群結(jié)腐霉細(xì)胞壁降解酶的活性檢測及基因表達(dá)分析

陳一帆，薛太強(qiáng)，陳思橋，張金鳳，周冬梅，魏利輝

(1.江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，江蘇南京 210014)

生姜(ZingiberofficinaleRosc.)是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]。中國是世界上生姜栽培面積最大且生產(chǎn)總量最多的國家之一，也是全球生姜出口大國。由群結(jié)腐霉(Pythiummyriotylum)侵染引起的生姜莖基腐病，是生姜主要病害之一[2]，對生姜產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。該病害在生姜上的癥狀出現(xiàn)在地下根莖部位，表現(xiàn)為水漬狀褐色病變，導(dǎo)致塊莖腐爛、葉片變黃，最終使生姜萎蔫和壞死[5]。群結(jié)腐霉在世界各地都有分布，寄主范圍廣泛，除了生姜外還可以侵染花生等多種作物[6]。

植物病原菌按營養(yǎng)攝取方式可分為3種類型：活體營養(yǎng)型、死體營養(yǎng)型和半活體營養(yǎng)型[7]。活體營養(yǎng)型病原菌在其整個生命周期內(nèi)從活的寄主細(xì)胞內(nèi)攝取營養(yǎng)；死體營養(yǎng)型病原菌從死亡(或垂死)的寄主細(xì)胞中攝取營養(yǎng)；半活體營養(yǎng)型病原菌最初從活體寄主細(xì)胞攝取營養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)變?yōu)閺乃劳龅募闹骷?xì)胞中攝取營養(yǎng)。對3種類型病原菌分泌的植物細(xì)胞壁降解酶(plant cell wall-degrading enzymes，PCWDEs)數(shù)量進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，死體營養(yǎng)型病原菌中的PCWDEs數(shù)量最多；其次，半活體營養(yǎng)型病原菌，最少的是活體營養(yǎng)型病原菌[7]。PCWDEs主要包含3種碳水化合物活性酶(CAZymes)，分別是糖苷水解酶(GH)、碳水化合物酯酶(CE)和多糖裂解酶(PL)[8]。植物細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素、果膠和結(jié)構(gòu)蛋白組成[9]，是阻止病原菌入侵的主要物理屏障[10-12]。病原菌分泌的大量PCWDEs(如：纖維素酶，果膠酶，蛋白酶和木聚糖酶)可降解不同細(xì)胞壁組分，促進(jìn)其侵染[13]。

纖維素和淀粉是生姜根莖中最主要的2種多糖[14]，其中，纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分。病原菌產(chǎn)生的纖維素酶在其侵染植物和定殖的過程中起到重要作用[15]。纖維素酶如β-1，4-葡聚糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶可降解纖維素生成葡萄糖，協(xié)同降解寄主細(xì)胞壁[16]。淀粉是植物中最重要的多糖之一，生姜根狀莖中的淀粉含量約11.4%。不同種類的生姜淀粉中的直鏈淀粉所占的比例不同(約占18%～30%)，與馬鈴薯淀粉相似[17]。淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直鏈淀粉、糖元等[18]，分解直鏈淀粉后的最終產(chǎn)物以麥芽糖為主，同時還有麥芽三糖及少量葡萄糖。

群結(jié)腐霉屬于死體營養(yǎng)型病原菌，基因組中含有大量PCWDEs編碼基因[19-20]，然而目前對這些PCWDEs的功能和特性知之甚少。本研究以群結(jié)腐霉在生姜粉末和葡萄糖培養(yǎng)基上生長的菌絲和環(huán)板中的培養(yǎng)液為材料，利用PCWDEs基因功能注釋、轉(zhuǎn)錄組測序分析和酶活檢測等方法，研究群結(jié)腐霉PCWDEs基因表達(dá)情況和酶活特征，從而深入探究群結(jié)腐霉侵染生姜的致病機(jī)制，為該病害的防控提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 本試驗于2021年3月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中進(jìn)行，供試菌株群結(jié)腐霉SWQ7[21]從山東生姜病樣中分離得到，保藏于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所蔬菜病害防控實驗室。

1.1.2 培養(yǎng)基的配制 V8培養(yǎng)基[21]：V8蔬菜汁340 mL，CaCO33.4 g，5 000 r/min離心10 min后棄沉淀，按1 ∶9的體積比加入蒸餾水，瓊脂1.5%，121 ℃ 滅菌20 min。

Plich液體培養(yǎng)基[22]：KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，(NH4)2SO45 g，L-天冬酰胺 1 g，β-谷甾醇 0.01 g，使用NaOH調(diào)pH值至6.0，1 000 mL 超純水，121 ℃滅菌15 min，加入硫胺素0.001 g。

1.1.3 主要試劑 葡萄糖，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；生姜粉末，山東省萬興食品有限公司；V8蔬菜汁，美國金寶湯公司；0.1 μm孔徑的聚碳酸酯膜，美國GVS過濾技術(shù)公司；對硝基苯酚，上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷，上海麥克林生化科技有限公司；對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷，上海麥克林生化科技有限公司；對硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷，上海麥克林生化科技有限公司；TruSeq Stranded mRNA試劑盒，因美納科學(xué)器材有限公司。

1.1.4 主要儀器 單人雙面垂直凈化工作臺，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；pH計，上海奧豪斯儀器有限公司；電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海善治儀器設(shè)備有限公司；生物分析儀，安捷倫科技有限公司；酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物細(xì)胞壁降解酶類注釋 使用生物學(xué)軟件dbCAN2(http：//bcb.unl.edu/dbCAN2/)分析蛋白質(zhì)是否有CAZy結(jié)構(gòu)域，預(yù)測碳水化合物活性酶的基因。利用CAZy網(wǎng)站(http：//www.cazy.org/)[23]，根據(jù)CAZy家族或亞家族分類推測含CAZy結(jié)構(gòu)域蛋白的對應(yīng)活性。PCWDEs指推測活性作用于植物細(xì)胞壁多糖組分或植物貯藏多糖的蛋白質(zhì)，根據(jù)推測的活性列出底物。

1.2.2 環(huán)板試驗 將群結(jié)腐霉SWQ7轉(zhuǎn)接到含100 μg/mL氨芐青霉素的過濾V8培養(yǎng)基平板上，黑暗條件下于25 ℃培養(yǎng)箱中生長2 d。

本研究中使用一種稱為環(huán)板的新型培養(yǎng)技術(shù)[24]。在環(huán)板的6個環(huán)形通道中加入含有 100 μg/mL 氨芐青霉素和適當(dāng)碳源的Plich液體培養(yǎng)基，將聚碳酸酯膜覆蓋在環(huán)板培養(yǎng)皿上，菌株轉(zhuǎn)接在聚碳酸酯膜上生長，分別使用葡萄糖和生姜粉末作為碳源，制備濃度為1 mol/L葡萄糖原液并使用過濾滅菌，生姜粉末加入Plich培養(yǎng)基后高壓滅菌。環(huán)板培養(yǎng)液中的葡萄糖最終濃度為25 mmol/L，生姜粉末的最終濃度為1%。將高溫滅菌的聚碳酸酯膜覆蓋在環(huán)板上，在環(huán)板中心接種直徑為0.5 cm帶有新鮮菌絲的V8瓊脂塊。25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗生長72 h后，分別收集環(huán)板中聚碳酸酯膜上的菌絲(用于轉(zhuǎn)錄組分析)和下方環(huán)形通道中培養(yǎng)液(用于酶活檢測)，樣品收集后立即放于液氮中速凍保藏。

1.2.3 RNA提取、RNA-seq文庫制備、測序和數(shù)據(jù)分析 RNA的提取與純化、RNA-seq文庫制備及轉(zhuǎn)錄組測序由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。使用Trizol試劑提取樣品中的RNA，在RNA樣品中加入DNA酶去除殘留的DNA。RNA的完整性采用生物分析儀來進(jìn)行驗證，使用分光光度計測量RNA純度。通過TruSeq Stranded mRNA試劑盒制備2×150 bp的配對文庫，并在Illumina HiSeq X平臺上進(jìn)行測序。

對原始數(shù)據(jù)利用Trimmomatic軟件去除接頭序列和低質(zhì)量序列，獲得高質(zhì)量有效序列[25]。對處理后的序列采用UseGalaxy.eu中的軟件工具進(jìn)行下游分析[26]，采用HISAT2 Galaxy將序列映射至SWQ7基因組進(jìn)行組裝[27](https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/108473？genome_assembly_id=1746011)。使用HTSeq-count Galaxy統(tǒng)計所有比對質(zhì)量 ≥ 10序列，采用聯(lián)合模式處理重疊多個特征的序列，在它們映射至所有特征上計算非唯一映射序列[28]。利用DESeq2 Galaxy對計數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，其中，默認(rèn)Cook距離截止值用于異常值過濾[29]。差異表達(dá)基因的判定標(biāo)準(zhǔn)為在FPKM(Fragment per kilo bases per million reads)>10的情況下，DESeqPadj<0.05，DESeq log2FC>1或<-1。FPKM值通過表達(dá)每Kb基因長度的基因計數(shù)和每百萬映射到所有基因的計數(shù)計算。

1.2.4 酶活測定 使用連接有對硝基苯酚(pNP)的底物進(jìn)行酶活測定，在96孔板中加入總體積為100 μL標(biāo)準(zhǔn)測定緩沖液，其中含有Tris-HCl 20 mmol/L (pH值7.5)，連有對硝基苯酚的底物2.5 mmol/L，環(huán)板培養(yǎng)液或超純水20 μL。分別配制不同濃度的對硝基苯酚溶液(0、5、10、25、50、80、100、250 nmol/mL)，測定對硝基苯酚溶液在405 nm波長處的數(shù)值，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)、測定數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

在37 ℃反應(yīng)3～8 h后，加入100 μL濃度為0.25 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，并使用酶標(biāo)儀在405 nm波長處檢測對硝基苯酚底物的水解量。酶活單位定義為1 μL培養(yǎng)基溶液1 h產(chǎn)生對硝基苯酚(pNP)的nmol量。本試驗使用對硝基苯酚連接的底物檢測酶活：使用對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷檢測α-葡萄糖苷酶活性；使用對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷檢測β-葡萄糖苷酶活性；使用對硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷檢測β-木糖苷酶活性。連接對硝基苯酚的底物在雙蒸水中制備為50 mmol/L原液。試驗中設(shè)置2個技術(shù)重復(fù)，4個生物學(xué)重復(fù)，結(jié)果使用Student’s T-test檢驗進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 群結(jié)腐霉植物細(xì)胞壁降解酶的分析鑒定

通過生物學(xué)軟件dbCAN2和CAZy網(wǎng)站預(yù)測分析，由圖1和表1可知，得到群結(jié)腐霉中PCWDEs編碼基因共273個，其中，纖維素降解酶有92個、木聚糖降解酶16個、果膠降解酶76個和淀粉降解酶7個。通過與其他已報道的腐霉菌株相比，群結(jié)腐霉中PCWDEs數(shù)量顯著高于其他腐霉[30-35]；除了貴陽腐霉和寡雄腐霉外，群結(jié)腐霉中纖維素降解酶、木聚糖降解酶、果膠降解酶和淀粉酶的數(shù)量是其他腐霉菌的2～3倍；值得注意，群結(jié)腐霉含有除瓜果腐霉和強(qiáng)雄腐霉以外，還含有其他腐霉菌不具有的木聚糖降解酶。

表1 群結(jié)腐霉和其他腐霉菌株中降解特定植物組分的PCWDEs數(shù)量

2.2 菌絲在環(huán)板上的生長情況

為了解群結(jié)腐霉PCWDEs在侵染生姜過程中的基因表達(dá)特征和酶活特性，本試驗使用生姜粉末模擬生姜環(huán)境，試驗對照選擇最常作為簡單碳源的葡萄糖為對照。由圖2可知，生長72 h后觀察群結(jié)腐霉菌絲生長情況，發(fā)現(xiàn)群結(jié)腐霉在生姜粉末和葡萄糖培養(yǎng)基上能夠正常生長，但不能穿透聚碳酸酯膜生長至下方培養(yǎng)液中，但生姜粉末培養(yǎng)基中菌絲比葡萄糖培養(yǎng)基中生長得更加致密茂盛。

2.3 轉(zhuǎn)錄組結(jié)果分析

由轉(zhuǎn)錄組結(jié)果(表2)可知，以生姜粉末FPKM值>10，P<0.05，log2FC>1或<-1作為差異表達(dá)基因的判定標(biāo)準(zhǔn)發(fā)現(xiàn)，與葡萄糖培養(yǎng)基相比，群結(jié)腐霉在生姜粉末培養(yǎng)基上生長時有12個PCWDEs基因表達(dá)上調(diào)，這些基因編碼的PCWDEs中的主要底物為淀粉和纖維素。其中，上調(diào)最高的2個基因為Pm_g10935.t1和Pm_g3514.t1，在CAZy家族中屬于糖苷水解酶GH13_32，具有α-淀粉酶活性，其底物為淀粉。

2.4 酶活分析

由于群結(jié)腐霉可產(chǎn)生降解淀粉和纖維素的α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶以及大量的木聚糖酶，因此，本研究檢測了環(huán)板培養(yǎng)基中3種酶活性。由圖3可知，群結(jié)腐霉在不同培養(yǎng)基上生長時3種酶活均存在顯著差異，在生姜粉末培養(yǎng)液中α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和β-木糖苷酶活性顯著高于葡萄糖培養(yǎng)液對照。α-葡萄糖苷酶酶活為0.035 nmol/(h·μL)，較對照高0.030 nmol/(h·μL)；β-葡萄糖苷酶的酶活為0.115 nmol/(h·μL)，較對照高0.080 nmol/(h·μL)；β-木糖苷酶活性為0.025 nmol/(h·μL)，較對照高0.019 nmol/(h·μL)。

表2 群結(jié)腐霉在生姜粉末培養(yǎng)基與葡萄糖培養(yǎng)基相比上調(diào)表達(dá)的PCWDEs基因

3 討論

本研究通過生物學(xué)軟件dbCAN2和CAZy網(wǎng)站對群結(jié)腐霉PCWDEs基因進(jìn)行分析和功能注釋，預(yù)測了PCWDEs基因編碼的酶和對應(yīng)的底物。將群結(jié)腐霉中的PCWDEs基因與其他腐霉菌株對比發(fā)現(xiàn)，群結(jié)腐霉中以各種植物組分為底物的降解酶數(shù)量均遠(yuǎn)大于其他腐霉菌株。不同植物的細(xì)胞壁組成存在一定差異，但主要由纖維素、半纖維素、果膠和結(jié)構(gòu)蛋白等多種成分構(gòu)成，群結(jié)腐霉PCWDEs對應(yīng)多種底物，可協(xié)調(diào)降解細(xì)胞壁[36]，這可能與群結(jié)腐霉能侵染多種寄主有關(guān)。

轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示，群結(jié)腐霉在生姜培養(yǎng)基中培養(yǎng)，上調(diào)的PCWDEs基因有12個，其中，淀粉降解酶的數(shù)量最多，其次是纖維素降解酶，這可能與生姜和腐霉細(xì)胞壁組成相關(guān)。袁甜甜等使用酸水解法測定在去除水分加工后的生姜中淀粉含量為87.8%[37]，Chen等用蒽酮試劑測定出生姜組織樣本粉末中纖維素占生姜根莖中纖維的70%，因此群結(jié)腐霉需要分泌大量的淀粉降解酶來破壞生姜組織[38]。此外，腐霉細(xì)胞壁的主要成分是2種類型的纖維素微纖維[39]，推測纖維素降解酶數(shù)量比淀粉降解酶少的主要原因可能是過高水平的纖維素酶會降解腐霉的細(xì)胞壁導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

利用連有對硝基苯酚底物的酶促反應(yīng)檢測群結(jié)腐霉中的酶活特征，發(fā)現(xiàn)生姜粉末培養(yǎng)基的α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和β-木糖苷酶活性均比葡萄糖培養(yǎng)基中的酶活性高。這與轉(zhuǎn)錄組分析中發(fā)現(xiàn)的生姜粉末培養(yǎng)基中纖維素、淀粉和木聚糖為底物基因表達(dá)上調(diào)的結(jié)果一致。Geethu等檢測果膠酶、木聚糖酶和纖維素酶的活性時，發(fā)現(xiàn)它們的活性都隨著群結(jié)腐霉的生長而增加[15]。本研究中也檢測了類似活性，但Geethu等在試驗中使用百分?jǐn)?shù)作為各項酶活之間的對比，2個試驗間的數(shù)據(jù)難以進(jìn)行比較。然而，群結(jié)腐霉在葡萄糖環(huán)板上生長時檢測到了所有酶活，這與Geethu等之前檢測時在蔗糖為底物時檢測到纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶和蛋白酶的結(jié)果[15]相似。

使用環(huán)板對群結(jié)腐霉的PCWDEs基因進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)具有一定的局限性，環(huán)板試驗中使用的碳源經(jīng)過高溫滅菌，而在自然條件下植物宿主中的其他因素可誘導(dǎo)群結(jié)腐霉產(chǎn)生PCWDEs[40]，在侵染過程中發(fā)揮不同的作用，因此后續(xù)仍需進(jìn)一步優(yōu)化試驗條件。

本研究通過PCWDEs基因功能注釋、轉(zhuǎn)錄組測序分析和酶活檢測分析，表明淀粉和纖維素對群結(jié)腐霉中PCWDEs基因表達(dá)有重要作用，其功能分析需要進(jìn)一步驗證。本研究為后續(xù)解析群結(jié)腐霉致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為群結(jié)腐霉引起的生姜莖基腐病的防治提供了理論依據(jù)。