基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討黃芪治療股骨頭缺血性壞死的作用機(jī)制*

王明明，程 延

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；2.陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710003)

股骨頭壞死(ischemic necrosis of the femoral head，INFH)是一種臨床常見疾病，多種原因均可導(dǎo)致股骨頭血供出現(xiàn)紊亂，最終引起骨細(xì)胞死亡，出現(xiàn)骨小梁斷裂、股骨頭塌陷、骨壞死等為最終結(jié)果的髖關(guān)節(jié)功能減退的一種骨科常見疾病[1]。其分為創(chuàng)傷性和非創(chuàng)傷性，病因多見于創(chuàng)傷、過量飲酒、服用大量激素類藥物、有減壓艙工作史[2]等。根據(jù)ONFH中國分期將其分為臨床前期(I期)、早期(Ⅱ期)、塌陷前期(中期，Ⅲ期)、塌陷期(中晚期，Ⅳ期)、骨關(guān)節(jié)炎期(晚期，Ⅴ期)五期[3-5]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為INFH發(fā)病漸進(jìn)、緩慢，病因與血運(yùn)障礙、脂質(zhì)代謝紊亂、骨內(nèi)壓增高、基因多態(tài)性、免疫因素等多種因素有關(guān)，但具體發(fā)病機(jī)制仍不明確，國內(nèi)提出了包括脂肪代謝紊亂、血管內(nèi)凝血、血管功能障礙等多種學(xué)說，其中靜脈瘀滯、骨內(nèi)高壓學(xué)說普遍為骨科界所接受，該病的最終共同通路是股骨頭的血運(yùn)損害。這些學(xué)說從微觀角度揭示，主要是靜脈回流障礙和骨內(nèi)壓增高的同時(shí)又影響到動(dòng)脈的血供，造成股骨頭的細(xì)胞受壓、壞死，最終導(dǎo)致INFH[6-10]。

股骨頭缺血性壞死的治療主要分為非手術(shù)治療、手術(shù)治療等兩個(gè)方面。根據(jù)患者不同的需求，采取不同的治療方案。對于早、中期患者，大多數(shù)患者采取非手術(shù)治療，以緩解病情進(jìn)展為原則。中醫(yī)對于早中期患者方案多樣，內(nèi)服中藥是治療INFH的主要形式，以活血化瘀、補(bǔ)腎強(qiáng)骨的藥物為主。輔以其他治療如外用中藥熱敷、針灸、小針刀、推拿按摩以及患肢功能鍛煉等治療，起到延緩、甚至逆轉(zhuǎn)病情的進(jìn)展。

黃芪，迄今已有2000多年的藥用歷史，歸脾、肺經(jīng)，其味甘，性微溫。具有補(bǔ)氣升陽，益衛(wèi)固表、利水消腫，生津養(yǎng)血，托毒生肌、行滯通痹，斂創(chuàng)生肌的功效[11]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芪中的黃酮類、多糖類、皂苷類、氨基酸類等均發(fā)揮著藥理作用[12]，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用[13]。

本研究是以系統(tǒng)生物學(xué)[14]等相關(guān)理論，借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)(network pharmacology)方法和計(jì)算機(jī)相關(guān)軟件技術(shù)為基礎(chǔ)，探討黃芪的有效成分與相關(guān)蛋白靶點(diǎn)之間的互作關(guān)系，探索黃芪中多成分、多靶點(diǎn)、多機(jī)制、多通路治療股骨頭缺血性壞死的作用機(jī)制，為黃芪在臨床治療股骨頭缺血性壞死提供臨床科學(xué)依據(jù)及應(yīng)用參考。

1 資料與方法

1.1 黃芪的有效成分篩選及其靶點(diǎn)獲取 利用中藥系統(tǒng)藥理分析平臺(TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，在Herb name中輸入黃芪(或Huangqi)，檢索黃芪的活性成分，通過相似性(DL)和生物利用度(OB)進(jìn)行篩選黃芪的高活性成分。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，選擇化合物類藥性(Drug-Like，DL)≧0.18，口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≧30%[15]的化學(xué)成分作進(jìn)一步分析。作為篩選閾值選擇出所需要的高活性的關(guān)鍵活性成分，同時(shí)將高活性成分所對應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白檢索出來。

1.2 黃芪的高活性成分靶點(diǎn)蛋白規(guī)范 由于黃芪的高活性成分靶點(diǎn)來源于不同數(shù)據(jù)庫，會引起靶點(diǎn)名稱不統(tǒng)一，因此要對篩選出的靶點(diǎn)蛋白要和基因信息進(jìn)行校正。利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫Uniprot(https：//www.uniprot.org/)、NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)等數(shù)據(jù)庫，將1.1所獲得的靶點(diǎn)蛋白在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索，選擇已驗(yàn)證過的“Homo sapiens”，將蛋白質(zhì)靶點(diǎn)進(jìn)行校正、規(guī)范，獲取標(biāo)準(zhǔn)的靶點(diǎn)名稱。

1.3 股骨頭缺血性壞死靶點(diǎn)及交集靶點(diǎn)的獲取 利用Genecards(https：//www.genecards.org/)、OMIM(http：//omim.org/)等數(shù)據(jù)庫，在輸入欄輸入“股骨頭缺血性壞死”英文全稱：Ischemic necrosis of the femoral head，獲得股骨頭缺血性壞死的疾病靶點(diǎn)，去除重復(fù)項(xiàng)后并經(jīng)過Uniprot規(guī)范后整理獲得INFH相關(guān)疾病靶點(diǎn)，并將其輸出為Excel表格保存。運(yùn)用R語言(4.1.2版本)系統(tǒng)將獲得的黃芪高活性成分蛋白基因與INFH靶點(diǎn)基因進(jìn)行韋恩分析，獲取黃芪治療INFH的交集靶點(diǎn)。

1.4 黃芪-活性成分-疾病-疾病靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)圖建立 借用Cytoscape3.7.2軟件將黃芪與INFH的交集靶基因與黃芪高活性成分建立黃芪-活性成分-疾病-疾病靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)圖，并利用插件NetworkAnalyzer計(jì)算相關(guān)網(wǎng)絡(luò)特征值，以闡明黃芪治療INFH的作用機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)圖中，節(jié)點(diǎn)代表高活性成分和靶基因，線代表節(jié)點(diǎn)之間相互作用的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 篩選出黃芪高活性成分和靶點(diǎn)蛋白 利用TCMSP檢索出953個(gè)作用靶點(diǎn)基因，經(jīng)過口服生物利用度、類藥性篩選后得到20個(gè)活性成分和462個(gè)作用靶點(diǎn)，其中主要作用成分并經(jīng)過查閱相關(guān)文獻(xiàn)[16-21]包括：含丁子香萜、熊竹素(華良姜素)、常春藤皂苷元、β-谷甾醇、異鼠李素、3，9-二-O-甲基尼森香豌豆紫檀酚、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇 tol、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、黃芪紫檀烷苷、聯(lián)苯雙酯、刺芒柄花素、毛蕊異黃酮、山柰酚、葉酸、黃芪異黃烷苷、1，7-二羥基-3，9-二甲氧基紫檀烯、槲皮素。利用Uniprot、NCBI等數(shù)據(jù)庫規(guī)范并去重后，獲得相關(guān)靶基因197個(gè)。其黃芪20個(gè)藥效活性成分及OB(%)、DL參數(shù)如下：見表1。

表1 黃芪藥效活性成分及對應(yīng)OB(%)、DL參數(shù)

續(xù)表1

2.2 INFH疾病的靶點(diǎn)篩選及交集靶點(diǎn) 借用Genecards、OMIM數(shù)據(jù)庫檢索，去重規(guī)范及整合后得到936個(gè)靶基因，將2.1所獲得的197個(gè)藥物靶基因借用R語言與其計(jì)算，共得到69個(gè)交集靶點(diǎn)，分別為PGR、NOS2、PTGS1、AR、PTGS2、ESR2、DPP4、ESR1、PPARg，PPARD、NCOA1、F2、NOS3、XDH、HTR3A、KDR、IL4、SIRT1、HSD3B1、AKT1、BCL2、TNF、MMP1、STAT1、CYP3A4、ICAM1、SELE、VCAM1、INSR、GSTM1、MMP3、EGFR、VEGFA、CCND1、CDKN1A、PLAU、MMP2、MMP9、IL10、RB1、IL6、TP53、NFKBIA、SOD1、ERBB2、MYC、F3、GJA1、IL1B、CCL2、CXCL8、TGFB1、IL2、PLAT、THBD、SERPINE1、COL1A1、IFNg，PTEN、IL1A、PARP1、PPARA、CRP、CXCL10、SPP1、RUNX2、IGF2、CD40Lg，RASA1。交集Venny圖可視化見圖1。

圖1 藥物-疾病交集靶點(diǎn)基因Venny圖

2.3 建立中藥-活性成分-疾病-疾病靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)圖 借用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建黃芪、活性成分及INFH疾病靶點(diǎn)基因之間的相互作用關(guān)系，將其相互之間的聯(lián)系進(jìn)行可視化，建立黃芪-活性成分-疾病靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)可視圖，圖中左邊粉色為中藥，即黃芪，中間綠色為黃芪高活性成分，淺綠色為疾病，即INFH，紫色和紅色代表所有靶基因，單獨(dú)紅色代表黃芪-INFH共同靶基因(即黃芪治療INFH作用靶基因)，線代表中藥、活性成分、疾病及靶點(diǎn)之間的相關(guān)性。通過插件cytoNCA按著度degree、緊密度closeness兩種屬性分別取排序靠前的成分有：常春藤皂苷元、異鼠李素、刺芒柄花素、毛蕊異黃酮、山柰酚、槲皮素等。如圖2。

2.4 蛋白質(zhì)PPI相互作用網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將黃芪-疾病交集靶點(diǎn)基因?qū)氲絊TRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白互作分析，篩選出分值在0.9以上的蛋白互作關(guān)系，構(gòu)建蛋白(PPI)互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。共有69個(gè)節(jié)點(diǎn)、202條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為5.86，平均局部聚類系數(shù)是0.537，圖中的“邊”代表靶基因之間的聯(lián)系，“邊”的粗細(xì)表示：邊越粗，相互之間的結(jié)合度就越大，combine score值就越大；其中作用靶基因用節(jié)點(diǎn)表示。見圖3。經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，分值為0.99或以上的互作蛋白有56對：AKT1-NOS3、AR-NCOA1、CCND1-CDKN1A、CCND1-ESR1、CDKN1A-TP53、EGFR-RASA1、ESR1-NCOA1、ESR2-NCOA1、F2-THBD、KDR-VEGFA、NCOA1-PPARg，NCOA1-PPARA、PLAT-SERPINE1、PLAU-SERPINE1、PTEN-TP53、SIRT1-TP53、AR-CCND1、CCND1-RB1、CXCL8-IL1B、EGFR-ERBB2、ESR1-NOS3、PPARG-SIRT1、CXCL8-IL6、IL1B-IL6、EGFR-ESR1、EGFR-STAT1、ESR1-RUNX2、IL10-TNF、NCOA1-PGR、BCL2-TP53、CCL2-CXCL8、IL10-IL1B、IL1A-IL1B、CCL2-IL6、CXCL8-IL10、ESR1-TP53、IL6-TNF、PPARA-SIRT1、PTGS2-TP53、AKT1-CDKN1A、CCL2-IL1B、IL1A-IL6、IL4-TNF、AKT1-PTEN、CCL2-TNF、CXCL8-TNF、NFKBIA-TNF、RB1-RUNX2、CCL2-CXCL10、CCND1-MYC、F2-F3、IL4-IL6、MMP9-TGFB1、IL1B-IL4、IL6-TGFB1、RB1-TP53，這些靶點(diǎn)蛋白之間的相互作用關(guān)系極其重要。

圖3 黃芪潛在治療靶基因的互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

借用Cytoscape3.7.2軟件，將黃芪潛在治療INFH疾病靶基因互作關(guān)系Degree值進(jìn)行可視化，其中Degree值越大，代表黃芪作用于此靶基因的作用越大，即圖中形狀越大，反之則小。其中Degree值較大的靶基因?yàn)椋篒L6、TNF、IL10、AKT1、TP53、ESR1、STAT1。見圖4。

圖4 黃芪潛在治療靶基因互作關(guān)系Degree可視化圖

利用插件計(jì)算每個(gè)基因節(jié)點(diǎn)的連接個(gè)數(shù)，繪制Degree排列靠前的35個(gè)靶基因進(jìn)行可視化展示，構(gòu)建PPI核心基因條形圖，見圖5。

圖5 PPI核心基因條形圖

2.5 GO富集分析 借用DAVID數(shù)據(jù)庫將黃芪-INFH交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，包括生物過程(BP)、細(xì)胞組分(CC)、分子功能(MF)，經(jīng)過P≤0.05進(jìn)行規(guī)范篩選后，共富集到GO條目426項(xiàng)，其中BP、CC、MF分別為347、23、56項(xiàng)。表明中藥黃芪可通過多項(xiàng)BP、CC、MF治療INFH，BP、CC、MF分別前10項(xiàng)富集分析結(jié)果的條形圖和氣泡圖詳見圖6。(圖中條形長度表示富集的基因個(gè)數(shù)，條形顏色代表分類，氣泡圖顏色代表富集的程度，氣泡的大小代表富集的基因個(gè)數(shù))

圖6 黃芪治療股骨頭缺血性壞死GO富集分析條形圖和氣泡圖

2.6 KEGG通路富集分析 將黃芪-INFH交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，并借用String數(shù)據(jù)庫進(jìn)行規(guī)范校正，篩選P值≤0.05的條目，共富集到78條信號通路，將其按照P值大小由小到大進(jìn)行排列，將排列前20名的通路繪制成條狀圖和氣泡圖，見圖7。

圖7 KEGG通路富集分析條形圖和氣泡圖

3 討論

近年來，由于外傷、激素與酒精應(yīng)用不當(dāng)，股骨頭缺血性壞死患者逐年增多[22]。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查研究顯示國內(nèi)股骨頭患者高達(dá)約800萬例[23]。祖國醫(yī)學(xué)將其隸屬于“骨痹”“骨痿”及“骨蝕”的范疇，早期病因以氣滯血瘀為多，屬“髖骨痹”的范疇；而中期以骨枯筋軟為特征，屬于“骨痿”的范疇；晚期股骨頭出現(xiàn)塌陷和軟骨損傷，多屬于“骨蝕”的范疇[24]。本病病機(jī)以本虛標(biāo)實(shí)多見，肝腎虧虛為本虛，氣滯、痰濁、血瘀為標(biāo)實(shí)[25]，并將其致病因素歸納為虛、痰、瘀[26]。有研究表明，黃芪中芒柄花素、毛蕊異黃酮等黃酮類、及黃芪甲苷等皂苷類具有改善微循環(huán)的作用[27]。本研究從藥物-疾病Venny網(wǎng)絡(luò)圖可知，黃芪中刺芒柄花素、毛蕊異黃酮、山柰酚、槲皮素、異鼠李素等20個(gè)化合物作用于INFH疾病相關(guān)的69個(gè)靶點(diǎn)，進(jìn)一步證明了黃芪是通過多成分、多靶點(diǎn)共同協(xié)作治療INFH。

PPI互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖是靶點(diǎn)之間相互作用的可視化體現(xiàn)，靶點(diǎn)之間的相互作用，構(gòu)成了復(fù)雜的生物網(wǎng)絡(luò)體系，其中連接度越大，表明黃芪通過此靶點(diǎn)治療股骨頭缺血性壞死的可能性越大。通過PPI篩選可知IL6、TNF、IL10、AKT1、TP53、ESR1、STAT1等可能是黃芪治療INFH的關(guān)鍵靶點(diǎn)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)是一種多功能、多效應(yīng)及多向性的細(xì)胞因子[28]。是一種可溶性介質(zhì)，對炎癥、免疫反應(yīng)和造血功能、骨代謝具有多重作用[29]。在炎性疾病中如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，IL-6的持續(xù)表達(dá)可以增強(qiáng)破骨細(xì)胞的形成、分化及間接影響成骨細(xì)胞凋亡[30-31]。Kamiya，N等[32]研究指出IL-6是股骨頭壞死活躍期滑膜中存在的特異性炎性細(xì)胞因子。Yamaguchi等[33]學(xué)者也指出關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的IL-6是由于HIF-1α的激活，刺激了滑膜細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，并認(rèn)為缺氧關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的IL-6刺激滑膜細(xì)胞增殖和炎性細(xì)胞因子反應(yīng)，其機(jī)制可能是缺血性骨壞死的誘導(dǎo)通過HIF-1信號傳導(dǎo)途徑導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨中的IL-6活化。并提出阻斷IL-6是治療缺血性骨壞死后滑膜炎的前景治療方法。通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析，采用cytoHubba 插件計(jì)算出黃芪作用于IL6的連接度最大，極有可能說明黃芪可通過抑制IL6等促炎性因子進(jìn)而治療INFH疾病。

通過GO富集分析預(yù)測出，黃芪治療INFH的BP作用機(jī)制可能是通過RNA聚合酶II啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控(Positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)、基因表達(dá)的正向調(diào)節(jié)(positive regulation of gene expression)、蛋白質(zhì)磷酸化的正向調(diào)控(positive regulation of protein phosphorylation)、藥物反應(yīng)(Response to drug)、炎癥反應(yīng)(inflammatory response)、負(fù)調(diào)控凋亡過程(negative regulation of apoptotic process)通過細(xì)胞外隙(extracellular space)、細(xì)胞外區(qū)(extracellular region)、酶結(jié)合(Enzyme binding)、蛋白結(jié)合(Protein binding)產(chǎn)生治療作用的。

依據(jù)KEGG通路富集分析結(jié)果可知，預(yù)測出黃芪治療INFH疾病的治療通路，其治療過程中相關(guān)度較高的治療通路可能與膀胱癌(Bladder cancer)、瘧疾(Malaria)、癌癥(Pathway in cancer)、乙型肝炎(Hepatitis B)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)等。從富集分析得到的結(jié)果來看，說明黃芪的活性成分所對應(yīng)的核心靶點(diǎn)映射在不同的通路上，是通過多條通路共同發(fā)揮藥效，進(jìn)一步表明了其研究機(jī)制。

綜上所述，黃芪治療INFH的作用機(jī)制可能是其有效活性成分通過IL6、TNF、IL10、AKT1、TP53、ESR1、STAT1等關(guān)鍵靶基因通過調(diào)控膀胱癌、瘧疾、癌癥、乙型肝炎、HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路等互相介導(dǎo)而產(chǎn)生抑制炎癥、提高免疫和神經(jīng)遞質(zhì)，從而調(diào)控機(jī)體改善股骨頭壞死的癥狀。通過調(diào)控RNA聚合酶II啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、基因表達(dá)的正向調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)磷酸化的正向調(diào)控、藥物反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、負(fù)調(diào)控凋亡過程等和通過膀胱癌、瘧疾、癌癥、乙型肝炎、HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路等多條相關(guān)信號通路共同協(xié)作治療INFH疾病的作用。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法揭示了黃芪有效成分、靶基因、通路之間的相互協(xié)作關(guān)系，發(fā)現(xiàn)黃芪治療INFH是通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用機(jī)制，進(jìn)而驗(yàn)證了黃芪治療INFH是通過多途徑、多方面產(chǎn)生抑制炎癥、提高免疫和神經(jīng)遞質(zhì)的作用機(jī)制，體現(xiàn)了中醫(yī)藥治療疾病的整體觀念。進(jìn)一步為黃芪治療股骨頭壞死的臨床應(yīng)用提供了更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)睦碚摶A(chǔ)。