黑皮雞樅菌多糖提取工藝及抗氧化活性研究

陳灼娟，周倩，楊志強(qiáng)

(1.福州大學(xué)至誠學(xué)院 食品與生物工程系，福州 350102；2.福建省食品藥品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福州 350011)

真菌多糖是從真菌中分離出來的由10個分子以上單糖通過糖苷鍵連接的高分子聚合物。真菌多糖具有抗氧化[1]、抗腫瘤[2]、提高免疫力[3]、調(diào)節(jié)血糖[4]、抗病毒[5]、抑菌[6]等生物活性。目前已有上百種真菌多糖被分離并研制成調(diào)味品、藥品或保健品。真菌多糖可以制成丸劑、湯劑、針劑、沖劑、片劑、膠囊、糖漿乃至飲品、速溶茶、酒飲料等產(chǎn)品。真菌多糖產(chǎn)品具有廣闊的開發(fā)前景。

黑皮雞樅菌是一種藥食兩用的珍貴食用菌，其多糖含量高于一般食用菌[7-9]，是一種良好的提取材料。食用菌多糖提取有水提法、酸堿浸提法、酶解法、超聲波法、超臨界流體萃取法、微波法等[10]。其中酶解法具有條件溫和、易控制、時間短、提取率高以及對多糖結(jié)構(gòu)損害較小等優(yōu)點(diǎn)[11]。采用纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶組成復(fù)合酶，去除纖維素、蛋白質(zhì)及果膠等成分，利于多糖溶出[12]，輔助超聲波技術(shù)，促進(jìn)物質(zhì)的擴(kuò)散和溶解，增強(qiáng)提取效果[13-14]。采用超聲波輔助復(fù)合酶提取黑皮雞樅菌多糖，優(yōu)化多糖提取工藝，并對提取物的抗氧化活性進(jìn)行測定，可以為黑皮雞樅菌多糖產(chǎn)品的開發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

黑皮雞樅菌干品：產(chǎn)于云南。

1.2 試劑

硫酸、苯酚、無水乙醇、七水合硫酸亞鐵、氫氧化鈉、過氧化氫：均為分析純，西隴科學(xué)股份有限公司；抗壞血酸(分析純)：天津市北辰區(qū)方正試劑廠；水楊酸(分析純)：天津博迪化工股份有限公司；DPPH(分析純)：上海麥克林化工有限公司；纖維素酶(10 U/mg)：生物純，羅恩試劑；果膠酶(500 U/mg)、木瓜蛋白酶(800 U/mg)：均為生物純，上海源葉生物科技有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

UV-5200紫外分光光度儀 上海元析儀器有限公司；3K15臺式冷凍離心機(jī) 德國西格瑪公司；DK-S26恒溫水浴鍋 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；FE28 Standard酸度計(jì) 美國梅特勒-托利多儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；KQ5200DE臺式超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 多糖提取的工藝流程

將黑皮雞樅菌子實(shí)體干燥至恒重，用粉碎機(jī)粉碎后過40目篩備用。精確稱取1.00 g黑皮雞樅菌子實(shí)體粉末置于三角瓶中，加入30 mL超純水?dāng)嚢杈鶆?，?0 ℃水浴中浸脹1 h，溫度迅速降至室溫，制成黑皮雞樅菌粉溶液。稱取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的復(fù)合酶，加入黑皮雞樅菌粉溶液，在50 ℃、pH 5.5的條件下，酶解120 min。酶解結(jié)束后，將酶解液pH調(diào)節(jié)至7，迅速升溫至90 ℃滅酶10 min。將上述酶解液置于超聲波儀中，在60 W、50 ℃條件下，超聲處理20 min。酶解液離心取上清液，加入4倍體積無水乙醇沉淀靜置過夜，在5 000 r/min條件下，離心10 min，取沉淀，沉淀用無水乙醇洗滌2次，干燥后得黑皮雞樅菌粗多糖。

1.4.2 多糖提取率的計(jì)算

黑皮雞樅菌粗多糖用蒸餾水溶解，利用苯酚硫酸法測定多糖含量[15]，計(jì)算多糖的提取率。以葡萄糖含量Y(μg)為縱坐標(biāo)，吸光值A(chǔ)為橫坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程Y=123.19A，相關(guān)系數(shù)R2=0.998。取2.0 mL黑皮雞樅菌多糖溶液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，用相同方法顯色測吸光值A(chǔ)，代入方程計(jì)算多糖含量，求出多糖提取率。

1.4.3 多糖提取單因素試驗(yàn)

按照“1.4.1”提取黑皮雞樅菌多糖。固定其他因素，分別以酶的比例(纖維素酶∶果膠酶∶木瓜蛋白酶為1∶4∶5、3∶2∶5、4∶2∶4、4∶3∶3、8∶1∶1)、酶的添加量(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%)、液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1)、pH(4.5，5.5，6.5，7.5，8.5)、酶解溫度(30，40，50，60，70 ℃)和酶解時間(30，60，90，120，150 min)為單因素，考察這些因素對黑皮雞樅菌多糖提取率的影響，試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果取平均值。

1.4.4 多糖提取響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇液料比、酶解溫度和酶解時間3個因素，采用Design-Expert 8.0.5 軟件設(shè)計(jì)三因素三水平的BBD試驗(yàn)[16]，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1，以多糖提取率為指標(biāo)，確定最優(yōu)的提取條件，在實(shí)際條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken test design

1.4.5 黑皮雞樅菌多糖的抗氧化活性分析

1.4.5.1 DPPH自由基清除能力測定[17]

配制0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mg/mL的黑皮雞樅菌多糖溶液與0.02 mmol/L DPPH-乙醇溶液。2.0 mL不同濃度的多糖溶液分別與2.0 mL DPPH-乙醇溶液充分混合后，避光反應(yīng)30 min，測定517 nm處的吸光值A(chǔ)1。用相同體積無水乙醇替代DPPH-乙醇溶液，測定吸光值A(chǔ)2。用相同體積超純水替代多糖溶液，測定吸光值A(chǔ)0。DPPH自由基清除率按照公式(1)計(jì)算。同時以相同方法測定不同濃度的抗壞血酸(VC)的自由基清除率，作為陽性對照。試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值作為最終的試驗(yàn)結(jié)果。

(1)

1.4.5.2 羥自由基清除能力測定[18]

配制0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mg/mL的黑皮雞樅菌多糖溶液、9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L乙醇-水楊酸溶液、8.8 mmol/L H2O2溶液。準(zhǔn)確量取FeSO4溶液、乙醇-水楊酸溶液、多糖溶液各1.0 mL，混合均勻后，加入1.0 mL H2O2溶液，在37 ℃水浴中反應(yīng)15 min，測定510 nm處的吸光值A(chǔ)1。用蒸餾水代替H2O2，測吸光值A(chǔ)2。用蒸餾水代替多糖溶液，測吸光值A(chǔ)0。同時以相同方法測定不同濃度的抗壞血酸(VC)的自由基清除率，作為陽性對照。試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值作為最終的試驗(yàn)結(jié)果。

(2)

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖提取試驗(yàn)優(yōu)化

2.1.1 多糖提取單因素試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1.1.1 復(fù)合酶比例對多糖提取率的影響

纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶按一定質(zhì)量比(1∶4∶5、3∶2∶5、4∶2∶4、4∶3∶3、8∶1∶1)加入黑皮雞樅菌粉溶液，按照“1.4.1”的方法進(jìn)行酶解，研究不同復(fù)合酶比例對多糖提取率的影響。由圖1可知，不同復(fù)合酶比例下提取效果差異較大。子實(shí)體多糖存在于細(xì)胞壁內(nèi)，復(fù)合酶能使與多糖結(jié)合的纖維素、果膠、蛋白質(zhì)等不同程度分離溶出。增加纖維素酶的比例，可使多糖提取率顯著增加，當(dāng)纖維素在復(fù)合酶中的比例為40%時，提取率較高，再增加纖維素酶的比例至80%，提取率大大降低。當(dāng)纖維素酶占比為40%時，果膠酶∶木瓜蛋白酶為1∶1時，多糖提取率最高。綜合試驗(yàn)結(jié)果，選擇纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶的比例為4∶3∶3進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 復(fù)合酶比例對多糖提取率的影響Fig.1 Effect of complex enzyme ratio on the extraction rate of polysaccharides

2.1.1.2 液料比對多糖提取率的影響

不同液料比條件下多糖提取率見圖2，經(jīng)單因素方差分析，得到液料比對多糖提取率有極顯著影響(P<0.001)。液料比由10∶1梯度增加到40∶1時，多糖提取率從5.33%逐步增加到13.29%，繼續(xù)升高液料比至50∶1，多糖提取率下降。增加液料比，可以促進(jìn)多糖的溶出，提高提取率[19]。但液料比過高，底物濃度下降，酶解效果降低，同時溶液過稀，稀釋了超聲波對物料的空化作用，導(dǎo)致多糖提取率下降[20]，液體使用量過多，也會增加后期純化成本[21]。因此，選擇液料比30∶1、40∶1、50∶1進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化分析。

圖2 液料比對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the extraction rate of polysaccharides

2.1.1.3 復(fù)合酶添加量對多糖提取率的影響

由圖3可知，復(fù)合酶添加量從1.0%增加到2.5%時，多糖提取率從11.26%增加到16.71%，這是因?yàn)殡S著復(fù)合酶的增多，食用菌細(xì)胞壁發(fā)生了降解，有利于多糖溶出[22]。酶添加量繼續(xù)增加至3.0%時，多糖提取率略有升高，但增幅不明顯。酶的使用量在一定程度上決定了酶解時間和提取率，加入的酶太少，底物無法充分酶解。當(dāng)酶量充足時，增加酶量對提取率的影響不大，綜合試驗(yàn)成本考慮，選擇3.0%的復(fù)合酶添加量，酶添加量因素不進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面優(yōu)化分析。

圖3 復(fù)合酶添加量對多糖提取率的影響Fig.3 Effect of complex enzyme addition amount on the extraction rate of polysaccharides

2.1.1.4 酶解溫度對多糖提取率的影響

由圖4可知，酶解溫度由30 ℃上升到60 ℃時，多糖提取率從9.79%增加至15.16%，達(dá)到最大值。隨后酶解溫度繼續(xù)提高，多糖提取率出現(xiàn)下降趨勢。酶解溫度是復(fù)合酶提取法中較為重要的一個因素，在一定的適宜溫度內(nèi)，酶解溫度既能影響酶的活力，也會影響物質(zhì)的溶解度[23]，溫度太高可能導(dǎo)致酶活力下降[24]，同時破壞多糖原有的活性和結(jié)構(gòu)，而使酶解效率和酶解速率降低[25]。經(jīng)單因素方差分析，得到酶解溫度對多糖提取率有極顯著影響(P<0.001)。因此，選擇50，60，70 ℃進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面優(yōu)化分析。

圖4 酶解溫度對多糖提取率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on the extraction rate of polysaccharides

2.1.1.5 酶解pH對多糖提取率的影響

由圖5可知，不同酶解pH下的多糖提取率在13.58%～14.58%范圍內(nèi)，變化不大。酶解pH是酶解反應(yīng)中重要的影響因素之一，不同的酶最適pH有所不同，pH過高或者過低都會影響酶的活性，同時影響多糖的溶出效應(yīng)[26]。本研究試驗(yàn)結(jié)果顯示，pH對酶解提取率的影響不大，可能是由于復(fù)合酶中的纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶的最適pH不同，在不同pH條件下此消彼長。經(jīng)單因素方差分析，得到酶解pH對多糖提取率的影響不顯著(P>0.05)。綜合提取率和試驗(yàn)成本考慮，選擇pH 7.5作為酶解條件，pH因素不進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面優(yōu)化分析。

圖5 酶解pH對多糖提取率的影響Fig.5 Effect of enzymolysis pH on the extraction rate of polysaccharides

2.1.1.6 酶解時間對多糖提取率的影響

由圖6可知，酶解時間從30 min增加到90 min，多糖提取率緩慢升高到最大值16.22%，繼續(xù)延長酶解時間至150 min，多糖提取率下降。經(jīng)單因素方差分析，得到酶解時間對多糖提取率有極顯著的影響(P<0.001)。酶解時間過短，導(dǎo)致酶解反應(yīng)不夠充分，使得多糖不能有效浸提，而時間過長又會因?yàn)槎嗵强赡芩?，?dǎo)致提取率下降[27]。綜合考慮，選擇酶解時間60，90，120 min進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面優(yōu)化分析。

圖6 酶解時間對多糖提取率的影響Fig.6 Effect of enzymolysis time on the extraction rate of polysaccharides

2.1.2 響應(yīng)面分析及優(yōu)化

響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

續(xù) 表

利用Design-Expert 8.0.5對表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)擬合回歸分析，得到黑皮雞樅菌多糖提取率Y(%)對液料比A(mL/g)、酶解溫度B(℃)、酶解時間C(min)的二次項(xiàng)多元回歸方程：Y(%)=-88.54+1.51A+2.19B+0.34C-9.75×10-4AB-2.02×10-3AC+1.26×10-3BC-1.49×10-2A2-2.14×10-2B2-2.11×10-3C2。

由表3方差分析結(jié)果可知，該模型的P<0.01，說明模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，校正模型R2=0.945 4，RAdj2=0.875 3，說明模型與實(shí)際結(jié)果擬合較好。液料比(A)、酶解溫度(B)、酶解時間(C)對多糖提取率的影響極顯著。由F值可知，3個因素對多糖提取率影響的主次順序?yàn)闇囟?B)>液料比(A)>酶解時間(C)。表3中交互項(xiàng)AB、BC及AC的P值均大于0.05，圖7中兩因素交互作用的響應(yīng)面底部等高線接近圓形，說明這3個因素的交互作用不顯著。

表3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model of Box-Behnken design

圖7 因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface diagrams of interactive effects of factors

2.1.3 提取參數(shù)及驗(yàn)證試驗(yàn)

采用Design-Expert 8.0.5軟件分析，得到黑皮雞樅菌多糖提取的最佳工藝條件為液料比47.50∶1(mL/g)、酶解溫度54.24 ℃、酶解時間73.51 min，在該條件下預(yù)測提取率為19.14%。根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整最佳提取工藝為液料比47∶1(mL/g)、酶解溫度54 ℃、酶解時間73 min，在此條件下進(jìn)行3次重復(fù)性驗(yàn)證試驗(yàn)，得到多糖提取率3次平均值為18.75%，相對誤差為2.08%，實(shí)測值與預(yù)測值擬合度較好。

2.2 黑皮雞樅菌多糖的抗氧化活性分析

2.2.1 DPPH自由基清除能力

以相同濃度的VC溶液為陽性對照，黑皮雞樅菌多糖的DPPH自由基清除能力測定結(jié)果見圖8。

圖8 黑皮雞樅菌多糖的DPPH自由基清除能力Fig.8 DPPH free radical scavenging ability of Oudemansiella raphanipies polysaccharides

由圖8可知，黑皮雞樅菌多糖樣品溶液濃度在0.5～4.0 mg/mL范圍內(nèi)，DPPH自由基清除率隨多糖樣品溶液濃度的增加而升高。當(dāng)黑皮雞樅菌多糖溶液濃度為4.0 mg/mL時，黑皮雞樅菌多糖自由基清除率為93.44%，表現(xiàn)出較強(qiáng)的自由基清除能力。

2.2.2 水楊酸法測羥基自由基清除率

以相同濃度的VC為陽性對照，黑皮雞樅菌多糖的體外羥基自由基清除率測定結(jié)果見圖9。

圖9 黑皮雞樅菌多糖的羥基自由基清除能力Fig.9 Hydroxyl free radical scavenging ability of Oudemansiella raphanipies polysaccharides

由圖9可知，當(dāng)黑皮雞樅菌多糖樣品溶液濃度由0.5 mg/mL增加至4.0 mg/mL時，多糖的清除率緩慢上升，具有較好的線性關(guān)系。當(dāng)多糖濃度為4.0 mg/mL時，羥基自由基清除率為47.58%，與相同濃度的VC相比清除能力稍差。

3 結(jié)果與討論

單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面試驗(yàn)得到黑皮雞樅菌多糖的最佳提取條件為纖維素酶∶木瓜蛋白酶∶果膠酶4∶3∶3、復(fù)合酶添加量3.0 %、液料比47∶1(mL/g)、酶解溫度54 ℃、酶解時間73 min、酶解pH 7.5，在該條件下，多糖的提取率達(dá)到18.75%，優(yōu)于常見的水提法、醇提法。測定黑皮雞樅菌多糖的DPPH自由基清除率及羥基自由基清除率，結(jié)果表明4.0 mg/mL 的黑皮雞樅菌多糖對DPPH自由基清除率為93.44%，對羥基自由基清除率為47.58%，且自由基清除能力與濃度呈明顯的效應(yīng)關(guān)系，說明超聲波輔助復(fù)合酶提取法能夠保留黑皮雞樅菌多糖的抗氧化活性。該方法提取的黑皮雞樅菌多糖可以作為天然抗氧化劑，應(yīng)用于食品、藥物、保健品等領(lǐng)域。真菌多糖具有毒副作用小、藥理作用多樣等特點(diǎn)[28]，特別是在抗氧化方面，后期可以對其體內(nèi)抗氧化活性進(jìn)行研究，為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。該方法提取的黑皮雞樅菌多糖是否具有抗炎、抗癌、抗病毒、抗菌等生物學(xué)活性有待進(jìn)一步研究。

真菌多糖最常見的提取方法為水提法，其原理是利用多糖易溶于水的特性進(jìn)行提取，方法操作簡單，但是耗時長且提取率不高，若在較高溫度下反復(fù)操作，會降低多糖結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[29]。本研究利用纖維酶、果膠酶及蛋白酶共同作用于黑皮雞樅菌子實(shí)體細(xì)胞壁，減少傳質(zhì)阻力，操作簡單，條件溫和，不破壞多糖結(jié)構(gòu)，輔助超聲波提取技術(shù)，利用超聲波的空化作用、機(jī)械振動、乳化效應(yīng)等，加速多糖溶出，使多糖提取率高于常見的提取方法，該方法對今后的試驗(yàn)研究具有一定的借鑒作用。