Bond Elut PBA固相萃取柱凈化-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定雞肉中金剛烷胺和利巴韋林的殘留量

王 飛,俞子萱,李淑靜

(天津海關(guān)動植物與食品檢測中心，天津 300461)

金剛烷胺是最早用于抑制流感病毒的抗病毒藥物，但其治療劑量與產(chǎn)生副作用的劑量很接近。利巴韋林是核苷酸類藥物，具有較強的致畸效應(yīng)，會引起胚胎損害。在農(nóng)業(yè)部第560號公告[1]《獸藥地方標(biāo)準(zhǔn)廢止目錄》中，金剛烷胺、利巴韋林被明確列為禁止生產(chǎn)、銷售和使用的獸藥。為防止含有上述兩種藥物的動物源性食品對人體健康產(chǎn)生危害，有必要對市場中動物源性食品中的金剛烷胺和利巴韋林進(jìn)行檢測。禽肉中利巴韋林和金剛烷胺均是必須檢測的項目，但這兩種化合物極性差異較大，已有的檢測方法[2-3]和標(biāo)準(zhǔn)[4-5]多是采用單獨檢測的方式。文獻(xiàn)[6-7]采用Waters BEH HILIC 色譜柱同時分離利巴韋林和金剛烷胺，但利巴韋林和金剛烷胺均在1.5 min左右出峰，相較于采用C18色譜柱的傳統(tǒng)方法，其保留效果極弱。文獻(xiàn)[8]采用HILIC Silica色譜柱同時分離利巴韋林和金剛烷胺，利巴韋林和金剛烷胺均在4 min后出峰，二者雖然可以達(dá)到完全分離，但是色譜峰峰形存在較大差異，利巴韋林的峰形不太理想。鑒于此，本工作采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測雞肉中的利巴韋林和金剛烷胺，在保證金剛烷胺回收率穩(wěn)定的前提下兼顧了利巴韋林極性較強的特性，并解決了雞肉中目標(biāo)物提取以及雜質(zhì)凈化問題。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

SHIMADZU 30A 型高效液相色譜儀;AB SCIEX QTRAP 6500型串聯(lián)質(zhì)譜儀;Mettler AL104型電子天平;Mili-Q 型凈化水系統(tǒng)。Bond Elut PBA固相萃取柱(PBA 小柱，規(guī)格100 mg/3 mL);Sep-Pak C8固相萃取柱(C8小柱，規(guī)格500 mg/6 mL)。TSK gel Amide-80 色譜柱(150 mm×2.0 mm，5.0μm);Poroshell 120 SB-C18色譜柱(150 mm×2.1 mm，2.7 μm);Eclipse XDB-C8色譜柱(150 mm×4.6 mm，5.0μm)。

單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:100 mg·L－1，取適量利巴韋林、金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解和定容，搖勻備用。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液:1 mg·L－1，取適量利巴韋林、金剛烷胺單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用甲醇定容，搖勻備用。

單內(nèi)標(biāo)儲備溶液:100 mg·L－1，取適量利巴韋林-13C5、金剛烷胺-d6標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解和定容，搖勻備用。

混合內(nèi)標(biāo)溶液:1 mg·L－1，取適量利巴韋林-13C5、金剛烷胺-d6單內(nèi)標(biāo)儲備溶液，用甲醇定容，搖勻備用。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:取適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間液和混合內(nèi)標(biāo)溶液，用甲醇逐級稀釋，配制成2，4，10，20，40μg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，其中內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為10μg·L－1。

利巴韋林、金剛烷胺、利巴韋林-13C5、金剛烷胺-d6標(biāo)準(zhǔn)品純度均大于98%;甲醇、甲酸、乙腈、三氯乙酸等均為色譜純;除另有說明，其他所用試劑均為分析純;試驗用水為純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Eclipse XDB-C8色譜柱(150 mm×4.6 mm，5.0μm);柱溫25 ℃;流動相A 為含5 mmol·L－1乙酸銨的1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲酸溶液，B 為甲醇，C為水;流量300μL·min－1;進(jìn)樣量10μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，正離子(ESI＋)模式;毛細(xì)管電壓5.5 k V;離子源溫度450 ℃;多反應(yīng)監(jiān)測模式。其他質(zhì)譜參數(shù)見表2，其中“*”代表定量離子。

表2 質(zhì)譜參數(shù)Tab.2 MS parameters

1.3 試驗方法

取市場購買的雞肉樣品約2.0 g(精確到0.1 g)于50 mL離心管中，加入100μg·L－1混合內(nèi)標(biāo)溶液100μL和體積比7∶3的20 g·L－1三氯乙酸溶液-乙腈的混合溶液(提取劑)15 mL，置于渦旋振蕩器上，渦旋30 s，然后置于搖床上，以300 r·min－1轉(zhuǎn)速振蕩15 min，以10 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心5 min，上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，在下層沉淀中加入提取劑15 mL，重復(fù)上述操作一次。合并上層有機(jī)相，過普通濾紙，用約100μL 氨水調(diào)節(jié)濾液pH 至8.5，待凈化。

將PBA 小柱依次用乙腈3 mL、體積比1∶3的1%甲酸溶液-乙腈的混合溶液3 mL 和0.25 mol·L－1乙酸銨溶液(pH 8.5左右)3 mL 充分活化，將待凈化的濾液全部轉(zhuǎn)移至PBA 小柱中，依次以體積比9∶1的0.25 mol·L－1乙酸銨溶液-乙腈的混合溶液3 mL 和含5%(體積分?jǐn)?shù))氨水的甲醇溶液3 mL淋洗，以含2%(體積分?jǐn)?shù))甲酸的甲醇溶液4 mL洗脫。收集洗脫液，氮吹至干，加入體積比1∶9的乙腈-水的混合溶液1 mL，渦旋復(fù)溶后過0.22μm 濾膜，濾液供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器工作條件的選擇

2.1.1 質(zhì)譜條件

較高的離子源溫度能夠得到更好的離子化效率，但在檢測利巴韋林和金剛烷胺時，當(dāng)離子源溫度為550 ℃時，金剛烷胺和利巴韋林的離子化效率要比450℃時的低，且峰形受到嚴(yán)重影響。因此，試驗選擇的離子源溫度為450 ℃。

2.1.2 色譜條件

利巴韋林屬于強極性化合物，金剛烷胺屬于中等極性化合物，選取合適的色譜柱、流動相及梯度洗脫程序是使這兩種化合物獲得良好分離的關(guān)鍵。

試驗比較了親水性TSK gel Amide-80色譜柱、中等極性Eclipse XDB-C8色譜柱和弱極性Poroshell 120 SB-C18色譜柱對100μg·L－1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中兩種目標(biāo)物分離效果。結(jié)果顯示，利巴韋林在Poroshell 120 SB-C18色譜柱上的保留極弱，在2.0 min左右出峰，即使改變流動相的種類及梯度，也對其保留情況改善不大。TSK gel Amide-80色譜柱是鍵合酰胺基團(tuán)的親水性色譜柱，使用時不能長時間處于高有機(jī)相環(huán)境中，在此要求下，改變流動相的種類及梯度，利巴韋林、金剛烷胺的保留均很弱，均在2.0 min之前出峰;此外兩種目標(biāo)物在色譜柱上的殘留現(xiàn)象比較嚴(yán)重，在柱子使用20次后，兩種目標(biāo)物的色譜峰峰形變差、響應(yīng)強度降低[圖1(a)和圖1(b)]。利巴韋林和金剛烷胺在Eclipse XDB-C8色譜柱上有更強的保留，分別在4.30，9.13 min出峰;和有機(jī)相采用乙腈時的色譜分離效果[圖1(c)]相比，有機(jī)相采用甲醇[圖1(d)]時兩種目標(biāo)物的響應(yīng)強度更高、峰形更好。因此，試驗采用Eclipse XDB-C8色譜柱作固定相，采用甲醇作有機(jī)相來同時分離利巴韋林和金剛烷胺。

圖1 不同色譜柱和不同有機(jī)相分離時混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms of the mixed standard solution separated with different columns and different organic phases

2.2 樣品前處理條件的選擇

2.2.1 提取劑及用量

考慮到利巴韋林極性很強以及禽肉基體復(fù)雜、油脂含量高等特點，試驗考察了分別以體積比3∶7、1∶1、7∶3的10 g·L－1三氯乙酸溶液-乙腈的混合溶液(1，2，3組)、20 g·L－1三氯乙酸溶液-乙腈的混合溶液(4，5，6組)、10 g·L－1甲酸溶液-乙腈的混合溶液(7，8，9組)、10 g·L－1甲酸溶液-甲醇的混合溶液(10，11，12組)和10 g·L－1三氯乙酸溶液-甲醇的混合溶液(13，14，15組)作提取劑時對空白加標(biāo)雞肉樣品(加標(biāo)量10.0μg·kg－1)中利巴韋林、金剛烷胺峰面積的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，與含有甲酸的提取劑相比，含有三氯乙酸的提取劑所得的兩種目標(biāo)物峰面積普遍偏高，推測與三氯乙酸沉淀蛋白效果更好有關(guān)。當(dāng)三氯乙酸的質(zhì)量濃度為10 g·L－1時，提取液呈現(xiàn)渾濁狀態(tài)，無法用濾紙過濾;當(dāng)三氯乙酸的質(zhì)量濃度為20 g·L－1時，提取液變澄清、分層明顯，上清液過濾效果較好。與含有甲醇的提取劑相比，含有乙腈的提取劑所得的兩種目標(biāo)物峰面積普遍偏高;當(dāng)采用20 g·L－1三氯乙酸溶液-乙腈的混合溶液作提取劑，且二者體積比為7∶3時兩種目標(biāo)物的峰面積較高。因此，試驗選擇的提取劑為體積比7∶3 的20 g·L－1三氯乙酸溶液-乙腈的混合溶液。

圖2 提取劑對利巴韋林和金剛烷胺峰面積的影響Fig.2 Effect of extraction solvent on the peak area of ribavirin and amantadine

進(jìn)一步考察了提取劑用量分別為5，10，15，20，50 mL時對空白加標(biāo)雞肉樣品(加標(biāo)量10.0μg·kg－1)中利巴韋林、金剛烷胺峰面積的影響。結(jié)果顯示:提取劑用量小于15 mL 時，提取液分層不明顯，回收率低于50.0%;以15 mL提取劑提取時，提取液分層明顯，回收率均大于70.0%;提取劑用量繼續(xù)增加，回收率變化不大。因此，試驗選擇的提取劑用量為15 mL。

2.2.2 凈化方法

試驗比較了正己烷脫脂法、固相萃取法的凈化效果。試驗結(jié)果顯示，正己烷脫脂法僅適用于目標(biāo)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于2.0μg·kg－1樣品的凈化;若樣品中目標(biāo)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)降低，將不能實現(xiàn)金剛烷胺的有效提取。固相萃取柱分別選用了中等極性的C8小柱和硅膠型的PBA 小柱，其中C8小柱依次以乙腈5 mL、體積比7∶3的10 g·L－1三氯乙酸溶液-乙腈的混合溶液5 mL 活化，將待凈化的溶液全部過柱后，以體積比7∶3的10 g·L－1三氯乙酸溶液-乙腈的混合溶液5 mL淋洗，以乙腈5 mL洗脫，后續(xù)處理步驟同1.3節(jié)。結(jié)果顯示:以C8小柱凈化時，金剛烷胺的凈化效果較好，而利巴韋林在C8小柱上保留很弱，未在儀器上得到相應(yīng)的響應(yīng)信號;以PBA 小柱凈化時，金剛烷胺和利巴韋林的回收率分別為72.0%和90.0%，凈化效果較好，這是由于PBA 小柱鍵合苯硼酸官能團(tuán)，能夠通過可逆的共價鍵保留目標(biāo)物，專屬性更強。因此，試驗選擇以PBA 小柱凈化提取液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按照儀器工作條件測定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，以各目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，其對應(yīng)的色譜峰峰面積與內(nèi)標(biāo)物色譜峰峰面積的比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，利巴韋林和金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)曲線均在2～40μg·L－1內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程分別 為y＝0.091 77x＋0.002 917 和y＝0.142 5x＋0.011 50，相關(guān)系數(shù)分別為0.999 9 和0.991 4。

以3倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N)，所得結(jié)果分別為0.3μg·kg－1和0.2μg·kg－1。

2.4 精密度和回收試驗

取空白雞肉樣品18 份，進(jìn)行3 個濃度水平(1.0，2.0，5.0μg·kg－1)的加標(biāo)回收試驗，每個濃度水平進(jìn)行6次平行測定，計算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，所得結(jié)果見表3。

表3 精密度和回收試驗結(jié)果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表3可知，金剛烷胺和利巴韋林回收率分別為70.5%～84.4%和98.5%～99.6%，測定值的RSD 均小于5.0%。

本工作以體積比7∶3的20 g·L－1三氯乙酸溶液-乙腈的混合溶液作提取劑，以PBA 小柱凈化，以高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定雞肉中利巴韋林和金剛烷胺的含量。方法檢測快速、專屬性強、靈敏度高，精密度和準(zhǔn)確度好，可為動物源性食品中這兩種化合物的快速、精確測定提供技術(shù)支持。