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    低溫等離子體處理對L-精氨酸-D-核糖的美拉德產(chǎn)物抗氧化活性的影響

    2023-03-20 08:55:28章銀良郭浩彬黃天琪趙宇張麗程夢夢黃圓圓
    中國調(diào)味品 2023年3期
    關(guān)鍵詞:超氧處理量去離子水

    章銀良,郭浩彬,黃天琪,趙宇,張麗,程夢夢,黃圓圓

    (鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,鄭州 450001)

    等離子體可分為高溫等離子體和低溫等離子體,是繼固態(tài)、液態(tài)、氣態(tài)之后物質(zhì)的第四態(tài)[1],其中低溫等離子體常用于食品的殺菌[2]、保鮮[3]、改性[4]中。大量研究表明低溫等離子體技術(shù)相比于其他物理輔助技術(shù),具有能極大地保持食品原有的感官、營養(yǎng)等性質(zhì),且不會產(chǎn)生副毒作用[5]。研究表明,低溫等離子體處理會改變食品的抗氧化活性,Bao等[6]研究表明低溫等離子體預(yù)處理可以有效地抑制棗切片中抗氧化劑的降解。于弘慧等[7]對比低溫等離子體殺菌與巴氏殺菌的理化性質(zhì)表明,低溫等離子體殺菌處理梨汁的多酚和維生素C含量分別比巴氏殺菌處理的高26.5%和20.6%,較好地保持了梨汁的色澤,對DPPH自由基和羥基自由基的清除能力大大提高。劉振蓉等[8]使用低溫等離子體處理獼猴桃濁汁時發(fā)現(xiàn),低溫等離子體處理使得獼猴桃濁汁中丙二醛含量提高,而VC含量、總酚含量、葉綠素含量顯著降低,VC、總酚等減少會降低獼猴桃濁汁的抗氧化活性。

    美拉德反應(yīng)(Maillard reaction,MR)是指羰基化合物和氨基化合物在一定反應(yīng)條件下發(fā)生的化學(xué)變化,這類化學(xué)反應(yīng)會生成棕黑色聚合物——美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(Maillard reaction products,MRPs)[9]。食品加工過程中合理利用美拉德反應(yīng)能極大地提高食品的風(fēng)味、貨架期等[10-11]。在食品的熱加工過程中,美拉德反應(yīng)時常發(fā)生。在前期的研究過程中,我們已經(jīng)得知MRPs對不同種類的自由基均具有較好的清除作用[12-13]。等離子體處理在放電時產(chǎn)生大量的正、負(fù)帶電粒子、電子和中性粒子,以及大量自由基[14],而等離子體滅菌是食品加工的最后一個階段,因此探討等離子體處理對MRPs抗氧化活性的研究有利于深入了解低溫等離子體處理對食品加工過程中抗氧化活性的影響,同時也為豐富天然抗氧化劑的檢測指標(biāo)以及深入研究MRPs提供了參考依據(jù)。

    1 材料、設(shè)備與方法

    1.1 試劑與材料

    D-核糖(AR)、L-精氨酸(AR):北京索萊寶科技有限公司;氫氧化鈉(AR)、無水乙醇(AR):天津市永大化學(xué)試劑有限公司;鹽酸(AR):煙臺市雙雙化工有限公司;1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH,AR)、5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(DMPO,AR)、2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(TEMPO):上海麥克林生化科技有限公司;去離子水:實驗室自制。

    1.2 儀器與設(shè)備

    SQP電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;E-scan電子順磁共振波譜儀 德國布魯克科技(北京)有限公司;FE20 pH計 瑞士梅特勒-托利多公司;HH-1智能型數(shù)顯恒溫油浴槽 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;HH-S水浴鍋 鞏義市英峪予華儀器廠;Tecan Spark 20M多功能微孔板讀數(shù)儀 瑞士Tecan公司;CTP-2000K等離子體實驗裝置 南京蘇曼電子有限公司。

    2 實驗方法

    2.1 MRPs的制備

    稱取12.5 g精氨酸和12.5 g核糖置于燒杯中,溶解于450 mL去離子水中,用移液槍吸取HCl(4 mol/L)和NaOH(6 mol/L)調(diào)整pH為12.0,然后用去離子水定容至50 mL,混合均勻,置于160 ℃恒溫油浴槽中反應(yīng)200 min,每組反應(yīng)平行3次。反應(yīng)結(jié)束后快速置于冰水中冷卻并進(jìn)行相關(guān)測定,剩余樣品置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.2 低溫等離子體處理

    時間組:取1 mL的MRPs溶液,均勻涂在處理皿內(nèi),置于放電處。調(diào)節(jié)電壓為25 V,分別處理1,2,3,4,5 min。吸取處理后的溶液至15 mL帶蓋棕色離心管中備用。

    電壓組:取1 mL的MRPs溶液,均勻涂在處理皿內(nèi),置于放電處。設(shè)置電壓分別為10,15,20,25,30 V,處理2 min。吸取處理后的溶液至15 mL帶蓋棕色離心管中備用。

    處理量組:分別取0.5,1,1.5,2,2.5 mL的MRPs溶液,均勻涂在處理皿內(nèi),置于放電處。設(shè)置電壓為25 V,處理2 min。吸取處理后的溶液至15 mL帶蓋棕色離心管中備用。

    2.3 DPPH自由基清除率的測定

    參考Daravath等[15]、章銀良等[16]的方法,并稍作修改。取0.1 mL MRPs于具塞刻度管中,加入4.9 mL去離子水,電壓組和時間組配制成50倍稀釋液,處理量組配制成100倍稀釋液,振蕩搖勻。再取500 μL MRPs(去離子水溶液作為空白對照組)與2 mL 0.5 mmol/L DPPH于棕色具塞試管中振蕩混合均勻。暗反應(yīng)20 min后,立即放入電子順磁波譜儀的諧振腔中開始測量。將掃描波譜圖傳入布魯克自帶軟件WinEPR-Processing中,對DPPH自由基ESR譜圖進(jìn)行二重積分,積分區(qū)域為(3 450±0.01) G~(3 525±0.01) G,將測量的二重積分值記為As。在相同操作條件下空白組記為Ac。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對DPPH自由基的清除能力可由下式計算得出:

    ESR測定條件:頻率9.792 069 GHz,功率5.00 mW,中心磁場3 487 G,掃描寬度100 G,調(diào)制幅度2.27 G,調(diào)制頻率86.00 kHz,時間常數(shù)40.96,掃描時間83.88 s(20.97 s×4次),橫坐標(biāo)點(diǎn)數(shù)512,接收機(jī)增益3.17×103。

    2.4 均勻?qū)嶒炓蛩厮皆O(shè)計

    以DPPH自由基(DPPH·)清除率為檢測指標(biāo),采用U5(53)均勻?qū)嶒灡?,因素水平見?。

    表1 U5(53)均勻?qū)嶒炓蛩厮奖鞹able 1 Factors and levels of U5(53) uniform experiment

    2.5 等離子體處理對MRPs褐變指數(shù)的影響測定

    吸取1 mL未處理的MRPs和不同強(qiáng)度處理后的MRPs,稀釋50倍并混勻,添加量組稀釋100倍,用多功能孔板讀數(shù)儀測量空板OD值,記為S2,吸取100 μL MRPs置于孔板內(nèi),在420 nm的波長處測量MRPs的吸光度值,記為S1。S1-S2為MRPs在420 nm處的實際吸光度值。

    2.6 超氧陰離子測定

    吸取0.5 mL去離子水,加入250 μL 0.25 mmol/L TEMPO,混勻后均勻涂抹在等離子體處理皿內(nèi),設(shè)置電壓為20 V,處理30 s。對照組:調(diào)節(jié)電壓為20 V,處理15 s;調(diào)節(jié)電壓為15 V,處理30 s,吸取2 mL去離子水,加入250 μL 0.25 mmol/L TEMPO,調(diào)節(jié)電壓為20 V,處理30 s,吸取100,500 μL MRPs于0.5 mL去離子水中,加入250 μL 0.25 mmol/L TEMPO,調(diào)節(jié)電壓為20 V,處理30 s。以此探究處理時間、處理量、處理電壓、MRPs對超氧陰離子自由基的影響。處理完后吸取樣品至毛細(xì)管中,放入核磁腔中進(jìn)行ESR譜圖測定。

    ESR測定條件:頻率9.793 810 GHz,中心磁場3 487 G,調(diào)制幅度2.02 G,時間常數(shù)20.48,掃描時間10.49 s,掃描間隔時間19.51 s,接收機(jī)增益1.42×103。

    2.7 羥基自由基的測定

    吸取0.5 mL去離子水,加入250 μL DMPO,混勻后均勻涂抹在等離子體處理皿內(nèi),設(shè)置電壓為20 V,處理30 s。對照組:調(diào)節(jié)電壓為20 V,處理1 min;調(diào)節(jié)電壓為25 V,處理30 s,吸取2 mL去離子水,加入20 μL DMPO調(diào)節(jié)電壓為20 V,處理30 s,吸取MRPs 0.5 mL,加入20 μL DMPO,調(diào)節(jié)電壓為20 V,處理30 s。以此探究處理時間、處理量、處理電壓對羥基自由基的影響。處理完后吸取樣品至毛細(xì)管中,放入核磁腔中進(jìn)行ESR譜圖測定。

    測量參數(shù):頻率9.790 245 GHz,調(diào)制幅度1.01 G,時間常數(shù)20.48,掃描時間10.49 s,掃描間隔時間19.51 s,接收機(jī)增益1.00×103,中心磁場3 487 G,功率5.00 mW,掃描寬度100 G,調(diào)制頻率86.00 kHz,橫坐標(biāo)點(diǎn)數(shù)512。

    2.8 統(tǒng)計分析

    所有的實驗均做3次平行,采用WinEPR-Processing、Simfonia、Origin 8.0、Mathematics 4.0及其相關(guān)方法進(jìn)行處理,并用SPSS軟件進(jìn)行顯著性分析(P<0.05表示差異顯著)。

    3 結(jié)果與分析

    3.1 等離子體處理對MRPs抗氧化活性的影響

    不同處理強(qiáng)度對MRPs抗氧化活性的影響曲線見圖1(不同處理時間)、圖2(不同處理電壓)、圖3(不同處理量)。

    圖1 不同處理時間對MRPs抗氧化活性的影響曲線圖Fig.1 Effect of different treatment time on antioxidant activity of MRPs

    圖2 不同處理電壓對MRPs抗氧化活性的影響曲線圖Fig.2 Effect of different treatment voltages on antioxidant activity of MRPs

    圖3 不同處理量對MRPs抗氧化活性的影響曲線圖Fig.3 Effect of different treatment capacity on antioxidant activity of MRPs

    由圖1可知,在功率恒定時,MRPs的抗氧化活性隨著等離子體處理時間的延長而降低,在前3 min,等離子體處理的MRPs的抗氧化活性削弱較慢,在3~5 min時,MRPs對DPPH·的清除率迅速降低。由圖2可知,隨著電壓的升高,MRPs對DPPH·的清除能力呈現(xiàn)出降低的趨勢,等離子體放電過程中能夠損耗MRPs末期產(chǎn)物,造成MRPs的抗氧化活性降低,在5~15 V內(nèi)由于放電效果不明顯,因此造成MRPs抗氧化活性物質(zhì)的損耗較少,但是隨著電壓的增大,放電強(qiáng)度不斷增大,因此造成MRPs對DPPH·的清除能力不斷降低。由圖3可知,在處理電壓(V)和處理時間(min)一定時,MRPs的抗氧化活性受到等離子體處理量的影響,較大的處理量不僅縮短了兩極板的放電距離,同時較其他實驗組而言,其抗氧化活性物質(zhì)總量也高于其余組,因此低溫等離子體對MRPs抗氧化活性的影響隨著MRPs處理量的增大而減小。

    3.2 均勻?qū)嶒灲Y(jié)果

    為了進(jìn)一步探討低溫等離子體處理電壓、處理時間以及MRPs處理量對MRPs抗氧化活性的相互影響,設(shè)計均勻?qū)嶒?,均勻?qū)嶒灲Y(jié)果見表2。

    表2 均勻?qū)嶒灲Y(jié)果Table 2 Results of uniform experiment

    以DPPH·清除率為指標(biāo),均勻?qū)嶒灲Y(jié)果采用Mathematics 4.0軟件分析,結(jié)果如下:

    In[1]:=<

    In[2]:=data={{0.5,60,30,53.64},{1,120,25,50.91},{1.5,30,20,63.44},{2,90,15,70.34},{2.5,150,35,61.38}};

    In[16]:=(regress=Regress[data,{1,x1*x2,x2^2,x3^2},{x1,x2,x3}];

    Chop[regress,10^(-6)])。

    EstimateSET-statPValue164.06240.413637154.8760.00411046X1X20.1083480.0034513431.3930.0202722X22-0.001384110.0000605116-22.87350.0278145X32-0.009881260.000686431-14.39510.0441538

    R Squared → 0.999 255,Adjusted R Squared → 0.997 019,

    Estimated Variance → 0.181 613 2,

    ANOVA Table →

    DFSumofsqMeansqFRatioPValueModel3243.53381.1776446.9360.0347545Error10.1816320.181632Total4243.714

    均勻?qū)嶒灢捎肕athmatics 4.0軟件分析:

    以DPPH自由基清除率為考察指標(biāo)Y,以處理量(X1)、處理時間(X2)、處理電壓(X3)為影響因素進(jìn)行回歸分析,得到回歸方程:

    Y=64.06+0.108 3X1X2-0.001 4X22-0.0099X32。

    由回歸分析的顯著性分析可知,處理時間(X2) 、處理電壓(X3)對DPPH自由基的清除率具有顯著的影響,P值分別為0.027 8和0.044 1;處理量(X1)與處理時間(X2)具有顯著的交互作用,對DPPH自由基清除率具有顯著的影響,P值為0.020 2。

    由回歸方程求極值,結(jié)合研究實際得到最優(yōu)水平:處理量(X1)為2.5 mL,處理時間(X2)為12 s,處理電壓(X3)為15 V,在此條件下,DPPH自由基清除率為65.06%,高于實驗中的最大值63.44%,實際清除率為62.38%,理論清除率與實際清除率相差2.68%,綜合優(yōu)化實驗結(jié)果可靠。

    3.3 低溫等離子體處理對MRPs褐變程度的影響

    MRPs褐變程度隨處理強(qiáng)度的變化見圖4(不同處理時間)、圖5(不同處理電壓)、圖6(不同處理量)。

    圖4 MRPs在420 nm處的吸光度值隨處理時間的變化曲線圖Fig.4 Changes of absorbance values of MRPs at 420 nm with treatment time

    圖5 MRPs在420 nm處的吸光度值隨處理電壓的變化曲線圖Fig.5 Changes of absorbance values of MRPs at 420 nm with treatment voltages

    圖6 MRPs在420 nm處的吸光度值隨處理量的變化曲線圖Fig.6 Changes of absorbance values of MRPs at 420 nm with treatment capacity

    MRPs在420 nm波長處的吸光度值常常用來表示MRPs末期產(chǎn)物的生成情況[17]。由圖4和圖5可知,隨著放電時間的延長以及電壓的升高,MRPs在420 nm處的吸光度值不斷降低,即美拉德反應(yīng)的末期產(chǎn)物不斷減少。由圖6可知,隨著處理量的增大,MRPs的OD值隨之增大,這可能與處理量的加大縮短了等離子體兩極板的距離以及本身抗氧化活性物質(zhì)高于其他組有關(guān)。綜上,由等離子處理對MRPs抗氧化活性的影響結(jié)果和OD值的變化情況可知,等離子體處理造成MRPs抗氧化活性降低的原因其實是等離子體處理MRPs后MRPs末期產(chǎn)物減少,而造成MRPs末期產(chǎn)物減少的原因可能是DPPH·的等離子放電過程中會產(chǎn)生各種自由基例如超氧陰離子、羥基自由基等[18],這些自由基都會對MRPs的抗氧化活性造成影響。在前期的研究中我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MRPs對各類自由基均具有很好的清除作用,且清除能力與氨基酸的種類密切相關(guān)。因此,放電產(chǎn)生的自由基極可能是造成MRPs不斷減少的原因之一。

    3.4 自由基測定結(jié)果

    為了進(jìn)一步探究低溫等離子體處理對美拉德反應(yīng)末期產(chǎn)物降低的原因,采用電子順磁共振波譜儀,測量不同放電強(qiáng)度下超氧陰離子自由基和羥基自由基的生成情況;超氧陰離子自由基測定結(jié)果。

    不同捕獲劑捕獲的超氧陰離子自由基見圖7。

    圖7 不同捕獲劑捕獲的超氧陰離子自由基的ESR譜圖Fig.7 ESR spectra of superoxide anion radicals captured by different capturing agents

    由圖7可知,同一自由基的峰數(shù)、出峰位置、峰強(qiáng)度與捕獲劑的選取有關(guān)[19]。

    由圖8可知,超氧陰離子自由基的生成情況與等離子處理強(qiáng)度有關(guān),在實驗范圍內(nèi),適當(dāng)提高電壓和處理時間能夠提高超氧陰離子自由基的生成量,而加大處理量反而使得超氧陰離子自由基的生成量降低,這一結(jié)果與前文論述的MRPs抗氧化活性和末期產(chǎn)物生成量與等離子處理強(qiáng)度的影響變化相對應(yīng)。添加MRPs后超氧陰離子自由基的含量降低,證明MRPs對超氧陰離子自由基具有一定的猝滅作用,且猝滅效果與其MRPs的含量呈正相關(guān)。

    圖8 不同處理對超氧陰離子自由基含量的影響Fig.8 Effects of different treatments on the content of superoxide anion radicals

    羥基自由基測定結(jié)果見圖9。

    圖9 不同處理強(qiáng)度下羥基自由基ESR譜圖(A)及其擬合圖(B)Fig.9 Hydroxyl radical ESR spectra (A) and its fitting diagram (B) under different treatment intensity

    由圖9中B可知,去離子水經(jīng)過等離子體處理后,DMPO捕獲到的圖為DMPO-X圖譜,通過疊加羥基自由基和DMPO譜圖,發(fā)現(xiàn)其未知信號可能來源于羥基自由基,其疊加圖和ESR譜圖的峰數(shù)量和峰間距保持一致,產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能是等離子體放電過程不僅能產(chǎn)生自由基,可能同時會生成例如臭氧等小分子具有氧化性質(zhì)的物質(zhì),將DMPO氧化。而羥基自由基生成量和等離子體處理強(qiáng)度的關(guān)系并不明確,這可能是由于等離子體處理使得處理液的pH改變[20],以及產(chǎn)生具有抗氧化活性的物質(zhì)[21],從而使DMPO的捕獲能力降低,導(dǎo)致有些實驗組未捕獲到羥基自由基。

    4 結(jié)論

    由均勻?qū)嶒灲Y(jié)果可知,處理時間、處理電壓對DPPH自由基的清除率具有顯著的影響,處理量與處理時間具有顯著的交互作用,對DPPH自由基的清除率具有顯著的影響。由單因素實驗結(jié)果可知,MRPs對DPPH自由基的清除效果受到等離子體處理的影響,升高電壓或延長處理時間能夠減弱MRPs的抗氧化活性,增大處理量會減少這一影響,這一結(jié)果和MRPs末期產(chǎn)物變化關(guān)系一致,因此低溫等離子體處理MRPs會使MRPs末期產(chǎn)物降低,從而影響MRPs的抗氧化活性能力。通過檢測等離子體處理產(chǎn)生的自由基種類和變化可知,超氧陰離子自由基的變化受等離子體處理的強(qiáng)度(電壓、時間、處理量)的影響,且MRPs能夠抑制超氧陰離子自由基的含量,而羥基自由基呈現(xiàn)不規(guī)律的變化,這極可能是低溫等離子體處理過程中使得DMPO氧化開環(huán)導(dǎo)致捕獲效果變?nèi)?。綜上可知,等離子體在放電過程中會產(chǎn)生大量的不同種類的自由基,這極可能是經(jīng)過等離子體處理后造成MRPs抗氧化活性降低的原因之一。

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