蘇木及其活性成分對耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌的體外抑制作用研究

徐令清，杜良琴，袁潤奇，晏 嘉，陳 旋，簡永歡，周飄雁，溫偉洪，李林海

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院/清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科， 廣東清遠(yuǎn) 511518)

鮑曼不動桿菌是一種需氧非發(fā)酵的革蘭陰性桿菌，廣泛存在于自然界及人體皮膚，為臨床常見的條件致病菌[1]。由于其生存能力強(qiáng)，并且存在多種耐藥機(jī)制，常常有多重耐藥的特性，而這種多重耐藥鮑曼不動桿菌已成為醫(yī)院感染的重要病原菌[2-3]。碳青霉烯類抗菌藥物曾被認(rèn)為是抗菌活性最強(qiáng)的內(nèi)酰胺類抗菌藥物,但隨著此類藥物的廣泛使用，鮑曼不動桿菌的耐藥性日益增強(qiáng)，故臨床對此類細(xì)菌面臨無藥可用的窘境。蘇木作為傳統(tǒng)天然中藥，具有廣泛的生物活性。有研究表明，蘇木中成分巴西蘇木素對各類微生物都有抑制作用[4-6]，但對耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌(carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii,CRABA)的抑菌作用國內(nèi)外鮮有報(bào)道，本研究通過體外試驗(yàn)探究巴西蘇木素對CRABA的抑制作用及其機(jī)制，并將巴西蘇木素與美羅培南進(jìn)行聯(lián)合藥敏試驗(yàn)觀察其抑菌作用，為中藥治療CRABA感染提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1菌株來源

收集2020年本院檢驗(yàn)科微生物室分離的10株CRABA，其中5株來源于重癥監(jiān)護(hù)室，2株來源于急診科，3株來源于其他科室。鮑曼不動桿菌對任何一種碳青霉烯類藥物耐藥判定為CRABA株。質(zhì)控菌株為：美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection，ATCC)25922大腸埃希菌(Escherichia coli，ECO)；ATCC 25923金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SAU)。

1.1.2試劑與儀器

蘇木(康美藥業(yè)股份有限公司)；蘇木單體：巴西蘇木素，原蘇木素B(成都曼斯特生物科技有限公司)；美羅培南(北京索萊寶科技有限公司)；血平板(江門市凱林貿(mào)易有限公司)；肉湯培養(yǎng)基與MH瓊脂平板(廣州市迪景生物科技有限公司)；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；DHP-9145A電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；VITEK2 Compact全自動微生物分析儀(法國生物梅里埃公司)；uLtiMate 3000型高效液相色譜儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)；SPECTROstar Nano全波長酶標(biāo)儀(德國BMG公司)。

1.2 方法

1.2.1藥物敏感試驗(yàn)

細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定及藥物敏感性試驗(yàn)所有標(biāo)本均按《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程(第4版)》及本實(shí)驗(yàn)室的作業(yè)指導(dǎo)書要求進(jìn)行接種和培養(yǎng)，菌株分離純化后使用VITEK-2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行菌種鑒定和常規(guī)藥物敏感性試驗(yàn)，按2020年美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(clinical and laboratory standards institute，CLSI)標(biāo)準(zhǔn)[7]進(jìn)行敏感性判斷。

1.2.2蘇木抑菌試驗(yàn)

1.2.2.1蘇木萃取液、巴西蘇木素和原蘇木素B溶液制備

稱量蘇木100 g放于離心管中與無水乙醇200 mL以1∶2的比例混勻，于恒溫培養(yǎng)振蕩器中震蕩48 h然后離心，4 500 r/min離心5 min，取離心管稱量并標(biāo)記序號，取上清液于離心管中，開蓋放入恒溫培養(yǎng)振蕩器中50 ℃震蕩24～96 h以揮發(fā)盡無水乙醇，稱取萃取后蘇木質(zhì)量，加適量DMSO配成1 000 mg/mL的萃取液原液，再取原液倍比稀釋成500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、7.81、3.90 mg/mL共8個(gè)質(zhì)量濃度。將巴西蘇木素單體和原蘇木素B單體分別用DMSO配制成64.000 0、32.000 0、16.000 0、8.000 0、4.000 0、2.000 0、1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.012 5、0.063 0 mg/mL 共11個(gè)質(zhì)量濃度。

1.2.2.2菌液制備

將所有CRABA接種于血平板，37 ℃培養(yǎng)18 h，挑取數(shù)個(gè)分離純化后的菌落置于生理鹽水試管中,比濁儀校正濃度至0.5麥?zhǔn)蠁挝?1.5×108cfu/mL)。

1.2.2.3蘇木萃取液對10株CRABA的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)和最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)測定

于無菌96孔板中每孔加入肉湯菌液100 μL，第1個(gè)孔加入1 000 mg/mL蘇木萃取液100 μL，采用微量倍比稀釋法，使蘇木萃取液質(zhì)量終濃度分別為500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、7.81和3.90 mg/mL共8個(gè)濃度，每孔加入菌液20 μL。將96孔板放于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h。

1.2.2.4巴西蘇木素對10株CRABA的MIC、MBC測定

于無菌96孔板中每孔加入肉湯100 μL，而后加入11個(gè)濃度分別為64.000 0、32.000 0、16.000 0、8.000 0、4.000 0、2.000 0、1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.012 5、0.063 0 mg/mL的巴西蘇木素溶液100 μL，每孔加入菌液20 μL，取菌液200 μL作為陽性對照，肉湯培養(yǎng)基200 μL作為陰性對照。將96孔板放于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h。

1.2.2.5原蘇木素B對10株CRABA的MIC測定

于無菌96孔板中每孔加入肉湯100 μL，而后加入11個(gè)濃度分別為64.000 0、32.000 0、16.000 0、8.000 0、4.000 0、2.000 0、1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.012 5、0.063 0 mg/mL的原蘇木素B溶液100 μL，每孔加入菌液20 μL，取菌液200 μL作為陽性對照，肉湯培養(yǎng)基200 μL作為陰性對照。將96孔板放37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h。

1.2.3高效液相檢測蘇木組分

1.2.3.1樣品提取

稱取蘇木各5 g置于錐形瓶中，加入乙醇100 mL，用封口膜把瓶口封好。超聲提取30 min，用0.22 μm有機(jī)膜濾膜過濾到樣品瓶中。

1.2.3.2標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

分別精密稱取蘇木提取液、巴西蘇木素、DMSO，置于3個(gè)滅菌EP管中。

1.2.3.3高效液相色譜法檢測

采用C18(5 μm，4.6 mm×250.0 mm)色譜柱，流速為1.0 mL/min，檢測波長210 nm，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量5 μL。流動相為乙腈∶水，梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

1.2.4CRABA的生長曲線測定

取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的CRABA，用無菌生理鹽水配制成0.5麥?zhǔn)蠞岫?，?00 μL菌液分別加至巴西蘇木素濃度不同的100 μL肉湯培養(yǎng)基中，使肉湯中巴西蘇木素的濃度為1/8 MIC(0.063 0 mg/mL)、1/2 MIC(0.250 0 mg/mL)、1 MIC(0.500 0 mg/mL)。每隔4 h進(jìn)行取樣，用酶標(biāo)儀檢測600 nm處的吸光度值，繪制生長曲線。

1.2.5十二烷基磺酸鈉(sodium 1-dodecanesulfonate,SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)

取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的CRABA，配制成0.5麥?zhǔn)蠞岫?，? mL菌液分別加至巴西蘇木素濃度不同的3 mL肉湯培養(yǎng)基中，使巴西蘇木素的濃度為1/8 MIC(0.063 0 mg/mL)、1/2 MIC(0.250 0 mg/mL)、1 MIC(0.500 0 mg/mL)。置于37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)，于16 h取樣4 mL，3 155×g離心10 min，去除上清液，收集菌體；加入4 mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)并萃取，洗滌1次(3 155×g離心10 min)，再加入2 mL PBS，取等體積(1 mL)的各標(biāo)本加入EP管，5 560×g離心5 min(23 ℃)收集菌體，重懸于160 μL PBS并加40 μL蛋白上樣緩沖液混勻，沸水浴10 min轉(zhuǎn)速300 r/min后13 350×g離心10 min，取上清液備用。選用12%分離膠，5%濃縮膠，上樣20 μL進(jìn)行SDS-PAGE。經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色1 h后脫色，顯示蛋白譜帶。

1.2.6巴西蘇木素與美羅培南聯(lián)合抑菌試驗(yàn)

配制0.500 0、0.250 0、0.063 0、0.031 0 mg/mL的巴西蘇木素和0.256 0、0.128 0、0.064 0、0.032 0、0.016 0 mg/mL的美羅培南，將不同濃度的巴西蘇木素和美羅培南交叉配制為200 μL肉湯后加入96孔板，配制不同濃度的巴西蘇木素+美羅培南肉湯各200 μL加入96孔板，加入配制試驗(yàn)菌液20 μL，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。記錄MIC甲藥單用和MIC乙藥單用，并觀察兩藥聯(lián)用的MIC甲藥聯(lián)用和MIC乙藥聯(lián)用，相加值最小數(shù)值為最佳組合，計(jì)算部分抑菌濃度(fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC)指數(shù)。FIC指數(shù)≤0.5為協(xié)同作用，>0.5～1.0為相加作用，>1.0～2.0為無關(guān)作用，>2.0為拮抗作用。

2 結(jié) 果

2.1 菌株藥敏檢測結(jié)果

藥敏檢測結(jié)果顯示，10株CRABA對哌拉西林、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、亞胺培南、慶大霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、四環(huán)素耐藥率為100%，對多黏菌素耐藥率為0。

2.2 MIC、MBC測定結(jié)果

蘇木萃取液對10株CRABA的MIC均為15.63 mg/mL，MBC均為15.63 mg/mL。巴西蘇木素對10株CRABA的MIC均為0.500 0 mg/mL，MBC均為0.500 0 mg/mL。原蘇木素B對10株CRABA的MIC均無效。

2.3 蘇木組分高效液相圖譜

DMSO的高效液相圖譜見圖1，蘇木萃取液的高效液相圖譜見圖2，巴西蘇木素的高效液相圖譜見圖3，說明蘇木萃取液中產(chǎn)生抑菌作用的組分為巴西蘇木素。

圖1 DMSO高效液相色譜圖

A峰：DMSO；B峰：巴西蘇木素；C峰：原蘇木素B。圖2 蘇木萃取液高效液相色譜圖

A峰：DMSO；B峰：巴西蘇木素。圖3 巴西蘇木素高效液相色譜圖

2.4 巴西蘇木素對CRABA生長的影響

巴西蘇木素藥物濃度越大，其對CRABA的抑制生長作用越強(qiáng)，見圖4。

圖4 巴西蘇木素對CRABA生長的影響

2.5 SDS-PAGE圖譜

隨著巴西蘇木素濃度的增大，其對CRABA的分泌蛋白抑制作用越強(qiáng)，見圖5。

M：蛋白標(biāo)記物；1：陰性對照；2：1/8 MIC；3：1/2 MIC；4：1 MIC。圖5 SDS-PAGE圖譜

2.6 巴西蘇木素與美羅培南聯(lián)合用藥細(xì)菌生長抑制結(jié)果

美羅培南對CRABA的MIC為0.128 mg/mL，F(xiàn)IC指數(shù)為0.75，為相加作用，見表2、3。

表2 巴西蘇木素與美羅培南聯(lián)合用藥細(xì)菌生長抑制情況表

表3 巴西蘇木素與美羅培南聯(lián)合抗CRABA的棋盤法測定結(jié)果(MIC·mg-1·mL-1)

3 討 論

近年來隨著碳青霉烯類藥物的廣泛使用，耐碳青霉烯類革蘭陰性菌感染日益突出，其中CRABA所致感染的發(fā)生率和死亡率均較高，治療難度較大。CRABA對多粘菌素B的敏感性最高，耐藥率為1.4%，但因其腎臟和神經(jīng)毒性作用，臨床甚少使用。CRABA對頭孢哌酮-舒巴坦、米諾環(huán)素、左氧氟沙星和阿米卡星的耐藥率分別為33.0%、42.2%、45.5%和40.2%。對頭孢他啶、亞胺培南、美羅培南和環(huán)丙沙星等耐藥率均在50%以上[8-9]。目前針對CRABA感染的治療手段非常有限，主要是頭孢哌酮-舒巴坦、喹諾酮類和氨基糖苷類藥物。因此，針對CRABA探索新型藥物已成為研究的熱點(diǎn)。

蘇木的主要活性成分為生物堿，研究表明其中的巴西蘇木素在抗菌中起主要作用。LANE等[5]發(fā)現(xiàn)巴西蘇木素對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為14.85 mm，MIC為12.5 μg/mL。SYAMSUNARNO等[10]發(fā)現(xiàn)蘇木中的巴西蘇木素對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐萬古霉素腸球菌及其他菌種具有很強(qiáng)的抑制作用，MIC為4～32 μg /mL。因此，本研究探討了蘇木活性成分對CRABA的體外抑菌作用，為中藥抑菌研究提供理論支持。

既往研究發(fā)現(xiàn)，大部分抑菌的中藥對細(xì)菌的生長和蛋白譜的表達(dá)均有影響[11]，本試驗(yàn)也獲得了相似的結(jié)果。在不同濃度巴西蘇木素作用下，CRABA的生長受到明顯抑制，細(xì)菌可溶性蛋白表達(dá)發(fā)生了明顯變化，說明巴西蘇木素對CRABA的抑菌作用可能與其影響細(xì)菌生長、蛋白質(zhì)的表達(dá)有關(guān)，其機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

目前中藥很少系統(tǒng)地被應(yīng)用于臨床，其主要原因在于中藥對細(xì)菌的抑制作用弱于常用抗菌藥物。然而有研究表明，某些中藥與抗菌藥物聯(lián)用可以產(chǎn)生明顯的增效作用，因此，中藥與抗菌藥物聯(lián)用成為新的研究思路。本研究創(chuàng)新性地將巴西蘇木素和美羅培南進(jìn)行聯(lián)合用藥試驗(yàn)以觀測對CRABA的抑制作用，發(fā)現(xiàn)二者聯(lián)合用藥與單藥比較，抑菌效果得到了明顯增強(qiáng)。本研究雖然證實(shí)巴西蘇木素與美羅培南對CRABA有相加效應(yīng)，但從體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果分析，巴西蘇木素與美羅培南聯(lián)合用藥要達(dá)到完全抑菌效果，巴西蘇木素藥物濃度較低時(shí)，美羅培南仍需較高濃度，如何使二者聯(lián)用發(fā)揮更好的抑菌作用，尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，中藥抗菌具有較好的前景，貫穿于抗菌的各個(gè)環(huán)節(jié)。一方面，中藥可以直接作用于微生物本身，破壞細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性改變細(xì)胞通透性、抑制細(xì)菌生物被膜的形成[12-13]。另一方面，通過逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性，促進(jìn)其他藥物的殺菌作用，如抑制耐藥菌外排泵、消除耐藥質(zhì)粒R[14-15]。本研究不足之處在于：(1)所采用菌株數(shù)量較少，且其藥敏檢測結(jié)果相同，故10株菌所得到的結(jié)果也完全相同，雖然表明研究的重復(fù)性較好，但所得結(jié)果不能證明巴西蘇木素對耐藥性不同的CRABA都有很好的抗菌作用，其結(jié)果存在一定的偏倚，為臨床提供的幫助存在局限性。(2)未對其他抑菌機(jī)制展開研究，且僅處于體外試驗(yàn)階段，不能有效評價(jià)巴西蘇木素在體內(nèi)的療效。因此，未來將進(jìn)一步展開試驗(yàn)以探討巴西蘇木素抑菌作用的機(jī)制，為體外試驗(yàn)、臨床試驗(yàn)及應(yīng)用提供理論依據(jù)，使巴西蘇木素的抑菌活性得到真正發(fā)揮。