)量濃度：10.0 μg/mL；唯一標(biāo)識(shí)：21D81077]。以上均購(gòu)自國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心。硝酸(優(yōu)級(jí)純，F(xiàn)isher Chemical)，水為超純水(Milli-Q制備)。

活血止痛膠囊47批，活血止痛軟膠囊7批，活血止痛片29批，均為市售。來(lái)源為南京中山制藥有限公司、湖北惠海希康制藥有限公司、江蘇萬(wàn)高藥業(yè)股份有限公司等8家生產(chǎn)企業(yè)。

2 方法與結(jié)果

2.1 儀器條件 射頻功率：1550 W；采集模式：質(zhì)譜圖；峰形：3點(diǎn)；重復(fù)次數(shù)3次,掃描/重復(fù)時(shí)間100次；穩(wěn)定時(shí)間：10 s；分辨率：標(biāo)準(zhǔn)；蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速：0.3 r/s；樣品引入時(shí)間：20 s；穩(wěn)定時(shí)間：20 s；采樣深度：8.0 mm；霧化氣：1.09 L/min；霧化室溫度：2 ℃；氦氣流量：4.5 mL/min。

2.2 微波消解條件 采用程序升溫，在600 W下，5 min內(nèi)升溫至120 ℃，維持5 min；相同功率下，4 min鐘內(nèi)再次升溫至160 ℃，維持5 min；3 min內(nèi)升溫至180 ℃，維持30 min；待程序結(jié)束后，冷卻至60 ℃以下，取出消解罐。

2.3 溶液的制備

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 精密吸取兩種多元素標(biāo)準(zhǔn)混合溶液(100 μg/mL)及Os單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL)、Ni單元素標(biāo)準(zhǔn)混合溶液(1000 μg/mL)、Pb單元素標(biāo)準(zhǔn)混合溶液(1000 μg/mL)適量，加2%硝酸至50 mL量瓶中，制得10 μg/mL儲(chǔ)備液；精密吸取K、Ca、Na、Mg、Al各單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL至50 mL量瓶中，制得200 μg/mL儲(chǔ)備液；精密吸取Hg單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000 μg/mL)、Fe單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000 μg/mL)適量，2%硝酸稀釋分別制得100 ng/mL、160 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

2.3.2 系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液 分別精密吸取上述單元素、多元素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，加2%硝酸分別制成含K、Ca、Na、Mg、Al 0.2 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL，含F(xiàn)e 0.8 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL、8 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL，含Hg 0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL，含其他元素0.5 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、300 ng/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，臨用新制。

2.3.3 混合內(nèi)標(biāo)溶液 精密吸取Ge、In 、Bi標(biāo)準(zhǔn)混合溶液適量，加入2%硝酸制成Ge、In 、Bi混合標(biāo)準(zhǔn)溶液100 ng/mL，臨用新制，Ge、In 、Bi不同內(nèi)標(biāo)矯正代表性ICP-MS線性圖如圖1、圖2、圖3所示。

圖1 內(nèi)標(biāo)Ge校正代表元素Cu、Zn、As線性關(guān)系圖

圖2 內(nèi)標(biāo)In校正代表元素Ru、Rh、Pd線性關(guān)系圖

圖3 內(nèi)標(biāo)Bi矯正代表元素Hg、Tl、Pb線性關(guān)系圖

2.3.4 供試品溶液的制備 精密稱取活血止痛樣品約0.5 g，置于聚四氟乙烯微波消解罐中，加入硝酸8 mL，加蓋，于室溫下預(yù)消解過(guò)夜，置于微波消解儀中按照“2.2”項(xiàng)下方法消解，待消解完全并冷卻至60 ℃以下后取出，緩慢擰開消解罐，將微波消解罐置于趕酸儀中，加熱至紅棕色氣體揮盡，放至室溫，轉(zhuǎn)入50 mL量瓶中，少量水洗滌消化罐5次，合并洗滌液至量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，靜置，另精密吸取0.5 mL上清液，2%硝酸溶液稀釋至10 mL量瓶刻度。若供試品元素濃度不在線性范圍內(nèi)調(diào)整稀釋倍數(shù)進(jìn)樣分析，同法制備試劑空白溶液。

2.4 測(cè)定方法 采用在線內(nèi)標(biāo)法，以蠕動(dòng)泵將樣品與混合內(nèi)標(biāo)溶液混合后，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄響應(yīng)值分別對(duì)系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及供試品溶液、空白溶液分析，以內(nèi)標(biāo)校正的標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算各元素的含量。

2.5 線性關(guān)系考察 取“2.3.2”項(xiàng)下系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，保持內(nèi)標(biāo)管在儀器工作狀態(tài)中始終插入混合內(nèi)標(biāo)溶液，依次將樣品管引入系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中，記錄響應(yīng)值。以各待測(cè)元素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)、各待測(cè)元素與內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值的比值為縱坐標(biāo)(Y)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。各單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液線性關(guān)系見表1。

表1 線性關(guān)系、檢出限和定量限

2.6 檢測(cè)限和定量限考察 在同等試驗(yàn)條件下，重復(fù)測(cè)定2%硝酸溶液11次，以測(cè)定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)的3.3倍除以各元素標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，所得結(jié)果即為各元素的檢測(cè)限，以測(cè)定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)的10倍除以各元素標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，所得結(jié)果即為各元素的定量限。見表1。

2.7 精密度試驗(yàn) 取“2.3.2”項(xiàng)下各混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法平行測(cè)定6次，記錄響應(yīng)值。結(jié)果Hg元素響應(yīng)值RSD為3.5%，其余各元素響應(yīng)值RSD均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一樣品(批號(hào)：200405)6份，按照“2.3.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按照“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，由內(nèi)標(biāo)校正的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中各元素的含量及RSD。由于部分元素(Ru、Rh 、Pd 、Ag、 Sn、 Sb、 Te 、Os、 Ir 、Pt)濃度低于檢測(cè)限，因此元素重復(fù)性以回收率RSD值表示。結(jié)果見表2。

表2 回收率和重復(fù)性考察結(jié)果 (n=6)

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取加樣回收樣品(批號(hào)：200606)，在8 h內(nèi)等時(shí)間間隔連續(xù)測(cè)定10次，以各元素測(cè)定值計(jì)算RSD, Hg元素RSD為5.4%，其余各元素的RSD%均小于3.0%，提示供試品制備后應(yīng)及時(shí)檢測(cè)，減小不穩(wěn)定元素測(cè)定偏差。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 取供試品制備項(xiàng)下一半量已知元素含量活血止痛膠囊(批號(hào)：190605)、片劑(批號(hào)：200405)、軟膠囊(批號(hào)：200606)，精密稱定，各6份，置微波消解罐中，精密加入Fe單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000 μg/mL) 0.4 mL，Hg單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 μg/mL)0.6 mL，K、Ca、Na、Mg、Al混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(20 μg/mL)2 mL，多元素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(10 μg/mL)0.5 mL，按“2.3.4”項(xiàng)下方法處理，定容至50 mL，稀釋后依法測(cè)定記錄響應(yīng)值并計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

2.11 樣品含量測(cè)定 按照擬定方法，測(cè)定活血止痛膠囊47批，活血止痛軟膠囊7批，活血止痛片29批次中30種元素的殘留量。擬定限度參考《中國(guó)藥典》2020版、USP 41-NF 36和ICH Q3D相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。每批次樣品平行雙樣。結(jié)果見表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果 (n=2)

3 討論

3.1 無(wú)機(jī)元素研究基礎(chǔ)概述 據(jù)已有研究[9]報(bào)道，無(wú)機(jī)元素常見分析手段包括紫外-可見分光光度法(UV)、原子熒光光譜法(AFS)[10]、原子吸收光譜法(AAS)[11]、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)[12-13]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)[14]等。與以上分析技術(shù)比較，ICP-MS具有線性范圍寬、靈敏度高、干擾少、多種重金屬元素同時(shí)分析等優(yōu)點(diǎn)，更適合中藥復(fù)方制劑中無(wú)機(jī)元素的檢測(cè)，本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上研究分析該制劑多種重金屬及有害元素，為合理評(píng)價(jià)含礦物藥自然銅中成藥活血止痛制劑質(zhì)量提供參考價(jià)值。

3.2 待測(cè)元素的選擇及樣品預(yù)處理 《中國(guó)藥典》2020年版四部通則“9302 中藥有害殘留物限量制定指導(dǎo)原則”明確指出重金屬及有害元素為Pb、Hg、As、Cd、Cu等；美國(guó)藥典列出15種重金屬控制元素限度，《ICH Q3D元素雜質(zhì)指導(dǎo)原則》對(duì)元素雜質(zhì)分類：將Cd、Pb、As、Hg列為第一類元素，將Co、V、Ni、Tl、Au、Pd、Ir、Os、Rh、Ru、Se、Ag、Pt列為第二類元素，將Li、Sb、Ba、Mo、Cu、Sn、Cr列為第三類元素進(jìn)行限度控制，因此擬定對(duì)以上涵蓋24種重金屬及K、Ca、Na、Mg、Al、Fe等高含量無(wú)機(jī)元素檢測(cè)分析。

與微波消解比較，傳統(tǒng)的干法灰化和濕法消解存在消解不完全、揮發(fā)元素易損失問題，影響結(jié)果的精密度與準(zhǔn)確度。因此實(shí)驗(yàn)中采用高溫高壓密閉微波消解法預(yù)處理樣品，經(jīng)趕酸后得到澄清透明液體，使消解完全。趕酸時(shí)由于As、Hg等揮發(fā)性元素的存在，因此控制趕酸溫度在110 ℃，溫度不宜過(guò)高。另制劑中含有礦物藥自然銅重金屬含量異常高，制備供試品溶液時(shí)選擇適當(dāng)稀釋倍數(shù)稀釋進(jìn)樣以避免儀器的污染。

3.3 元素含量分析 根據(jù)《中國(guó)藥典》2020年版對(duì)活血止痛膠囊Pb、Hg、As的限度規(guī)定，明確其中Pb≤60 mg/kg、Hg≤12 mg/kg、As≤300 mg/kg。47批膠囊劑Pb、Hg、As均符合藥典限度；照《中國(guó)藥典》2020年版該膠囊劑重金屬限度要求，軟膠囊Pb、Hg、As符合以上限度；而29批次片劑中6批次Pb超出以上限度，Hg、As含量符合藥典限度。

現(xiàn)行國(guó)家藥典標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)元素Cd、Cu等未規(guī)定其含量限度，制劑中Cd元素含量較低，最高濃度小于4 μg/g，但其中Cu元素普遍含量較高，其中39批次膠囊劑、6批次片劑其Cu元素均高于美國(guó)藥典口服濃度限度100 μg/g；砷(As)、鈷(Co)、釩(V)、鎳(Ni)、鉈(Tl)、鋇(Ba)、鉬(Mo)等元素一定程度超出《ICH Q3D元素雜質(zhì)指導(dǎo)原則》元素限度。以上中藥有害殘留物限量指導(dǎo)原則控制的Pb、Hg、As、Cd、Cu 有害元素中，發(fā)現(xiàn)活血止痛片劑存在重金屬Pb超出膠囊劑藥典限度標(biāo)準(zhǔn)及部分制劑Cu元素遠(yuǎn)高于國(guó)際相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)象，提示該制劑中存在重金屬超限及用藥風(fēng)險(xiǎn)隱患。

除Pb、Hg、As、Cd、Cu有害重金屬外，制劑中其他人體所需元素Fe、K、Mg、Ca等含量顯著高于其他無(wú)機(jī)元素, 已明確其在參與骨骼代謝、治療跌打損傷中發(fā)揮著顯著作用[15-16]。其中Fe元素主要來(lái)源于煅自然銅，是合成血紅蛋白、肌紅蛋白、鐵蛋白的必需原料，Cu元素以金屬酶形式存在于酶活性部位，提高賴氨酰氧化酶活性，Mg在提高堿性磷酸酶(ALP)活性促進(jìn)骨細(xì)胞增殖發(fā)揮著重要作用[17-19]，共同為活血止痛制劑發(fā)揮活血散瘀功效提供療效基礎(chǔ)。

以上研究表明，活血止痛制劑中存在活血止痛片重金屬含量限度標(biāo)準(zhǔn)缺失，同時(shí)片劑中重金屬Pb含量高于藥典膠囊劑擬定限度，部分重金屬超出國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)象。而中藥制劑組成復(fù)雜，不能單一參考國(guó)外標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)制劑質(zhì)量，如Cu元素既是骨骼生長(zhǎng)必需元素同時(shí)又存在重金屬蓄積的風(fēng)險(xiǎn)，ICH Q3D或美國(guó)藥典元素限度并不適合中藥制劑，因此建立中藥材與中藥制劑元素范圍較廣的元素限量標(biāo)準(zhǔn)具有十分重要的研究意義。

本研究采用微波消解ICP-MS法建立同時(shí)測(cè)定活血止痛制劑中30種元素方法，同時(shí)對(duì)比《中國(guó)藥典》2020年版，USP 41-NF 36和《ICH Q3D元素雜質(zhì)指導(dǎo)原則》國(guó)際相關(guān)限度標(biāo)準(zhǔn)，為活血止痛質(zhì)量研究，對(duì)擬定合理元素限度保證此類中藥口服制劑安全性、有效性提供數(shù)據(jù)支撐及技術(shù)參考價(jià)值。