黃酮類中藥干預(yù)程序性細(xì)胞死亡在緩解腦缺血再灌注損傷中的研究進(jìn)展

余松祚

（貴港市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，廣西 貴港 537100）

中風(fēng)（stroke）是世界范圍內(nèi)第二大死因，也是導(dǎo)致寰球人類死亡及傷殘的主要緣由之一。發(fā)展中國(guó)家的發(fā)病率不斷升高，其中大多數(shù)中風(fēng)是由于血液凝塊滯留在大腦的一條動(dòng)脈上，造成大腦動(dòng)脈阻塞引起的缺血性中風(fēng)[1，2]。缺血性中風(fēng)目前最有效的治療手段是早期溶栓治療和經(jīng)皮血管內(nèi)介入治療。然而，盡管再灌注恢復(fù)氧氣供應(yīng)具有有益效果，但快速再灌注對(duì)腦功能依然造成有害影響，也會(huì)加重神經(jīng)細(xì)胞的損傷，顯著惡化中風(fēng)的功能結(jié)果，即腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）[3]。越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明[4-6]，CIRI 涉及一個(gè)動(dòng)態(tài)復(fù)雜的病理生理過(guò)程，包括：能量代謝障礙、鈣超載、線粒體功能障礙、興奮性氨基酸毒性、氧化應(yīng)激損傷、免疫炎癥、硝化應(yīng)激損傷、自噬和細(xì)胞焦亡等，且其致殘率和死亡率高。因此，亟待發(fā)現(xiàn)預(yù)防及治療CIRI的新藥物。

中藥用于治療缺血性腦卒的歷史悠長(zhǎng)，可通過(guò)多種途徑、多個(gè)作用靶點(diǎn)改善神經(jīng)功能缺損發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用；另外，中藥所含的多種活性成分可從多靶點(diǎn)阻斷CIRI 的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[7]。隨著高通量篩選技術(shù)的快速發(fā)展，具有多靶點(diǎn)藥理活性的天然產(chǎn)物作為潛在的新藥引起了公眾的關(guān)注，特別是黃酮類中藥具有突出的藥理作用。黃酮類、黃酮醇類、二氫黃酮類、異黃酮類、黃烷酮類等黃酮類中藥均對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有不同程度的保護(hù)作用。此外，黃酮類中藥具有多種生物活性物質(zhì)屬于多元酚物質(zhì)，有抑制神經(jīng)元凋亡、抑制鐵死亡、增強(qiáng)抗氧化酶活性、免疫調(diào)節(jié)以及抗氧化損傷等效果[8-10]。程序性細(xì)胞死亡（programmed cell death，PCD）從根本上來(lái)說(shuō)是所有細(xì)胞活動(dòng)中不可或缺的過(guò)程，包括細(xì)胞發(fā)育、傷口愈合和腫瘤的免疫監(jiān)視等。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多個(gè)PCD 過(guò)程，包括細(xì)胞凋亡和非凋亡形式的細(xì)胞死亡（鐵死亡、自噬、細(xì)胞焦亡、壞死性凋亡），在后生動(dòng)物體內(nèi)維持平衡中起著至關(guān)重要的作用[11]?，F(xiàn)將黃酮類中藥干預(yù)CIRI 程序性細(xì)胞死亡作用機(jī)制進(jìn)行綜述，以期為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)黃酮類中藥的潛在治療價(jià)值提供參考。

1 黃酮類中藥干預(yù)鐵死亡對(duì)CIRI 的防治

鐵死亡是一種新進(jìn)發(fā)現(xiàn)的熱門新型PCD，其特征是過(guò)度依賴鐵的脂質(zhì)過(guò)氧化，已被證明與多種人類疾病有關(guān)，最顯著的是組織缺血再灌注損傷、神經(jīng)變性和癌癥等[12]。缺血再灌注是一種病理過(guò)程，發(fā)生在許多器官和疾病中，可導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡。大腦是最容易迸發(fā)缺血再灌注的器官之一，腦水腫和腦壞死是CIRI 的主要表現(xiàn)[13]。大腦特別容易受到富含多不飽和脂肪酸和鐵的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，因?yàn)殍F主要以二價(jià)鐵和三價(jià)鐵形式存在，氧化還原活性和這兩種狀態(tài)之間的循環(huán)導(dǎo)致通過(guò)芬頓反應(yīng)產(chǎn)生活性氧。在缺血腦組織中，再灌注后活性氧升高，抗氧化系統(tǒng)的防御能力減弱，可誘導(dǎo)鐵死亡并導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病中的神經(jīng)元死亡[14]。

與鐵死亡相關(guān)的機(jī)制很復(fù)雜，主要包括3 個(gè)因素：鐵、氨基酸和脂質(zhì)代謝。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（GPX4）是鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在將脂質(zhì)過(guò)氧化氫轉(zhuǎn)化為無(wú)毒脂質(zhì)中起著至關(guān)重要的作用。此外，谷胱甘肽是GPX4 的重要輔助因子，GPX4 的失活或谷胱甘肽的消耗會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)氫過(guò)氧化物的積累，最終誘導(dǎo)鐵死亡。

山奈酚是一種主要的生物類黃酮，存在于許多蔬菜、水果和藥用植物中。有研究發(fā)現(xiàn)[15]，山奈酚部分通過(guò)激活Nrf2/SLC7A11/GPX4 信號(hào)通路抑制鐵死亡，從而保護(hù)神經(jīng)元。高良姜素也是一種黃酮類化合物，主要從中草藥中提取。高良姜素通過(guò)激活SLC7A11/GPX4 軸抑制鐵死亡，并對(duì)CIRI 后沙鼠的海馬神經(jīng)元具有保護(hù)作用[9]。

紅花黃色素是一種從紅花中提取的類黃酮化合物，Guo H 等[16]使用腦動(dòng)脈閉塞模型大鼠研究了紅花黃色素對(duì)缺血性中風(fēng)的預(yù)防作用，結(jié)果表明經(jīng)過(guò)2 周紅花黃色素的治療減弱了神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦含水量和梗塞面積。此外，紅花黃色素還抑制了Fe2+和活性氧物質(zhì)的積累，并逆轉(zhuǎn)?；o酶A 合成酶長(zhǎng)鏈家族成員4、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1、GPX4 和鐵蛋白重鏈1 蛋白在大腦中的表達(dá)水平。血清中谷胱甘肽、超氧化物歧化酶和丙二醛的水平也被紅花黃色素處理逆轉(zhuǎn)。相關(guān)研究說(shuō)明類黃酮化合物紅花黃色素可以通過(guò)減輕大鼠炎癥和鐵死亡而改善腦缺血再灌注損傷。

另外，Guan X 等[17]發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物香芹酚可以通過(guò)降低缺血性沙鼠腦組織中脂質(zhì)過(guò)氧化物的水平，增加GPX4 的表達(dá)來(lái)抑制鐵死亡，從而對(duì)暴露于缺血/再灌注的沙鼠的認(rèn)知功能障礙發(fā)揮保護(hù)作用，但香芹酚的血腦滲透性以及脂質(zhì)過(guò)氧化介導(dǎo)鐵死亡的具體機(jī)制尚不清楚。

綜上所述，目前山奈酚、高良姜素、紅花黃色及香芹酚等黃酮類中藥干預(yù)鐵死亡防治CIRI 涉及的機(jī)制主要是通過(guò)上調(diào)GPX4 水平和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化。此外，有研究發(fā)現(xiàn)[18]，黃芩素/黃芩苷在生理?xiàng)l件下是一種強(qiáng)鐵螯合劑，但是目前的研究?jī)H僅只報(bào)道了黃芩苷可通過(guò)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，減少鐵過(guò)載，抑制細(xì)胞鐵死亡改善腦出血，尚無(wú)研究證實(shí)黃芩苷是否可以通過(guò)螯合鐵減少鐵過(guò)載來(lái)改善CIRI。

2 黃酮類中藥干預(yù)自噬

黃酮類中藥干預(yù)自噬對(duì)CIRI 的防治細(xì)胞自噬是細(xì)胞內(nèi)溶酶體降解受損細(xì)胞器和大分子的過(guò)程，屬于PCD，在細(xì)胞存活、分化和發(fā)育中發(fā)揮重要的穩(wěn)態(tài)作用，以維持體內(nèi)平衡。自噬主要有3 個(gè)關(guān)鍵蛋白：LC3、Beclin1 和p62。p62 和LC3 共同融合分解自噬來(lái)維持穩(wěn)態(tài)，Beclin1 是PI3K/Akt/mTOR 自噬通路蛋白，可促進(jìn)LC3Ⅱ誘導(dǎo)自噬。細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡往往同時(shí)發(fā)生在組織損傷性疾病中，細(xì)胞自噬與腦缺血再灌注后繼發(fā)性腦組織損傷關(guān)系密切[19]。進(jìn)一步來(lái)說(shuō)，在再灌注早期，自噬可以通過(guò)清除受損的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)起到保護(hù)作用；但在再灌注后期，過(guò)度自噬導(dǎo)致自噬細(xì)胞死亡，導(dǎo)致隨后的細(xì)胞和組織損傷。因此，通過(guò)調(diào)節(jié)自噬以防治CIRI 是一個(gè)潛在的新療法[20]。

近年來(lái)，越來(lái)越多的中藥被證明具有調(diào)節(jié)腦神經(jīng)元自噬水平，減輕CIRI 的作用。松柏素是蜂膠中含量最高的天然黃酮類化合物，Tao J 等[21]將松柏素單獨(dú)或與自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素聯(lián)合給予CIRI 大鼠，結(jié)果顯示松柏素可以顯著減輕CIRI 大鼠海馬CA1錐體神經(jīng)元的損傷。此外，松柏素不僅降低了CIRI大鼠海馬CA1 中LC3II 和Beclin1 的表達(dá)并增加了p62 的水平，還減少了CIRI 大鼠自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷和自噬的過(guò)度激活?？梢?jiàn)，黃酮類中藥松柏素可通過(guò)抑制自噬改善CIRI。同樣，Yang S 等[22]的研究也發(fā)現(xiàn)，黃酮類中藥黃芩素可增加Bcl-2/Bax 比率，并降低caspase-3 表達(dá)，以減少神經(jīng)元凋亡和改善神經(jīng)元丟失。

此外，黃芩素還降低了LC3-II/LC3-I 比率并促進(jìn)了PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路的磷酸化，這意味著黃芩素也可以通過(guò)抑制自噬來(lái)改善CIRI。Feng J 等[23]也發(fā)現(xiàn)一種雙氫黃酮類化合物柚皮苷擁有強(qiáng)大的清除過(guò)氧亞硝酸鹽能力并抑制CIRI 條件下超氧化物和一氧化氮的產(chǎn)生。此外，柚皮苷減少了3-硝基酪氨酸的形成，降低了線粒體部分中LC3-II 與LC3-I 的比例，提示柚皮苷可通過(guò)抑制過(guò)氧亞硝酸鹽介導(dǎo)的線粒體自噬激活減輕腦缺血再灌注損傷。

3 黃酮類中藥干預(yù)細(xì)胞焦亡

細(xì)胞焦亡是一種受調(diào)節(jié)的細(xì)胞死亡的促炎形式，是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的新PCD。細(xì)胞焦亡主要分為依賴caspase-1 的經(jīng)典途徑和依賴caspase-4/5/11 的非經(jīng)典途徑兩種[24,25]。在經(jīng)典途徑中，炎癥小體可以通過(guò)模式識(shí)別受體識(shí)別病原體相關(guān)分子模式、危險(xiǎn)相關(guān)分子模式以及改變穩(wěn)態(tài)的分子過(guò)程。之后模式識(shí)別受體被激活并招募半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域，進(jìn)一步促進(jìn)模式識(shí)別受體與caspase-1 前體結(jié)合，形成成熟的caspase-1，接著激活炎癥小體和Gasdermin D 促進(jìn)IL-1β 和IL-18 的釋放，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹和破裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞焦亡。而在非經(jīng)典途徑中則是通過(guò)脂多糖直接與caspase-11/4/5 結(jié)合并激活，然后裂解Gasdermin D，誘導(dǎo)膜孔形成，最終觸發(fā)激活NLRP3 炎癥小體[26]。

細(xì)胞焦亡與許多疾病如心腦血管疾病、腫瘤和缺血再灌注損傷的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，急性CIRI 可引發(fā)神經(jīng)炎癥，從而激活先天免疫反應(yīng)和一系列炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。而NLRP3 炎癥小體參與炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的調(diào)節(jié)，可同時(shí)導(dǎo)致CIRI 中Gasdermin D 執(zhí)行細(xì)胞焦亡[27]。目前關(guān)于黃酮類中藥通過(guò)干預(yù)焦亡以改善CIRI 的研究比較鮮見(jiàn)，只有Huang L 等[28]采用胎鼠大腦皮層神經(jīng)元氧-葡萄糖剝奪模型和大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞模型分別在體外和體內(nèi)模擬腦缺血再灌注損傷，研究結(jié)果表明姜黃素對(duì)神經(jīng)元增殖有促進(jìn)作用，對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞焦亡有抑制作用。其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制p38 MAPK 通路有效抑制NLRP1依賴性神經(jīng)元焦亡，從而對(duì)腦缺血再灌注損傷發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

黃酮類中藥具有多種生物活性，包括抗炎抗氧化等，并且在許多研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)黃酮類中藥，如高良姜素[29]、二氫楊梅素[30]、異甘草苷[31]、黃芩素[32]等可通過(guò)不同機(jī)制干預(yù)焦亡以改善各類疾病，所以進(jìn)一步研究黃酮類中藥通過(guò)干預(yù)焦亡以改善CIRI也不免為另一種策略。

4 黃酮類中藥干預(yù)壞死性凋亡

壞死性凋亡，也稱為調(diào)節(jié)性壞死或者程序性壞死，由特定死亡受體檢測(cè)到的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境擾動(dòng)引發(fā)，是一種不同于凋亡和壞死的新型細(xì)胞死亡形式。近年來(lái)，不少研究發(fā)現(xiàn)CIRI 中存在壞死性凋亡[33-36]。壞死性凋亡的機(jī)制是由炎癥受體的激活引發(fā)的，包括腫瘤壞死因子、TOLL 樣受體和FAS配體。這些信號(hào)激活受體相互作用蛋白激酶（RIPK）1、3 和混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣假激酶（MLKL）以引發(fā)壞死性凋亡[37]。女貞苷是一種黃酮類中藥，具有抗炎和補(bǔ)體抑制作用。有研究發(fā)現(xiàn)[38，39]，女貞苷通過(guò)靶向RIPK1/RIPK3/MLKL 通路減少CIRI 大鼠腦的壞死性凋亡，從而保護(hù)大鼠腦免受缺血再灌注損傷。另外，研究報(bào)道稱，柚皮油對(duì)CIRI 具有神經(jīng)保護(hù)作用，可能是通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的壞死性凋亡實(shí)現(xiàn)的[40，41]。

5 總結(jié)與展望

CIRI 是一個(gè)復(fù)雜且多環(huán)節(jié)的病理生理過(guò)程。心肺復(fù)蘇患者功能喪失和死亡最重要的原因就是CIRI 引起的神經(jīng)功能喪失。而中醫(yī)藥作為我國(guó)獨(dú)特的瑰寶，在治療疾病方面具有多通路、多靶點(diǎn)、毒副作用小且經(jīng)濟(jì)成本低等優(yōu)勢(shì)，尤其是黃酮類中藥。黃酮類中藥由一類來(lái)自藥用植物的次生代謝物組成，具有許多藥理活性，包括心臟保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)和抗炎等。大量證據(jù)表明，黃酮類中藥在體外和體內(nèi)缺血模型中均具有強(qiáng)大的神經(jīng)保護(hù)特性。黃酮類中藥通過(guò)啟動(dòng)各種潛在的信號(hào)通路，干預(yù)PCD，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血后損傷發(fā)揮抑制鐵死亡、自噬、細(xì)胞焦亡和壞死性凋亡作用，從而改善CIRI。從目前的研究來(lái)看，黃酮類中藥通干預(yù)細(xì)胞焦亡和壞死性的凋亡來(lái)改善CIRI 方面的作用機(jī)制研究還比較缺乏。因此，未來(lái)的研究可聚焦于這一方向，以期為CIRI患者提供新的治療方法。