自體富血小板血漿在慢性難愈合創(chuàng)面治療中的應(yīng)用進(jìn)展

李曉輝，黃象艷

解放軍聯(lián)勤保障部隊第九六〇醫(yī)院輸血醫(yī)學(xué)科，濟(jì)南 250031

慢性難愈合創(chuàng)面是由于各種內(nèi)外界因素引起的機(jī)體正常皮膚或組織缺損后，經(jīng)過＞4 周的常規(guī)治療干預(yù)，仍無法通過自身修復(fù)達(dá)到功能及解剖完整的創(chuàng)面［1］。慢性難愈合創(chuàng)面俗稱潰瘍，包括糖尿病足潰瘍（DFU）、下肢靜脈性潰瘍（VLU）、壓力性潰瘍（PU）等，其發(fā)生機(jī)制復(fù)雜、病程長，具有很高的致殘率。由于此類患者需長期住院，長期換藥，經(jīng)過多次清創(chuàng)手術(shù)但療效不佳。自體富血小板血漿（PRP）是自體全血通過離心后而得到的高濃度血小板濃縮物，其血小板濃度比全血高4～6 倍。PRP 富含多種生長因子和纖維蛋白，可以促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)和再生，加速軟組織愈合，改善患者的愈合質(zhì)量。研究證實，PRP技術(shù)被廣泛應(yīng)用于難愈合創(chuàng)面的治療和軟組織損傷的修復(fù)［2］?，F(xiàn)就PRP 在促進(jìn)慢性難愈合創(chuàng)面治療中的應(yīng)用進(jìn)展綜述如下。

1 PRP的制備

PRP 制劑最早于20 世紀(jì)80 年代被描述為血小板計數(shù)高于正常外周血的血漿。PRP的制備方法有很多，目前關(guān)于血液成分濃度的最佳PRP 制劑尚未達(dá)成共識。一般而言，PRP 的制備方法可分為手工離心法和成分血單采機(jī)制備法。以手工離心法為基礎(chǔ)的PRP 制備商用套裝主要有Arthrex 套裝、Regen套裝、威高套裝和Harvest套裝等。

手工離心法是根據(jù)血液中紅細(xì)胞、血小板等成分沉降系數(shù)的不同，通過改變對新鮮全血的離心力大小和離心時間，從而獲得所需PRP。手工離心法一般采用兩步離心自體外周血的方法，制備方法如下：①于無菌抗凝劑試管中采集患者靜脈血；②以460 g轉(zhuǎn)速離心全血后分為貧血小板血漿、高濃度血小板和紅細(xì)胞三層；③將上層、中層以及淺表的紅細(xì)胞層移入新的無菌試管，以3 000 g 轉(zhuǎn)速離心后分為貧血小板血漿、富血小板血漿、少量紅細(xì)胞三層；④丟棄貧血小板血漿層，即獲成品PRP。手工離心的方法制備的PRP終體積較小，一般小于10 mL。

成分血單采機(jī)制備法使用血液成分分離機(jī)通過離心分離血細(xì)胞和血漿，從而獲取PRP，再將其余血液成分回輸供血者體內(nèi)。相比手工制作來說，機(jī)器制備PRP 的優(yōu)點：①PRP 采集過程封閉，污染機(jī)會低；②機(jī)器制作的PRP 濃度相對穩(wěn)定，白細(xì)胞及紅細(xì)胞清除率高；③數(shù)值可根據(jù)臨床需要調(diào)控，提取的血小板數(shù)量及濃度更精確；④患者自體血液損失少，PRP 采集時間短；⑤PRP 一次采集后，可以多次使用，成本—效益比提升。

PRP的制備方法有多種，無論哪一種制備方式，都需對PRP 的血小板計數(shù)、生長因子濃度、有無細(xì)菌污染及有無沉淀等進(jìn)行質(zhì)量控制。研究者應(yīng)根據(jù)自己的實際情況選擇合適的方法，并使用獲得國家Ⅲ類醫(yī)療器械注冊證的衛(wèi)生材料在封閉狀態(tài)下分離制備。中國輸血協(xié)會輸血管理學(xué)專業(yè)委員會在2021 年推出了PRP 制備技術(shù)規(guī)范化和制品質(zhì)量控制的專家共識，對PRP 制備人員條件、設(shè)備要求、耗材質(zhì)量、衛(wèi)生環(huán)境和質(zhì)量控制等均做出規(guī)范，并推薦成分血單采機(jī)采集制備為首選PRP制備方法［3］。

2 PRP的生物學(xué)特性及在創(chuàng)面修復(fù)中的作用機(jī)制

PRP 是高濃度血小板濃縮物，其作用機(jī)制始于血小板中α顆粒的降解。當(dāng)PRP中的血小板被凝血酶和氯化鈣等激活劑激活后，血小板中的α 顆粒會釋放出大量生長因子，如血小板衍生生長因子（PDGF）、表皮生長因子（EGF）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等，約70%儲存在血小板中的生長因子在最初10 min 內(nèi)釋放，血小板生長因子的完全釋放在活化后1 h 內(nèi)完成［4］。研究證實，這些生長因子能促進(jìn)新生血管生成、刺激細(xì)胞增殖分化，促進(jìn)軟組織創(chuàng)面的修復(fù)。此外，血小板δ 顆粒包含血清素、組胺、多巴胺、鈣和腺苷，它們與前述生長因子一起，調(diào)控創(chuàng)面愈合。

PRP 中的血小板被激活劑激活后，可形成凝膠狀，覆蓋于創(chuàng)面，不僅能填充黏合創(chuàng)面，還能起到封閉創(chuàng)面的作用，從而使血小板流失速度減慢，潰瘍局部能長時間維持在高濃度生長因子環(huán)境。有研究表明，PRP被激活劑激活后，注入竇道內(nèi)或覆蓋于創(chuàng)面表面，高濃度的生長因子可維持15 d。

PRP 的生長因子釋放至潰瘍局部時，可促進(jìn)潰瘍局部的血管新生，從而為創(chuàng)面修復(fù)建立有效的微循環(huán)，還可加速細(xì)胞外基質(zhì)的合成，促進(jìn)創(chuàng)面的再生修復(fù)。TGF 能通過上調(diào)mRNA 增加膠原蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)上皮化，從而促進(jìn)膠原合成、類骨生成、基質(zhì)形成等。EGF 參與誘導(dǎo)創(chuàng)面內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，促進(jìn)成纖維細(xì)胞、表皮細(xì)胞的增殖和新生肉芽組織的形成，加快細(xì)胞生長速度。VEGF 是參與血管新生的重要信號蛋白，為創(chuàng)面修復(fù)提供血運(yùn)保障。研究表明，這些生長因子可結(jié)合相關(guān)靶細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、表皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等的跨膜蛋白受體，通過激活細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，促進(jìn)細(xì)胞的增殖分化、膠原合成，從而促進(jìn)創(chuàng)面的愈合［5］。

除了PRP 中的血小板被激活后釋放生長因子外，PRP 富含大量的纖維蛋白原、血清素、纖維連接蛋白、因子Ⅴ、因子Ⅷ和因子Ⅳ，由于這些介質(zhì)，血小板凝塊形成，并通過纖維蛋白和黏性糖蛋白的交聯(lián)，促進(jìn)血小板穩(wěn)定。由此形成的纖維蛋白基質(zhì)，促進(jìn)了單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和其他祖細(xì)胞的組織浸潤，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。臨床研究表明，PRP 能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，增加Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維的產(chǎn)生，提高膠原蛋白的平行性、均勻性和密度。

PRP中活化的血小板能分泌具有天然抗菌活性的肽類，在炎癥調(diào)節(jié)、殺菌等方面發(fā)揮重要作用。PRP中的細(xì)胞因子和活性蛋白，參與改善炎癥反應(yīng)，抑制潰瘍局部細(xì)菌微生物生長，其作用機(jī)制與抑制炎癥因子的轉(zhuǎn)錄活性和C-X-C 趨化因子受體4 的基因序列表達(dá)有關(guān)。研究表明，PRP治療的傷口中，感染率降低［6］。此外，PRP 還能加快細(xì)胞的新陳代謝，降低細(xì)胞的凋亡率，從而促進(jìn)創(chuàng)面的再生與修復(fù)。

3 PRP在難愈合創(chuàng)面修復(fù)中的應(yīng)用

3.1 PRP 在DFU 中的應(yīng)用 PRP 能有效改善DFU創(chuàng)面的愈合，縮短愈合時間。梁妙賢等［7］研究觀察了PRP 對糖尿病足潰瘍不同治療周期的臨床療效，發(fā)現(xiàn)PRP 治療能縮短住院時間，提高患者滿意度，對糖尿病足潰瘍患者功能恢復(fù)有較好療效。AHMED 等［8］研究比較了應(yīng)用PRP 血小板凝膠與常規(guī)使用消毒藥膏敷料對糖尿病足潰瘍的治療效果，發(fā)現(xiàn)PRP 組的創(chuàng)面愈合率高于對照組，傷口感染率低，且治療的前8周愈合率較高，這可能是由于持續(xù)升高的生長因子水平引起的受體下調(diào)。DAI 等［9］通過對PubMed、EMBASE、BIOSIS、Cochrane central 等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行系統(tǒng)性回顧分析發(fā)現(xiàn)，PRP 可提高潰瘍的完全愈合率，縮短愈合時間，且不增加不良事件的發(fā)生率。LI 等［10］通過對糖尿病感染的傷口體外模型研究認(rèn)為，miRNA-21 可能通過PDCD4 調(diào)節(jié)NF-κB 的表達(dá)，在PRP 治療感染性糖尿病足潰瘍中發(fā)揮抗炎和促進(jìn)增殖的作用，該發(fā)現(xiàn)可以為難愈性創(chuàng)面提供新的治療靶點。PRP 可單獨或聯(lián)合應(yīng)用，促進(jìn)DFU創(chuàng)面的愈合。蘇福增等［11］對240例糖尿病足潰瘍的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，負(fù)壓封閉引流（VSD）聯(lián)合PRP 技術(shù)在糖尿病足潰瘍治療中療效確切。DE ANGELIS 等［12］對182 例以透明質(zhì)酸和PRP 為基礎(chǔ)的生物功能化支架在慢性潰瘍中的體內(nèi)外研究表明，PRP 與透明質(zhì)酸聯(lián)合治療比單純傳統(tǒng)敷料在表皮增殖和真皮再生方面表現(xiàn)出更強(qiáng)的再生潛力。EBRAHIM 等［13］研究指出，PRP聯(lián)合脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADMSCs）可通過調(diào)節(jié)病理上調(diào)的Notch 1信號通路，增強(qiáng)血管生成，并觸發(fā)表皮細(xì)胞增殖和募集，促進(jìn)DFU 創(chuàng)面愈合，表明Notch1 信號通路是糖尿病創(chuàng)面一個新的潛在治療靶點。YARAHMADI 等［14］對25 例未愈合DFU 患者進(jìn)行了隨機(jī)對照試驗發(fā)現(xiàn)，PRP 與口服維生素E 和C 可通過增強(qiáng)傷口愈合過程和減少氧化應(yīng)激來增加非愈合性DFU 患者的傷口愈合。

有研究指出，PRP 治療能促進(jìn)糖尿病足潰瘍愈合，但在創(chuàng)面并發(fā)癥和復(fù)發(fā)率上和傳統(tǒng)治療相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義［15］。國外一項系統(tǒng)回顧和薈萃分析結(jié)果顯示，PRP 能顯著增加DFU 創(chuàng)面的完全愈合，縮短愈合時間，減少創(chuàng)面大小和深度，在創(chuàng)面感染、復(fù)發(fā)、截肢和住院方面均未發(fā)現(xiàn)明顯變化［16-17］。分析可能是由于DFU 患者本身的高血糖和局部炎癥反應(yīng)對生長因子產(chǎn)生負(fù)面影響，導(dǎo)致VEGF 的血管生成作用和PDGF 對成纖維細(xì)胞的增殖作用減弱，從而降低了PRP的療效［18］。

3.2 PRP 在VLU 中的應(yīng)用 PRP 有利于VLU 創(chuàng)面的組織再生修復(fù)功能，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。任君文等［19］對比分析了PRP 治療慢性靜脈性潰瘍的臨床療效，發(fā)現(xiàn)PRP 治療組較對照組創(chuàng)面面積明顯縮小，愈合時間明顯縮短，PRP 可有效促進(jìn)慢性靜脈性潰瘍創(chuàng)面愈合，且安全性高。HELMY 等［20］將80 例臨床表現(xiàn)為慢性下肢靜脈性潰瘍的患者納入隨機(jī)對照試驗發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)治療相比，PRP 治療效果更好，潰瘍復(fù)發(fā)率為零。BOSSART 等［21］對4例患者共有7 處慢性腿部潰瘍，使用數(shù)字成像軟件，根據(jù)局部應(yīng)用PRP后慢性靜脈潰瘍的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)碼照片，研究評估潰瘍愈合率，發(fā)現(xiàn)7 例潰瘍中有5 例經(jīng)PRP 治療的傷口愈合速度比對照組快，支持PRP 治療在慢性靜脈性下肢潰瘍管理中的評估。SHEHAB等［22］在一項針對持續(xù)性慢性靜脈后下肢患者的單中心隨機(jī)對照研究發(fā)現(xiàn)，PRP作為慢性靜脈潰瘍壓迫療法的輔助治療，在潰瘍愈合和疼痛評分改善方面安全有效。相反，有研究表明，與安慰劑相比，PRP治療靜脈潰瘍沒有效果，而且在潰瘍復(fù)發(fā)方面，PRP治療似乎并不更有利［23］。LEE 等［24］在他們的系統(tǒng)綜述中總結(jié)道，在慢性靜脈性下肢潰瘍患者中，生長因子對傷口完全愈合的影響不顯著。報道的不一致性可能與PRP 制備方法和質(zhì)量及個體差異有關(guān)，還需進(jìn)一步循證醫(yī)學(xué)依據(jù)證實。

3.3 PRP 在PU 中應(yīng)用 PRP 可被應(yīng)用于PU 導(dǎo)致的創(chuàng)面愈合，促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)。白志瑤等［25］觀察與評價PRP 在難治性壓瘡中的應(yīng)用效果，發(fā)現(xiàn)PRP 能提高難治性壓瘡的愈合能力，避免了免疫排斥、疾病傳播，可行性強(qiáng)。LIU等［26］對102例難治性壓傷患者的隨機(jī)對照研究發(fā)現(xiàn)，PRP凝膠可加速創(chuàng)面愈合，減輕創(chuàng)面疼痛，縮短治療周期，調(diào)節(jié)TIMP-1、MMP-9 水平及肉芽組織特異性蛋白表達(dá)，降低炎癥因子IL-1b、IL-8、TNF-ɑ水平，改善患者生活質(zhì)量，且不增加并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險。VOLAKAKIS 等［27］利用數(shù)字平面儀客觀評估了PRP 治療對壓力性潰瘍愈合的影響，發(fā)現(xiàn)PRP治療后潰瘍的表面積、直徑和周長明顯減少，與常規(guī)治療相比有統(tǒng)計學(xué)差異。ROJAS MORA 等［28］報告顯示了在1例傳統(tǒng)治療未取得滿意進(jìn)展的原發(fā)性壓瘡患者中使用PRP 的積極經(jīng)驗，考慮到傷口愈合的有效性和無不良反應(yīng)，使用PRP 被認(rèn)為是在門診或醫(yī)院環(huán)境中管理慢性壓瘡的一種有前途的治療方法。SINGH等［29］對52例脊髓損傷合并Ⅲ/Ⅳ級壓瘡患者的隨機(jī)對照研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，PRP治療組在潰瘍表面積、肉芽組織上皮化、血管新生方面有顯著改善，表明PRP 可能是治療壓瘡的一種更好替代療法。

4 PRP應(yīng)用于創(chuàng)面修復(fù)治療和研究的局限性

大量的實驗和臨床研究證實了PRP 在慢性難愈合創(chuàng)面治療的有效性，但PRP 的治療效果仍存在爭議，且患者之間存在統(tǒng)計學(xué)差異，提示PRP 應(yīng)用可能存在一定的局限性。從生物學(xué)的角度來看，PRP的臨床療效存在爭議部分歸因于PRP制備步驟的不一致，以及由此產(chǎn)生的PRP 細(xì)胞成分/濃度、纖維蛋白密度/聚合、生物活性分子組成和產(chǎn)物形態(tài)的差異。因此，標(biāo)準(zhǔn)化的PRP 制備是必要的，以解決PRP 生物學(xué)特性的變異性，并有助于在臨床中更廣泛的應(yīng)用。其次，對于老年患者或伴有高血壓、糖尿病等基礎(chǔ)疾病的患者，在接受PRP 治療前可能有長期服藥史，而某些抗血小板藥物對血小板的功能和狀態(tài)可能會有潛在的影響。ETULAIN 等［30］研究表明，抗血小板藥物乙酰水楊酸預(yù)處理PRP后，PRP介導(dǎo)的血管生成被完全消除，提示抗血小板藥物可能會對PRP的療效產(chǎn)生負(fù)面影響。

當(dāng)然，某些研究本身存在一定局限性。如樣本量小，限制了研究結(jié)果的歸納。目前關(guān)于PRP 在慢性難愈合創(chuàng)面治療的遠(yuǎn)期預(yù)后及不良反應(yīng)的報道尚不充分，需進(jìn)一步大規(guī)模研究來證明PRP 在慢性難愈合創(chuàng)面治療中的作用和有效性。PRP中各種生長因子的活性、作用機(jī)制及PRP 的濃度與促進(jìn)組織再生的劑量與效應(yīng)關(guān)系尚未完全闡明。PRP在體外的保存時間為5～7 d，如何利用冰凍保存方式有效延長保存時間，避免多次采集提取制備；異體PRP 取代自體PRP治療是否可行等問題仍亟待解決［31］。

綜上所述，PRP 對慢性難愈合創(chuàng)面有明顯修復(fù)作用，可顯著縮短治療周期，并且PRP 完全來源于自體，無疾病傳染風(fēng)險且不良反應(yīng)少。但PRP 各種生長因子之間復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制仍未完全闡明，PRP的最佳有效濃度、最佳使用時間和劑量、最佳保存方式及異體捐獻(xiàn)的PRP 代替治療是否可行，仍需進(jìn)一步臨床試驗研究證實。