黃精總皂苷的提取和含量測定方法研究*

戴萬生，畢露露，邱 斌，賀 森，顧 雯

(云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500)

2020版《中國藥典》收載黃精的來源為百合科植物滇黃精PolygonatumkingianumColl.et Hemsl.、黃精PolygonatumsibiricumRed.或多花黃精PolygonatumcyrtonemaHua.的干燥根莖。主要含有多糖、甾體皂苷、三萜、生物堿、木脂素、黃酮、植物甾醇及揮發(fā)油等活性成分[1]。關(guān)于黃精及其炮制品的質(zhì)量評價，主要以糖類和皂甙類成分為指標(biāo)，《中國藥典》(2020版)以多糖為質(zhì)量評價指標(biāo)?？傇碥盏臏y定以香草醛-高氯酸比色法較為常用[2-4]，黃精總皂苷和皂苷元的含量測定亦有一些文獻(xiàn)報道[5-8]，但方法不統(tǒng)一，結(jié)果和結(jié)論存在較大差異。本文以滇黃精及其炮制品為原料，對黃精總皂苷測定方法進(jìn)行研究，確立以總皂苷含量為指標(biāo)的黃精質(zhì)量評價方法，為黃精炮制工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器和材料

BioMate 3S紫外可見分光光度計(美國)，AR224CN電子天平(奧豪斯儀器(常州)有限公司)，SK7210型超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)，DK-98-ⅡA恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)，薯預(yù)皂苷元對照品(上海源葉生物科技有限公司)，香蘭素(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)，其余試劑均為分析純。

黃精(采自云南祿豐，經(jīng)邱斌教授鑒定為滇黃精PolygonatumkingianumColl.Et Hemsl.的根莖。)

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 樣品的炮制

2.1.1 生黃精 取鮮黃精，去除雜質(zhì)，洗凈，置沸水中煮15 min，取出，放涼，切3～4 mm厚片，60 ℃干燥，得生黃精片，粉碎，過60目篩，備用。

2.1.2 蒸黃精 取鮮黃精，去除雜質(zhì)，洗凈，置蒸制容器內(nèi)蒸，從已至子，取出，切3～4 mm厚片，60 ℃干燥，得蒸黃精，粉碎，過60目篩，備用。

2.1.3 酒黃精 取生黃精片，適宜的容器內(nèi)，加20%黃酒及適量(100%)水拌勻，浸潤過夜，置蒸制容器內(nèi)蒸12 h，悶潤12 h，取出，60 ℃干燥，得酒黃精，粉碎，過60目篩，備用。每100kg黃精，用黃酒20 kg。

2.1.4 炙黃精 取生黃精片，置適宜的容器內(nèi)，加入黑豆汁、蜂蜜、白酒及適量水(85%)拌勻，浸潤過夜，置蒸制容器內(nèi)蒸12 h，悶潤12 h，取出，60 ℃干燥，得炙黃精，粉碎，過60目篩，備用。每100kg黃精，用黑豆10 kg，蜂蜜5 kg，白酒5kg。。

2.1.5 九蒸九曬黃精 取鮮黃精，去除雜質(zhì)，洗凈，置蒸制容器內(nèi)蒸4 h，取出，60 ℃干燥4h，如此反復(fù)九次，切3～4 mm厚片，取出，60 ℃干燥，得九蒸九曬黃精，粉碎，過60目篩，備用。

2.2 不同提取方法比較

2.2.1 正丁醇超聲提取法 取生、熟黃精粗粉(過60目篩)約1 g，精密稱定，置燒瓶中，加入15倍量水飽和正丁醇，浸泡30 min，60℃超聲提取50 min，提取2次，合并濾液，減壓濃縮回收溶劑至干，得黃精總皂苷粗提物。

2.2.2 乙醇超聲提取法 取樣品3份，以80%乙醇做提取溶液，按2.2.1方法操作，得黃精總皂苷粗提物后，一份留用；一份用正丁醇萃取純化，加水20 mL使其溶解，移入分液漏斗，加水飽和的正丁醇提取3次，每次15 mL，合并正丁醇液，減壓濃縮，回收正丁醇得純化黃精總皂苷粗提物；一份用硫酸水解純化，將其置圓底燒瓶內(nèi)，加2%稀硫酸50 mL、石油醚(60～90 ℃)50 mL，于水浴上回流(80 ℃)4 h水解，傾出、冷卻、分層，取上層(石油醚溶液)，回收石油醚至得水解后黃精總皂苷粗提物。

上述不同方法提取得到的粗提物，分別加甲醇適量溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中定容，搖勻，按照2.3.3項下操作測定總皂苷含量，結(jié)果見表1。

表1 黃精不同提取方法總皂苷(%)測定結(jié)果(n=3)

實驗結(jié)果表明，不同方法提取對總皂苷的測定影響較大，正丁醇超聲提取法簡便和快捷，所以宜選用水飽和正丁醇超聲提取法。

2.3 總皂苷含量測定

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取薯蕷皂苷元對照品2.50 mg，置 l0 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得每1 mL含0.25 mg薯蕷皂苷元的對照品溶液，(4℃冷藏)備用。

2.3.2 測定波長的選擇 精密吸取對照品溶液0.2 mL，按照2.3.3項下操作，用紫外-可見分光光度計在400～700 nm范圍內(nèi)掃描，見圖1，結(jié)果顯示對照液在550 nm左右處有特征吸收波長，故將檢測波長定為550 nm。

圖1 薯蕷皂苷元對照品紫外掃描光譜圖

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密吸取上述對照品溶液0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60 mL于10 mL具塞試管中，水浴揮盡溶劑，分別加入新配制的5 %香莢蘭醛冰醋酸溶0.20 mL，高氯酸1.0 mL，在70℃水浴中加熱15 min，冰水冷卻5 min，加5 mL冰醋酸，搖勻，放置15 min后，以試劑空白為對照，在波長550處測定其吸光值。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，薯蕷皂苷元質(zhì)量(mg)為橫坐標(biāo)回歸處理，得回歸方程：Y=0.0232X-0.0015(R2=0.9985)，結(jié)果表明薯蕷皂苷元在4.03～24.18 μg/mL范圍內(nèi)濃度與A呈良好的線性關(guān)系。

2.3.4 溫度對吸光度的影響 分別精密吸取對照品、蒸黃精供試品溶液0.2 mL，按照2.3.3項下操作，測定吸光值。結(jié)果見圖2，其他因素相同的條件下，吸光度隨溫度的升高而增大，溫度越高對吸光度的影響越大，但溫度過高試驗的重復(fù)性差，溫度過低(<60 ℃)反應(yīng)不完全，故本法選用70 ℃。

圖2 溫度對吸光度的影響

2.3.5 加熱時間對吸光值的影響 分別精密吸取對照品、蒸黃精供試品溶液0.2 mL，在加熱溫度為70 ℃條件下，按照2.3.3項下操作測定不同加熱時間下供試品溶液的吸光值，結(jié)果見圖3，在其他因素一定的條件下，吸光度隨加熱時間的增加而增大，但時間過長試驗的重復(fù)性差，故本法選用15 min。

圖3 加熱時間對吸光值的影響

2.3.6 精密度試驗 精密吸取對照品溶液0.2 mL各5份，按照2.3.3項下操作測吸光度，結(jié)果見表2，RSD為1.27%，表明儀器精密度良好。

表2 精密度測定結(jié)果

2.3.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取對照品溶液各0.2 mL，按照2.3.3項下操作測定測定不同時間(5～50 min)的吸光度A，結(jié)果見表3，圖4，表明樣品吸光度隨時間延長顯下降趨勢，顯色后15 min相對穩(wěn)定。

表3 穩(wěn)定性測定結(jié)果

圖4 穩(wěn)定性測定結(jié)果

2.3.8 重現(xiàn)性試驗 取同一批制黃精粉末5份，按照2.3.3項下操作測定總皂苷的含量，結(jié)果見表4，RSD為1.68%，表明方法重現(xiàn)性良好。

表4 重現(xiàn)性測定結(jié)果(n=5)

2.3.9 加樣回收率試驗 精密吸取已知總皂苷含量的供試品溶6份，分別精確加入薯蕷皂苷元對照品溶液，按照2.3.3項下操作測定總皂苷含量，計算結(jié)果見表5，平均回收率為100.02%，RSD為2.20%。

表5 黃精中總皂苷加樣回收率(n=6)

2.4 樣品測定 吸取一定量不同供試液，揮干溶劑，加入0.2 mL5%香草醛一冰醋酸溶液(新鮮配置)，冰浴時加入1 mL高氯酸，搖勻，70℃水浴加熱15 min后，冰浴5 min，加入5 mL冰醋酸，搖勻，靜置15 min，于550nm波長處測定吸光度，計算總皂苷含量(%)，結(jié)果見表6。

表6 樣品測定結(jié)果(n=3)

3 討論

不同方法制備供試品溶液(生品 炮制品)的比較結(jié)果表明，制備方法不同，所測出的黃精總皂苷含量有顯著差異，采用乙醇超聲提取后(1)甲醇直接溶解法，因含雜質(zhì)較多，其總皂苷含量測定結(jié)果遠(yuǎn)高于乙醇超聲提取后正丁醇萃取所得浸膏率，不符合總皂苷實際含量；(2)水解純化法由于硫酸的作用，部分總皂苷可能被破壞，含量偏低；(3)正丁醇萃取法使樣液得到了純化而不破壞皂苷，是較好的方法；水飽和正丁醇超聲提取法在有利于除去雜質(zhì)的同時更利于皂苷類成分的溶出，是測定黃精總皂苷含量時理想的提取方法。

水浴加熱溫度及時間對吸光值均有顯著的影響，且影響能力為：溫度>時間。故操作過程中需嚴(yán)格控制水浴加熱溫度及時間。加熱溫度過高、時間過長使得試驗重復(fù)性差，可能跟某些成分發(fā)生其他一些復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)有關(guān)。

樣品含量測定結(jié)果表明，黃精經(jīng)過炮制后總皂苷含量增加，九蒸九曬黃精>炙黃精>酒黃精>蒸黃精>生黃精。制黃精水飽和正丁醇超聲提取液隨著蒸制時間的增加其顏色加深，其顏色深淺對吸光度是否有影響有待進(jìn)一步的研究。