甲基藍(lán)褪色光度法測定醬油中半胱氨酸含量

劉毅，袁莉，儲文，袁嘉怡，馬衛(wèi)興,2,3*

(1.江蘇海洋大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 連云港 222005；2.江蘇海洋大學(xué) 生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)學(xué)院，江蘇 連云港 222005；3.江蘇省海洋藥物篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005)

醬油是傳統(tǒng)的調(diào)味品，由小麥、大豆經(jīng)生物發(fā)酵制成[1]。釀造醬油在發(fā)酵時(shí)會(huì)產(chǎn)生豐富的氨基酸和肽，其中氨基酸成分復(fù)雜，半胱氨酸就是其中之一。

半胱氨酸是一種存在于奶制品、蔬菜、肉類中的天然氨基酸，能夠促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生抗氧劑，去除重金屬離子和有毒有害物質(zhì)[2]，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等多種領(lǐng)域。在食品工業(yè)中，半胱氨酸主要用作果蔬保鮮技術(shù)、果汁中的抗氧化劑、制備烘焙食品和面制食品的添加劑；在醫(yī)藥領(lǐng)域，半胱氨酸主要用于肝臟藥、解毒藥、祛痰藥等醫(yī)用品[3-4]。在化妝品中半胱氨酸能夠破壞皮膚角蛋白中二硫鍵，可用于化妝品行業(yè)的美容水、燙發(fā)精、防曬霜等[5]。因此，建立快速有效的分析方法測定半胱氨酸的含量具有重要的價(jià)值。

測定醬油中氨基酸含量的分析方法主要有高效液相色譜法[6-9]、氨基酸分析儀法[10-13]、離子色譜法[14-15]、紅外光譜法[16]、毛細(xì)管電泳法[17-18]以及其他儀器聯(lián)用的方法[19-21]。大都需要昂貴的儀器，且操作繁瑣。侯學(xué)振等[22]以三丁基膦為還原劑，將胱氨酸還原成半胱氨酸，以丙烯酸芐酯為衍生劑，建立了高效液相色譜法測定醬油中胱氨酸含量，單獨(dú)測定醬油中半胱氨酸的方法未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)在硼砂-氫氧化鈉緩沖溶液中，半胱氨酸可與酸性三苯甲烷類染料甲基藍(lán)(methyl blue，MB)發(fā)生加成反應(yīng)生成無色的硫醚衍生物，溶液褪色，吸光度降低。通過探索加成反應(yīng)的最佳條件，建立了加成反應(yīng)褪色分光光度法測定半胱氨酸含量，并成功應(yīng)用于醬油中微量半胱氨酸含量的測定，結(jié)果令人滿意。

1 試驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與設(shè)備

752N型紫外可見分光光度計(jì)、BS210S型分析天平、PHS-3C型精密酸度計(jì)。

1.2 材料與試劑

醬油：市售。

L-半胱氨酸對照品(批號：20190606，純度≥98.5%)：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：先將半胱氨酸配制成2.00 g/L的儲備液，放入冰箱中儲存，使用時(shí)用超純水稀釋100倍配制成20.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

甲基藍(lán)溶液：5.00×10-4mol/L。

硼砂-氫氧化鈉緩沖液：pH 9.3～10.1(0.05 mol/L硼砂溶液和0.20 mol/L氫氧化鈉溶液混合配制，用酸度計(jì)測定)。

試驗(yàn)用水為超純水。

1.3 試驗(yàn)方法

準(zhǔn)確加入適量濃度為20.0 mg/L的半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL比色管中，再依次加入濃度為 5.00×10-4mol/L的甲基藍(lán)溶液4.00 mL，pH 9.7的硼砂-氫氧化鈉緩沖溶液1.50 mL，用超純水定容，搖勻，得到測定溶液，同時(shí)配制空白溶液。移入1 cm比色皿中，以超純水作參比，在最大吸收波長592 nm處，采用即配即測法測定吸光度，并計(jì)算出吸光度差值ΔA=A空白-A測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 吸收光譜

按照“1.3”試驗(yàn)方法，用分光光度計(jì)測定酸性三苯甲烷染料甲基藍(lán)與半胱氨酸反應(yīng)前后的吸光度并繪制吸收光譜，結(jié)果見圖1。

圖1 吸收光譜圖Fig.1 Absorption spectra

曲線1、曲線2分別為空白溶液、測定溶液的吸收光譜，體系的最大吸收波長和最大褪色波長相同，均位于592 nm處，因此選擇 592 nm為本體系的測定波長，產(chǎn)生褪色現(xiàn)象的原因是藍(lán)色染料甲基藍(lán)與半胱氨酸發(fā)生加成反應(yīng)，生成了無色硫醚衍生物，溶液由藍(lán)色慢慢變淺，體系的吸光度降低。

2.2 緩沖溶液及酸度的選擇

考察Tris-HCl、氫氧化鈉、硼砂-氫氧化鈉3種緩沖介質(zhì)對半胱氨酸-甲基藍(lán)體系吸光度的影響，發(fā)現(xiàn)甲基藍(lán)與半胱氨酸的加成反應(yīng)在硼砂-氫氧化鈉緩沖溶液中褪色程度(ΔA)更大，故選擇硼砂-氫氧化鈉溶液作為體系的緩沖介質(zhì)。

考察硼砂-氫氧化鈉緩沖溶液在pH 9.3～10.1區(qū)間范圍內(nèi)對體系褪色程度的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 緩沖溶液pH對體系ΔA的影響Fig.2 Effect of pH of buffer solution on ΔA of the system

pH為9.6～9.8時(shí)，體系的褪色程度最大，增加或減小pH，ΔA均有所減小，故選擇緩沖溶液最佳pH為9.7。繼續(xù)考察pH 9.7時(shí)緩沖溶液用量對體系褪色程度的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 緩沖溶液用量對體系ΔA的影響Fig.3 Effect of the amount of buffer solution on ΔA of the system

由圖3可知，緩沖溶液用量為1.00～2.00 mL時(shí)，ΔA達(dá)到最大值且相對平穩(wěn)，選擇1.50 mL為最佳用量。因此，體系選擇pH 9.7硼砂-氫氧化鈉緩沖溶液最佳用量為1.50 mL。

2.3 甲基藍(lán)溶液用量的選擇

按“1.3”試驗(yàn)方法，其他條件不變，僅改變濃度為5.00×10-4mol/L的甲基藍(lán)溶液的用量，考察其對體系褪色程度的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 染料用量對體系ΔA的影響

由圖4可知，甲基藍(lán)用量為4.00 mL時(shí)ΔA值最大，增加或者減少甲基藍(lán)用量ΔA均有所減小。因此，選擇甲基藍(lán)溶液的最佳用量為4.00 mL。

2.4 反應(yīng)時(shí)間的影響

在室溫下，選擇以上最佳條件，按照“1.3”試驗(yàn)方法研究反應(yīng)時(shí)間對吸光度的影響。結(jié)果表明，半胱氨酸與甲基藍(lán)的加成反應(yīng)迅速，且隨著時(shí)間增加，測定溶液、空白溶液的吸光度均減小，吸光度差值也在減小。故本試驗(yàn)選擇即配即測的方法，配完溶液立刻完成測定。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在以上最佳條件下，將不同體積(0.00，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.20 mL)濃度為20.0 mg/L的半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液與甲基藍(lán)反應(yīng)，于最大吸收波長592 nm處測定吸光度，計(jì)算出吸光度差值ΔA。

以半胱氨酸濃度C(mg/L)為橫坐標(biāo)，吸光度差值ΔA為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖，并進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見圖5。

圖5 工作曲線圖Fig.5 Working curve

半胱氨酸質(zhì)量濃度在0.20～2.40 mg/L范圍內(nèi)，與吸光度差值ΔA呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：ΔA=0.558 12C+0.004 16，相關(guān)系數(shù)r為0.999 5，摩爾吸光系數(shù)為6.752×104L/(mol·cm)。可見本體系的靈敏度較高，線性范圍較廣，同時(shí)適用于微量半胱氨酸含量的測定。

2.6 干擾試驗(yàn)

葛冬梅等[23]采用高效液相色譜-柱前衍生法對醬油中17種氨基酸的分析結(jié)果表明，天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸含量相對較多，考察這些氨基酸是否會(huì)對半胱氨酸-甲基藍(lán)體系的測定造成干擾。結(jié)果表明，對于10 mL溶液中20.0 μg的半胱氨酸，控制相對誤差不超過±5%，共存氨基酸組分的允許量分別是：谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、異亮氨酸100倍；亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、天冬氨酸50倍；脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸20倍，可見本方法的選擇性較好。

2.7 回收試驗(yàn)

按“1.3試驗(yàn)方法”對測定溶液和空白溶液的吸光度進(jìn)行測定(測定溶液中半胱氨酸濃度為2 mg/L)，重復(fù)測定10次，所得數(shù)據(jù)及分析處理結(jié)果見表1。

表1 回收試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of recovery tests

由表1可知，回收率在98.3%～102%之間，平均回收率為99.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.24%，可見本方法具有良好的精密度。

2.8 樣品分析

2.8.1 醬油

各取10 mL 兩種不同級別的市售醬油，分別用超純水定容至100 mL，得到醬油制備液A(一級醬油)、B(三級醬油)，備用。取2支10 mL比色管，編號為1#、2#。在1#中加入0.5 mL醬油制備液A，在2#中加入1.0 mL醬油制備液B，按“1.3”試驗(yàn)方法測定，各平行測定6次，同時(shí)進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。由回歸方程求出兩種級別醬油樣品中半胱氨酸的含量，結(jié)果見表2。

表2 醬油樣品中半胱氨酸的測定結(jié)果(n=6)Table 2 Determination results of cysteine in soy sauce samples (n=6)

由表2可知，一級醬油中半胱氨酸的含量為0.283 mg/mL，三級醬油中半胱氨酸的含量為0.151 mg/mL，可見不同級別的醬油中半胱氨酸含量不相同。加標(biāo)回收試驗(yàn)的平均回收率分別為100.4%(一級醬油)、98.08%(三級醬油)。

2.8.2 半胱氨酸護(hù)肝膠囊

隨機(jī)抽取市售的舒邦L-半胱氨酸護(hù)肝膠囊5粒(半胱氨酸標(biāo)示量為72 mg/粒)，將膠囊的內(nèi)容物取出，混合均勻后準(zhǔn)確稱取適量倒入250 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，過濾，棄去初濾液。用移液管準(zhǔn)確吸取1.00 mL續(xù)濾液(相當(dāng)于半胱氨酸20 μg)按照試驗(yàn)方法平行測定6次，測定結(jié)果及分析處理數(shù)據(jù)見表3。

表3 護(hù)肝膠囊中半胱氨酸的測定結(jié)果(n=6)Table 3 Determination results of cysteine in liver care capsules (n=6)

由表3可知，護(hù)肝膠囊中半胱氨酸含量測定結(jié)果與實(shí)際含量基本相同，方法可取。

綜上，所測得醬油和護(hù)肝膠囊樣品中半胱氨酸含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均小于3%，表明此方法準(zhǔn)確度高，測定結(jié)果符合實(shí)際分析工作的要求。

3 反應(yīng)機(jī)理

已有文獻(xiàn)報(bào)道在堿性環(huán)境中亞硫酸根與三苯甲烷類染料的加成反應(yīng)[24-25]，其本質(zhì)是因?yàn)閬喠蛩岣系牧蛟泳哂幸粚聦﹄娮?，才能與三苯甲烷類染料發(fā)生加成反應(yīng)。按照類比思維，半胱氨酸分子上的巰基硫原子具有兩對孤對電子，同樣可以與三苯甲烷類染料甲基藍(lán)發(fā)生加成反應(yīng)，生成無色硫醚衍生物三(4'-磺酸基苯基-4-氨基苯甲基)硫醚基氨基丙酸鈉，反應(yīng)機(jī)理見圖6。

圖6 半胱氨酸與甲基藍(lán)加成反應(yīng)機(jī)理圖Fig.6 Mechanism of addition reaction of cysteine and methyl blue

4 結(jié)論

本研究首次提出了半胱氨酸與酸性三苯甲烷染料甲基藍(lán)的加成反應(yīng)，并將此應(yīng)用到實(shí)際不同級別醬油樣品中半胱氨酸含量的測定，建立了加成反應(yīng)褪色分光光度法測定微量半胱氨酸的含量。該方法分析時(shí)間短、專屬性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡單，且不需大型儀器、價(jià)格低廉，節(jié)約了檢測成本，測定結(jié)果符合定量分析的要求。