血小板功能檢測(cè)在血栓性疾病診斷中的研究進(jìn)展

張帆 閆本純 李琪 路瑤 李晨 李春燕 馬思琦 閆海潤(rùn)

血栓性疾病包括靜脈血栓性疾病及動(dòng)脈血栓性疾病，嚴(yán)重?fù)p害人體健康，其是凝血和纖溶系統(tǒng)功能失調(diào)，以及凝血- 抗凝系統(tǒng)不平衡所致[1]。而血小板在原發(fā)性止血和血栓形成過程中起著關(guān)鍵作用，監(jiān)測(cè)其異?；罨瘜?duì)了解血栓的發(fā)生、發(fā)展至關(guān)重要。既往一些實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，如D-二聚體（D-Dimer，DD）、纖維蛋白原降解產(chǎn)物（Fibrin degradation products，F(xiàn)DP）等對(duì)血栓性疾病的預(yù)測(cè)與評(píng)估已得到了較好的應(yīng)用。隨著對(duì)血小板功能了解的不斷深入，通過對(duì)其部分檢驗(yàn)指標(biāo)如膜蛋白、血小板微粒、血小板釋放活性物質(zhì)、外泌體、特異性血小板標(biāo)志物等的檢測(cè)，對(duì)血栓性疾病的分型、診斷、機(jī)制等研究有了更具針對(duì)性的觀點(diǎn)。隨著檢測(cè)手段的不斷提高，血小板功能檢測(cè)出現(xiàn)許多新方法，為血栓性疾病早期診斷、治療、監(jiān)測(cè)及機(jī)制的研究提供準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)依據(jù)?，F(xiàn)對(duì)近年來血小板功能檢測(cè)在血栓性疾病診斷中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，并介紹一些診斷血栓性疾病的方法學(xué)應(yīng)用。

1 血小板功能與靜脈血栓性疾病

靜脈血栓栓塞癥（Venous thromboembolism，VTE），包括深靜脈血栓栓塞（Deep venous thrombosis，DVT）和肺血栓栓塞（Pulmonary thromboembolism，PTE）[2]。在靜脈血栓形成過程中，其機(jī)制主要包括局部炎癥反應(yīng)和血液高凝狀態(tài)兩個(gè)方面。局部炎癥以內(nèi)皮細(xì)胞活化為特征，內(nèi)皮細(xì)胞活化后釋放Webel-palade小體，并含有血管性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF）以及與膜結(jié)合的P 選擇素。這兩種蛋白都可與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面發(fā)生黏附，分別通過與白細(xì)胞表面的P 選擇素糖蛋白配體1（PSG-1）和整合素αMβ2結(jié)合而激活白細(xì)胞。局部炎癥與血栓相互促進(jìn)，加速靜脈血栓形成[3]。血小板功能中的血小板微粒、P 選擇素、硫醇異構(gòu)酶等指標(biāo)對(duì)VTE具有潛在的預(yù)測(cè)能力。

1.1 血小板微粒微粒最初被認(rèn)為與血栓性疾病有關(guān)是因其表面具有促凝作用的磷脂，尤其是磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS），增加了凝血因子Ⅷ與凝血因子Ⅸ、凝血因子V 與凝血因子Ⅹ結(jié)合的親和性，因此使因子凝血酶原酶復(fù)合物與X 酶復(fù)合物的生成效率更高[4]。在血液循環(huán)中，大部分微粒是由血小板產(chǎn)生的，也就是血小板微粒（Platelet microparticle，PMP）。PMP 水平增高表明患者處于高凝狀態(tài)，有較高的VTE 風(fēng)險(xiǎn)。另外，研究顯示，心房顫動(dòng)患者發(fā)生血栓風(fēng)險(xiǎn)是竇性心律患者的4～5倍[5，6]。Siwaponanan 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，房顫患者總循環(huán)微粒水平顯著增加，其中以血小板源性微粒及內(nèi)皮源性微粒增加尤為顯著。Mavroudis 等[8]檢測(cè)了將要進(jìn)行冠狀動(dòng)脈介入治療的急性冠狀動(dòng)脈綜合征（Acute coronary syndrome，ACS）患者冠狀動(dòng)脈和右心房處的微粒含量，結(jié)果顯示，病變部位的冠狀動(dòng)脈微粒含量相對(duì)于右心房處較高。與CT、MRI等影像學(xué)檢查相比，冠心病等心腦血管疾病中PMP的變化會(huì)出現(xiàn)的更早[9]。因此，PMP 可以被認(rèn)為是預(yù)測(cè)血栓性疾病的敏感指標(biāo)，是出現(xiàn)明顯臨床癥狀前的特異性生物標(biāo)志物，對(duì)疾病的病情監(jiān)測(cè)、診療及轉(zhuǎn)歸評(píng)估具有重要作用。

1.2 P 選擇素P 選擇素具有顯著提高血管通透性的能力，刺激病變區(qū)域的炎癥反應(yīng)，并使血管痙攣明顯增加，血小板水平逐漸升高[10]。血小板膜糖蛋白GPIba 受體、P 選擇素與早期炎癥細(xì)胞發(fā)生協(xié)同反應(yīng)，從而使白細(xì)胞的聚集加速。例如，白細(xì)胞整合素αMβ2 通過GPIb a 受體來調(diào)節(jié)血栓形成和DVT 的發(fā)展[11]。Mosevoll 等[12]評(píng)估43 種潛在的深靜脈血栓生物標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)P 選擇素是對(duì)深靜脈血栓診斷良好的潛在生物標(biāo)志物之一。P 選擇素高水平表達(dá)時(shí)可增加血栓形成的發(fā)生率，P 選擇素是DVT 的危險(xiǎn)因素，可作為預(yù)測(cè)DVT 的檢測(cè)指標(biāo)[13]。林毅秋等[14]對(duì)創(chuàng)傷性骨折深靜脈血栓形成的研究發(fā)現(xiàn)，P 選擇素會(huì)顯著升高。因此，P 選擇素作為血小板的特異性活化指標(biāo)，通過檢測(cè)其水平可分析其與患者血栓形成風(fēng)險(xiǎn)及血栓病情演變的關(guān)系，提高對(duì)血栓栓塞風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)及病情評(píng)估的能力。

1.3 蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（Protein disulfide isomerase，PDI）是一種在蛋白質(zhì)合成中促進(jìn)二硫鍵氧化、還原和異構(gòu)化作用的細(xì)胞內(nèi)酶[15]。從血小板和內(nèi)皮細(xì)胞分泌的PDI 是所有血栓形成事件的重要因子[16]。因此，PDI 的血漿水平也可作為血栓性疾病的潛在生物標(biāo)志物。血小板表面PDI 有望成為一種血栓治療的靶點(diǎn)。

VTE 的實(shí)驗(yàn)診斷尚未達(dá)成一致，隨著對(duì)血栓性疾病的了解和檢驗(yàn)技術(shù)的改進(jìn)，通過為臨床提供早期、快速、經(jīng)濟(jì)、高效的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段，檢測(cè)血小板功能中的特異性生物標(biāo)志物可指導(dǎo)臨床對(duì)高危人群早期明確診斷，監(jiān)測(cè)治療效果，降低患者死亡率，提高患者生存質(zhì)量。

2 血小板功能與動(dòng)脈血栓性疾病

動(dòng)脈血栓是致命性心腦血管事件的一種重要病理變化，早期發(fā)現(xiàn)血栓是降低死亡率的關(guān)鍵因素，但目前尚無有效的早期預(yù)警手段，凝血篩查暫且只應(yīng)用于低風(fēng)險(xiǎn)人群，無法準(zhǔn)確評(píng)判血栓風(fēng)險(xiǎn)、血栓形成以及由各種因素引起的血液高凝狀態(tài)[17]。ACS 是以冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂或侵襲，繼發(fā)血栓形成的一組臨床綜合征。在ACS 的發(fā)生發(fā)展中，微粒的促凝活性會(huì)起到促進(jìn)作用[18]。研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、血栓形成和血管痙攣是急性缺血性腦卒中（Artery ischemic stroke，AIS）發(fā)病的重要病理機(jī)制，血管受損、斑塊破裂、血流動(dòng)力學(xué)紊亂引起血小板的活化，是AIS 發(fā)病的重要原因[19]。

2.1 基質(zhì)金屬蛋白酶血小板包含并釋放多種基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs），MMPs是一類具有特定降解能力的鋅依賴性蛋白水解酶。MMPs 參與血管重塑、斑塊破裂、血栓形成等，并且有可能導(dǎo)致急性冠心病，如心肌梗死。MMP-2 和MMP-9 在血管病變中的表達(dá)增高[20，21]。MMPs 和肌鈣蛋白等標(biāo)志物可共同用于ACS 的早期診斷檢測(cè)研究[21]。所以，檢測(cè)MMPs 和肌鈣蛋白水平對(duì)心血管疾病早期診斷具有重要意義，可加強(qiáng)臨床評(píng)估，并進(jìn)一步減少對(duì)診斷成像研究的需求。

2.2 外泌體外泌體是由細(xì)胞分泌的一種膜囊泡，包含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和microRNA 等[22，23]。相較于其他血液成分，血小板分泌外泌體的量最多，內(nèi)容物種類也最為豐富[24]。血小板不僅是血栓的組成成分，也可以通過分泌外泌體來抑制血栓的形成。Srikanthan 等[25]研究顯示，在血栓形成之初，血小板分泌外泌體攜帶的泛素化蛋白（Poly-ubiquitin）可泛素化降解巨噬細(xì)胞中CD36 蛋白，抑制巨噬細(xì)胞的載脂過程，并通過泛素化血小板表面CD36 蛋白抑制血小板自身的再活化和動(dòng)脈血栓形成。因此，外泌體作為一種可預(yù)測(cè)血栓的血液診斷標(biāo)記物，可對(duì)血栓性疾病提供輔助性診斷。

2.3 特異性血小板標(biāo)志物CD62p 和CD63 是最有特異性意義的血小板活化分子標(biāo)志物。CD63 通過與中性粒細(xì)胞接觸，遞送活化信息，從而使中性粒細(xì)胞變形、趨化、黏附，導(dǎo)致局部缺血病變的血管發(fā)炎，從而加劇局部組織缺血。CD63 在預(yù)測(cè)腦卒中事件和抗血小板治療方面有一定的作用。循環(huán)CD62p 在各種缺血性腦卒中患者中也有明顯升高。CD62p 在急性腦梗死中的表達(dá)水平可以評(píng)判病變區(qū)域血小板活化情況，對(duì)其病情及預(yù)后的判斷具有重要意義[26～28]。研究顯示[29]，AIS 患者CD62p 和CD63 的異常表達(dá)與AIS 的發(fā)生、嚴(yán)重程度等有關(guān)，CD62p、CD63 的動(dòng)態(tài)變化特點(diǎn)對(duì)于確定最佳監(jiān)測(cè)點(diǎn)具有重要價(jià)值。

通過檢測(cè)血小板的各項(xiàng)特異性指標(biāo)，對(duì)動(dòng)脈血栓性疾病進(jìn)行早期預(yù)警、早期診斷、病情監(jiān)測(cè)和針對(duì)性治療，在提高患者生存率、改善遠(yuǎn)期預(yù)后及降低疾病致死率、致殘率方面具有重要價(jià)值。

3 血小板功能檢測(cè)方法

3.1 常用血小板功能檢測(cè)方法

3.1.1 光學(xué)比濁法（Light transmission aggregometry，LTA）LTA 作為一種檢測(cè)血小板聚集功能的方法，至今仍被視為檢測(cè)血小板功能的金標(biāo)準(zhǔn)。檢測(cè)原理：將血液通過離心方法分離出富含血小板血漿（PRP），在特定的連續(xù)攪拌條件下，加入誘導(dǎo)劑，隨著血小板聚集率增高，其透光度增加，用比濁儀檢測(cè)透光度的變化來評(píng)估血小板的聚集功能。其優(yōu)點(diǎn)為操作簡(jiǎn)單，應(yīng)用廣泛；缺點(diǎn)為步驟較多，影響因素較多，需要規(guī)范的操作規(guī)程。

3.1.2 血栓彈力圖（Thromboelastography，TEG） TEG利用全血直接對(duì)血小板聚集功能進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)原理：模擬人體內(nèi)環(huán)境下凝血-纖溶整個(gè)過程，聯(lián)合應(yīng)用血流剪切力與不同誘導(dǎo)劑評(píng)價(jià)血塊形成。其優(yōu)點(diǎn)為操作簡(jiǎn)便，反映直觀的凝血過程；缺點(diǎn)為與LTA 法檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性上仍有爭(zhēng)議，價(jià)格昂貴，存在一定局限性。

3.1.3 快速血小板功能分析儀（VerifyNow） VerifyNow是目前歐美國家應(yīng)用較多的血小板功能檢測(cè)方法。檢測(cè)原理：在抗纖維蛋白原包被顆粒介導(dǎo)下血小板聚集，在比濁法下，展示出透光性。其優(yōu)點(diǎn)為用血量少，可床旁檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便；缺點(diǎn)為儀器試劑昂貴，成本高。

3.1.4 電阻抗法（Impedance platelet aggregometry，IPA）IPA 原理為血樣本中加入誘導(dǎo)劑使血小板活化，隨著血小板聚集率增高，全血電阻增高。其優(yōu)點(diǎn)在于使用全血樣本，所需血樣少，操作簡(jiǎn)便；缺點(diǎn)為耗時(shí)長(zhǎng)，檢測(cè)結(jié)果受紅細(xì)胞比容和血小板計(jì)數(shù)影響。

3.1.5 血小板功能分析儀 通過計(jì)量全血在剪切流動(dòng)下形成血小板栓子的時(shí)間，來反映血小板的黏附聚集功能。其優(yōu)點(diǎn)在于檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化的體外出血時(shí)間，可應(yīng)用于嚴(yán)重血小板功能異常評(píng)價(jià)；缺點(diǎn)為缺乏公認(rèn)的參考范圍和療效評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)化差[30]。

3.2 基因測(cè)序高通量測(cè)序（High-throughput sequencing，HTS）技術(shù)即第二代測(cè)序技術(shù)，通過構(gòu)建一個(gè)文庫，將文庫與載體進(jìn)行交聯(lián)擴(kuò)增，在載體上進(jìn)行基因的合成與測(cè)序，以獲得DNA 序列數(shù)據(jù)[31]。當(dāng)抗凝蛋白基因出現(xiàn)功能缺失性突變時(shí)，會(huì)促進(jìn)血栓發(fā)生。凝血因子的功能獲得性突變，會(huì)使血液凝固程度升高，導(dǎo)致血栓的形成。研究發(fā)現(xiàn)一例靜脈血栓患者FⅨ基因1151G/A 突變導(dǎo)致FⅨ氨基酸替換，即FⅨArg384Gln FⅨR384Q（含信號(hào)肽編碼）或FⅨR338Q（經(jīng)典編碼）[32]。祁亞楠等[33]研究顯示，α-纖維蛋白原rs6050（Thr312Ala）基因位點(diǎn)攜帶C 等位基因的人群，更容易出現(xiàn)VTE。因此，C 等位基因檢測(cè)作為對(duì)VTE 高危人群的篩查是一種行之有效的手段，可以為VTE 的預(yù)防、診斷和治療提供參考。以上研究結(jié)果表明，基因檢測(cè)技術(shù)擴(kuò)展了對(duì)血小板疾病的認(rèn)識(shí)，具有很好的臨床應(yīng)用效果，為未來的精準(zhǔn)化基因治療奠定了基礎(chǔ)，值得在臨床上推廣。其不僅大大提高了疾病的診治水平，也為深入探討疾病的發(fā)病機(jī)制提供一個(gè)新方向。

3.3 人工智能近年來，研究表明人工智能（Artificial intelligence，AI）具有良好的診斷和預(yù)測(cè)靜脈血栓形成的能力，具有高靈敏度、特異性和ROC 曲線下面積值?；贏I 的VTE 質(zhì)量控制系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化、動(dòng)態(tài)的過程防治模式，用新技術(shù)評(píng)估患者的風(fēng)險(xiǎn)，以增強(qiáng)預(yù)防意識(shí)，增加高?；颊叩念A(yù)防比例，降低院內(nèi)VTE 的發(fā)病率。隨著AI 在靜脈血栓研究領(lǐng)域的發(fā)展和應(yīng)用，未來可以進(jìn)行更深入、更準(zhǔn)確的分析，從而開發(fā)出適用性強(qiáng)、便捷的AI 模型，在臨床實(shí)踐中廣泛應(yīng)用[34，35]。

4 總結(jié)與展望

血小板是血栓性疾病形成過程中的重要組成部分，其過度活化加速了血栓性疾病的進(jìn)程。目前，臨床上常用DD 作為預(yù)測(cè)指標(biāo)，但其特異性較差。通過對(duì)血小板功能的各項(xiàng)特異性標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，在出現(xiàn)明顯臨床癥狀之前，進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)、早期診斷、及時(shí)干預(yù)，對(duì)于提高患者的生存率和改善預(yù)后非常重要。常規(guī)的血小板測(cè)定方法有通過LTA 和TEG 檢測(cè)血小板聚集功能；血小板功能分析儀在剪應(yīng)力下檢測(cè)血小板黏附聚集功能；流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定血小板表面的抗原以測(cè)定血小板活化狀態(tài)等。常規(guī)血小板功能檢測(cè)有各自的優(yōu)勢(shì)與不足，國內(nèi)研制血小板功能快檢技術(shù)方面尚屬空白，一些血栓性疾病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)尚不具備金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)血栓性疾病的診斷有所滯后。血小板功能檢測(cè)對(duì)血栓性疾病的重要價(jià)值還有待進(jìn)一步得到重視，逐步開展實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)項(xiàng)目應(yīng)用于臨床。

近年來，基因測(cè)序作為一種重要的分子生物學(xué)技術(shù)，已在血栓與止血領(lǐng)域得到應(yīng)用。檢測(cè)血栓性疾病的相關(guān)基因具有較好的篩選價(jià)值，也是臨床診療的重要手段?；驕y(cè)序作為一種精準(zhǔn)的檢測(cè)方法，使疾病的早期診斷有了更加可靠的依據(jù)，雖然目前尚未廣泛應(yīng)用于臨床，卻是未來精準(zhǔn)醫(yī)療的大勢(shì)所趨。AI 作為新興科技力量，具有良好的應(yīng)用效能，有望在臨床大規(guī)模應(yīng)用。