外源亞精胺對(duì)草莓NaCl脅迫的緩解效應(yīng)

馬媛媛，孫軍利，趙寶龍，魯倩君，陳麗靚，劉 迎

(特色果蔬栽培生理與種質(zhì)資源利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆石河子 832003)

草莓(Fragaria×ananassaDuch.)，薔薇科草莓屬，多年生溫帶常綠草本植物，原產(chǎn)地南美洲，在中國各地以及全球均有廣泛的種植，具有株體小、易種植、成熟早、周期短和收益高等特點(diǎn)，是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一[1]。我國是鹽漬土分布廣泛的國家之一，從沿海到內(nèi)陸、熱帶到寒帶以及濕潤地區(qū)到沙漠地區(qū)均有大量鹽漬土的分布，面積達(dá)到 9 913萬hm2，占全國可利用土地面積的4.88%，成為制約我國農(nóng)產(chǎn)品增產(chǎn)的主要原因之一[2]。我國在不斷克服鹽堿地對(duì)作物造成的損害，所以利用外源物質(zhì)提高植物耐鹽性成為近幾年的研究熱點(diǎn)。

多胺(polyamines，簡稱PAs)是廣泛存在于植物體內(nèi)的一類低分子含氮堿，是一種重要的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，主要包括腐胺(putrescine，簡稱Put)、亞精胺(spermidine，簡稱Spd)、精胺(spermine，簡稱Spm)，其中Spd與植物抗逆性的關(guān)系最密切[3]。Spd又稱三鹽酸亞精胺，是植物體內(nèi)的重要代謝物，并且由于其多價(jià)陽離子的特性，導(dǎo)致生理功能更強(qiáng)，在植物受到環(huán)境脅迫時(shí)可以直接作為保護(hù)物質(zhì)，還可以在脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中作為信號(hào)分子，有助于促進(jìn)脅迫抗性機(jī)制的構(gòu)建[4-5]，還能夠保護(hù)非生物脅迫條件下植物光合器官功能的完整性，來維持較高的光合效率[6]。前人研究已證明Spd能夠緩解逆境脅迫對(duì)植物的影響，已在低溫[7]、水淹[8]、干旱[9]和鹽脅迫[10]等多種非生物脅迫中被證實(shí)。海霞等對(duì)鹽脅迫下的燕麥外源施加0.75 mmol/L Spd，發(fā)現(xiàn)可通過提高燕麥幼苗的滲透調(diào)節(jié)和抗氧化能力，維持生物膜系統(tǒng)的穩(wěn)定，有效減輕離子毒害對(duì)植株的傷害，以達(dá)到提高燕麥耐鹽性，促進(jìn)幼苗生長的目的[11]。楊妮等對(duì)NaCl脅迫下茶樹外源施加不同濃度Spd，發(fā)現(xiàn)可有效緩解葉綠素降解，促進(jìn)植株光合作用，提高茶樹耐鹽性，促進(jìn)植株生長，0.5 mmol/L 濃度Spd處理效果最佳[12]。此外，Spd還在甜高粱[13]、豇豆[14]、核桃[15]、菠菜[16]等多種植物中施用，表明可以緩解多種植物的鹽脅迫。

本試驗(yàn)以甜查理草莓品種為材料，對(duì)NaCl脅迫下的草莓外源施加不同濃度的Spd，研究其光合色素含量、光合特性、葉綠素?zé)晒夂涂寡趸富钚?，明確Spd對(duì)草莓幼苗NaCl脅迫的緩解機(jī)制，為提高草莓耐鹽性提供理論依據(jù)和新的技術(shù)途徑，對(duì)我國鹽漬化土地較重區(qū)域的草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)草莓品種為甜查理，選取6～8張葉、長勢(shì)均勻健壯的植株，移栽定植到裝有20 L營養(yǎng)液的水培盒80 cm×50 cm×30 cm中，每盒放入15株，共10盒。使用霍格蘭營養(yǎng)液(電導(dǎo)率為1.2 mS/cm)，每5 d更換1次，24 h通氣。所有試驗(yàn)材料生長到 7～8張葉后進(jìn)行處理。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2021年5—6月在石河子大學(xué)試驗(yàn)站溫室進(jìn)行。在同一天對(duì)草莓植株進(jìn)行處理(表1)，葉片正面和反面噴施均勻(記作0 d)，以藥液附于葉面但不下滴為標(biāo)準(zhǔn)，噴施等量蒸餾水為對(duì)照。處理后3、6、9 d取樣測(cè)定光合色素含量、光合特性、葉綠素?zé)晒夂涂寡趸富钚?，采集的葉片經(jīng)過液氮處理，放入-80 ℃超低溫冰箱，待3次葉片采集完成，同時(shí)測(cè)定。

表1 草莓幼苗的不同Spd濃度組合處理

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 光合色素含量的測(cè)定 取樣品0.1 g，剪碎后加入95%乙醇，黑暗處浸提26～30 h，至葉片顏色變白，葉綠素提取完全，使用紫外分光光度計(jì)分別在470、649、665 nm下測(cè)定吸光度，每個(gè)處理重復(fù)3次，計(jì)算葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素、類胡蘿卜素含量[17]。

1.3.2 光合特性相關(guān)指標(biāo) 采用開放式氣體交換Li-6400便攜式光合儀于處理后3、6、9 d 10：00—12：00測(cè)定草莓幼苗自上至下第2～4張完全展開功能葉片的氣孔導(dǎo)度(Gs)、凈光合速率(Pn)、胞間CO2濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.3 熒光指標(biāo)的測(cè)定 處理后3、6、9 d的 12：00—13：00進(jìn)行葉片遮光30 min后，選取從上到下第2～4張完全展開的功能葉片，采用植物效率儀(M-PEA)測(cè)定葉片初始熒光(Fo)、最大熒光(Fm)、PSⅡ潛在光化學(xué)效率(Fv/Fo)和PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.4 抗氧化酶相關(guān)指標(biāo) 酶提取液的獲得：稱取0.2 g樣本放入預(yù)冷研缽，加2 mL pH值=7.8的0.05 mol/L磷酸緩沖液(含EDTA)，冰浴研磨，勻漿倒入離心管中，于4 ℃離心機(jī)10 500 r/min離心 20 min，上清液(酶液)倒入干凈的離心管中，置于 0～4 ℃條件下保存待用。過氧化物酶(POD)活性通過愈創(chuàng)木酚法測(cè)定；超氧化物歧化酶(SOD)活性通過氮藍(lán)四唑(NBT)還原法測(cè)定；過氧化氫酶(CAT)的活性根據(jù)H2O2的分解速度來測(cè)定；抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性通過紫外分光光度法測(cè)定[18-19]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

全部試驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3次以上，利用SPSS 20.0軟件進(jìn)行顯著性分析和主成分分析，OriginPro 7.5軟件作圖。采用Duncan’s檢驗(yàn)比較平均差異(α=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源Spd對(duì)NaCl脅迫下草莓幼苗葉片光合色素含量的影響

由圖1可知，與對(duì)照相比，T0處理下草莓幼苗葉片的葉綠素a(Chl a)、葉綠素b(Chl b)、類胡蘿卜素(Car)和總?cè)~綠素(Cal a+b)含量均呈下降的趨勢(shì)，光合色素含量在處理后9 d達(dá)到最低值。外源施加不同濃度Spd，均能夠提高草莓葉片的光合色素含量，T2處理效果最佳。從圖1-A可以看出，處理后3、6、9 d，與T0相比，T2處理下的Chl a含量顯著增加32.02%、45.98%、45.98%。從圖1-B可以看出，外源施加Spd后，不同濃度處理下的 Chl b 含量均顯著高于T0，T2處理后3 d與CK相比增加5.64%，與T0相比顯著增加79.24%。從圖1-C可以看出，外源施加Spd后，草莓幼苗的總?cè)~綠素含量均顯著高于T0，在處理后3 d，T1、T2、T3分別增加29.06%、40.67%、24.10%。從圖1-D可以看出，Car在處理后3、6 d，T2處理增幅最顯著，與CK相比分別增加13.93%、3.61%，與T0相比增加25.59%、51.85%。表明外源施加不同濃度Spd都可以有效緩解NaCl脅迫導(dǎo)致的草莓幼苗葉片光合色素含量下降，且以0.5 mmol/L的濃度為最佳。

2.2 外源Spd對(duì)NaCl脅迫下草莓幼苗葉片光合參數(shù)的影響

由圖2可知，T0處理下草莓幼苗葉片光合特性顯著低于CK，凈光合速率(net photosynthetic rate，Pn)，蒸騰速率(transpiration rate，Tr)、氣孔導(dǎo)度(stomatal conductance，Gs)在處理后9 d達(dá)到最低值，與CK相比顯著降低68.09%、72.00%、73.96%。T0處理下的胞間CO2濃度(intercellular CO2concentration，Ci)，隨著時(shí)間的延長，呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，處理后9 d達(dá)到峰值。由圖2-A可以看出，外源施加不同濃度Spd后，草莓葉片的Pn顯著高于T0處理，T1、T2、T3處理的增幅在處理后3 d分別為107.76%、143.15%、76.50%，隨著處理時(shí)間的延長，呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，在處理后9 d下降到最低值。由圖2-B可以看出，外源施加Spd后，顯著提高T0處理下草莓葉片的Tr。處理后3 d與T0相比，T1、T2、T3處理分別增加124.97%、151.08%、118.63%。由圖2-C可以看出，外源施加Spd后草莓葉片的Ci呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，處理后9 d達(dá)到最低值。由圖2-D可以看出，外源施加Spd后，草莓葉片的Gs呈現(xiàn)出先上升再下降的趨勢(shì)，在處理后6 d達(dá)到峰值，與T0相比，T1、T2、T3處理分別增長70.45%、93.18%、38.64%。由此說明，外源施加Spd可顯著緩解NaCl脅迫下草莓葉片光合特性的降低，隨著脅迫時(shí)間的延長，Spd處理效果逐漸減弱。

2.3 外源Spd對(duì)NaCl脅迫下草莓幼苗葉片熒光參數(shù)的影響

由圖3可知，在NaCl脅迫下，草莓幼苗葉片的最大熒光(Fm)、PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、PSⅡ 潛在光化學(xué)效率(Fv/Fo)均呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，處理后9 d降為最低值，初始熒光(Fo)則呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，處理后9 d上升為最大值。由圖3-A可以看出，外源施加Spd后草莓葉片的Fm在處理后 3 d 高于CK和T0，隨著處理時(shí)間的延長，逐漸開始下降，在6、9 d低于CK，高于T0。由圖3-B可以看出，外源施加Spd后，草莓葉片的Fo與T0相比顯著降低，處理后9 d降幅最大，T1、T2、T3處理分別下降29.92%、34.80%、25.87%。由圖3-C可以看出，外源施加Spd后草莓葉片的Fv/Fm顯著高于T0處理，T1處理在處理后3 d 緩解效果最佳，與T0相比，顯著增加12.17%。處理時(shí)間延長至6、9 d時(shí)，T2緩解效果為最佳。由圖3-D可以看出，外源施加Spd后顯著提高了草莓葉片的Fv/Fo，處理后9 d 緩解效果最佳。由此說明，外源施加Spd可有效提高草莓幼苗葉片NaCl脅迫下的光能轉(zhuǎn)化效率，緩解NaCl脅迫對(duì)草莓光系統(tǒng)的破壞。

2.4 外源Spd對(duì)NaCl脅迫下草莓幼苗抗氧化酶的影響

由圖4可知，草莓幼苗葉片的POD、SOD、CAT和APX活性隨著外源Spd處理濃度的升高，呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。從圖4-A可以看出，草莓葉片的POD活性在T0處理3、6、9 d分別增加16.58%、19.27%、5.69%，外源施加不同濃度Spd后顯著高于T0，T1、T2和T3處理后6 d達(dá)到了峰值，與T0相比顯著增加37.58%、118.10%和3.38%；與CK相比顯著增加64.09%、160.12%和23.29%。由圖4-B可以看出，外源施加不同濃度Spd后草莓葉片SOD活性顯著高于T0和CK，T2處理效果為最佳，處理后3 d與CK相比顯著增加70.83%。由圖4-C可以看出，與T0相比，處理后3 d T2處理顯著增加21.24%；T1在處理后6、9 d顯著高于T0。由圖4-D可以看出，外源施加Spd后，草莓葉片的APX活性顯著高于T0和CK，處理后3 d差異最顯著，T1、T2、T3處理與T0相比顯著增加56.15%、71.87%、44.10%，與CK相比顯著增加189.95%、219.14%、167.58%。草莓幼苗在NaCl脅迫下，抗氧化酶活性可以提高，外源施加Spd后，抗氧化酶活性可以在短時(shí)間內(nèi)持續(xù)升高，表明Spd可以緩解葉片受到鹽脅迫后的膜脂過氧化損傷。

2.5 外源Spd對(duì)草莓幼苗鹽脅迫緩解能力的綜合評(píng)價(jià)

利用SPSS對(duì)外源Spd緩解NaCl脅迫下草莓的14個(gè)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，結(jié)果(表2)表明，2個(gè)主成分初始特征值大于1，第1主成分貢獻(xiàn)率為65.269%，第2主成分貢獻(xiàn)率為29.523%，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到了94.792%，所以提取前2個(gè)主成分作為綜合指標(biāo)評(píng)價(jià)依據(jù)。根據(jù)成分矩陣(表2)計(jì)算出主成分得分系數(shù)，計(jì)算2個(gè)主成分的得分如下：

y1=0.324x1+0.324x2+0.299x3+0.327x4+0.327x5+0.284x6+0.317x7-0.294x8+0.329x9+0.320x10+0.025x11+0.053x12-0.057x13-0.037x14；

y2=-0.085x1+0.044x2-0.199x3+0.022x4-0.027x5-0.198x6+0.126x7-0.205x8+0.001x9+0.121x10+0.433x11+0.471x12+0.475x13+0.451x14。

式中：y1和y2代表主成分1和主成分2的得分，x1～x14分別代表Chl a+b含量、Car含量、Pn、Tr、Ci、Gs、Fm、Fo、Fv/Fm、Fv/Fo、POD活性、SOD活性、CAT活性、APX活性經(jīng)過Z-score方法標(biāo)準(zhǔn)化處理的值。

根據(jù)綜合主成分分析結(jié)果(表3)，各處理綜合評(píng)價(jià)由高到低排名依次為CK>T2>T1>T3>T0。

表2 主成分分析載荷矩陣

表3 綜合主成分分析值及排序

3 討論與結(jié)論

當(dāng)植物受到逆境脅迫時(shí)，光合作用顯著下降，葉綠素是參與光能吸收、轉(zhuǎn)化和傳遞的重要指標(biāo)[20-21]。鹽脅迫會(huì)影響葉綠素的降解、類囊體膜的穩(wěn)定性以及葉綠體對(duì)光能的吸收，從而影響光能在2個(gè)光系統(tǒng)之間的合理分配，降低光合速率[22]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與CK相比，5 g/L NaCl脅迫下草莓幼苗葉片的Chl a、Chl b、Car以及總?cè)~綠素均顯著降低。這與李文娟對(duì)鹽脅迫下草莓的研究結(jié)果[23]一致。本試驗(yàn)對(duì)葉片表面噴施不同濃度的外源Spd后，顯著提高草莓葉片的光合色素含量，說明Spd可有效降低鹽脅迫下草莓葉片光合色素含量下降的速度，這與張乃元對(duì)菊花幼苗的研究結(jié)果[9]保持一致，可能是因?yàn)閬哠pd常以多聚陽離子的狀態(tài)存在，因此可以直接與細(xì)胞膜上帶負(fù)電荷的磷酸及光合蛋白進(jìn)行結(jié)合，從而穩(wěn)定細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，達(dá)到減輕葉綠體結(jié)構(gòu)被破壞的目的，使光合色素含量下降速度減慢。

鹽脅迫下降低植物光合作用的原因主要分為有氣孔限制和非氣孔限制，非氣孔限制主要包括光合酶活性降低和光合器官受到損傷[24]。Ci隨著Gs的升高而降低，是由于氣孔限制的影響；Ci隨著Gs的升高而升高，則是由于非氣孔因素的影響[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，在NaCl脅迫下草莓幼苗葉片Ci在逐漸降低，說明NaCl脅迫下的葉片光合作用降低主要因?yàn)闅饪紫拗?，可能與光合酶活性降低和光合器官受到損傷有關(guān)。外源施加Spd后顯著緩解草莓葉片的Pn、Tr、Ci和Gs，其中0.5 mmol/L濃度的處理效果最佳。表明Spd可以緩解NaCl脅迫下引起草莓光合作用降低的氣孔限制，增強(qiáng)光合速率和維持光系統(tǒng)穩(wěn)定，這與杜紅陽等在鹽脅迫下大豆外源施加Spd的研究結(jié)果[26]一致。Spd能緩解鹽脅迫下光合作用的原因，可能是其陽離子化合物可以與陰離子結(jié)合，從而緩解鹽脅迫對(duì)草莓幼苗葉片的毒害，保護(hù)葉綠體完整性，促進(jìn)光合作用[27]。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)是用來說明植物光合作用和光合生理狀況的變量或常數(shù)值，被視為研究植物光合作用與環(huán)境作用的關(guān)鍵，葉綠素含量的多少可以直接影響到Fo，從而反映PS Ⅱ中心的活性。本研究發(fā)現(xiàn)，在NaCl脅迫下，F(xiàn)o隨著處理時(shí)間的延長，呈現(xiàn)出增加的趨勢(shì)，并且其值越高，表明光系統(tǒng)中心活性降低，造成這種現(xiàn)象的原因可能是逆境脅迫下活性氧會(huì)積累，破壞植物的葉綠素結(jié)構(gòu)，葉綠素的合成速率下降，從而降低光能的吸收和轉(zhuǎn)化，影響光合作用，這與汪志偉在辣椒上的研究結(jié)果[28]基本一致。在鹽脅迫下PS Ⅱ電子傳遞情況的Fm和光能轉(zhuǎn)化效率的的Fv/Fm都顯著降低，說明 PS Ⅱ 遭到破壞。外源施加不同濃度的Spd，F(xiàn)m和Fv/Fm均有不同程度的提升，說明PS Ⅱ的破壞程度減輕，這可能是因?yàn)橥庠词┘覵pd后導(dǎo)致PS Ⅱ開放程度更大，可以解除鹽脅迫導(dǎo)致光抑制的現(xiàn)象，吸收的光能不再大量以熱能形式消散，而是能夠更多地用于光化學(xué)電子傳遞，完成光合作用[29]。

POD、SOD、CAT和APX是植物酶促防御系統(tǒng)中重要的保護(hù)酶，他們可以催化超氧陰離子自由基，歧化為H2O2和O2，也是清除H2O2的關(guān)鍵酶，從而達(dá)到緩解植株受到脅迫后的損傷[30]。本研究發(fā)現(xiàn)在NaCl脅迫下，酶活性上升，這可能是因?yàn)槟婢趁{迫導(dǎo)致活性氧的增多從而誘發(fā)了保護(hù)酶的合成。與NaCl脅迫相比，外源施加不同濃度的Spd，均可顯著提高抗氧化酶活性。其中0.5 mmol/L濃度的處理效果最顯著，在整個(gè)處理期間，抗氧化酶活性都保持在較高水平，這可能是因?yàn)镾pd促進(jìn)了內(nèi)源多胺和抗氧化酶蛋白的合成，同時(shí)多胺也可以直接結(jié)合到酶分子上，提高單位酶的活性[31]，這與趙東曉等在桑樹上的研究結(jié)果[32]一致。

綜上所述，噴施不同濃度的Spd均可顯著緩解NaCl脅迫下草莓受到的損害，可以不同程度地增加光合色素的含量，顯著提高Pn、Tr、Ci、Gs、Fm、Fv/Fo、Fv/Fm以及SOD、CAT、POD、APX活性，顯著降低Fo的上升速度。對(duì)不同處理進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，0.5 mmol/L濃度Spd緩解草莓鹽脅迫的效果為最佳。