黃芩提取物的抑菌作用及穩(wěn)定性研究

宋軍霞,祁紅兵，顏思宏

(1.嶺南師范學(xué)院地理科學(xué)學(xué)院，廣東湛江 524048；2.嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東湛江 524048)

近年來(lái)，隨著免疫功能下降人群的不斷增多，細(xì)菌、真菌感染率大幅上升，伴隨耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)，臨床可供選擇的抗菌藥物越來(lái)越有限[1]。黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)作為中醫(yī)中比較常見(jiàn)的一味中藥，不僅有著較強(qiáng)的抑菌作用，而且黃芩對(duì)有耐藥性的細(xì)菌也有較好的抑菌作用，如對(duì)耐藥性大腸桿菌的抑菌效果明顯優(yōu)于側(cè)柏葉、大薊、艾葉、石菖蒲、夏枯草5種中草藥的提取物[2]。

黃芩是傳統(tǒng)的中藥，但其生理保健功能卻越來(lái)越引起人們的重視，中國(guó)藥監(jiān)部門(mén)認(rèn)定黃芩為藥食兩用植物，可作為保健食品的主要成分[3-4]，《神農(nóng)本草經(jīng)》中曰:黃芩主諸熱黃疸，腸泄痢，逐水下血閉，惡瘡疽蝕火腸。黃芩也被稱為山茶根、黃芩茶，為唇形科植物，多年生草本，主根長(zhǎng)大，略呈圓錐狀，外皮褐色，該藥物主要具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等作用[5-8]，常用于濕溫、暑溫胸悶嘔惡、濕熱痞滿、瀉痢、黃疸、肺熱咳嗽、高熱煩渴、血熱吐衄、癰腫瘡毒、胎動(dòng)不安等[9-13]?，F(xiàn)代藥理學(xué)的相關(guān)研究表明，黃芩具有抗氧化、抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒、抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、抗血小板聚集及抗凝、降血脂等作用[14-18]。

有研究表明，100%黃芩浸出液濾紙片對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、綠膿桿菌、乙型鏈球菌都有明顯的抑菌作用[19]。純化后的多糖對(duì)大腸桿菌的抑制活性最強(qiáng),對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草桿菌的最小抑菌濃度分別為0.625、0.625、1.250 mg/mL[20]。黃芩有效成分黃芩苷對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度(MIC)為1.56 g/L，且黃芩苷的抑菌能力高于黃芪皂苷[21]；蔣獻(xiàn)等[22]研究了黃芩浸膏和一清膠囊(主要成分是黃芩)對(duì)表皮葡萄桿菌(Staphylococcusepidermidis,Se)和痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes,Pra)的體外抑菌作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芩浸膏和一清膠囊對(duì)Se和Pra的MIC均分別為1.00、0.98 g/L， 表明黃芩對(duì)Se和Pra均有顯著的抑菌效果。該研究選用同一產(chǎn)地的黃芩，采用系統(tǒng)分離法對(duì)其有效化學(xué)成分進(jìn)行提取，針對(duì)其對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的活性抑制作用效果進(jìn)行比較分析，旨在對(duì)中藥黃芩的有效化學(xué)成分及其抑菌作用進(jìn)行分析，使臨床充分了解黃芩的有效成分及抑菌作用效果，更好地為廣大民眾服務(wù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1試材。黃芩飲片，購(gòu)自湛江大參林連鎖店；大腸桿菌菌株、金黃色葡萄球菌菌株，嶺南師范學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2儀器。FA2004B電子天平，上海天美天儀器有限公司；GFL-23電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；HH.S21-8-S電熱恒溫水浴鍋，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；LDZM-80KCS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械有限公司；THZ-100恒溫培養(yǎng)搖床，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；YRE-5299 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；PHS-3C 精密酸度計(jì)，上海天達(dá)儀器有限公司；SW-CJ-IBu超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；SPL-250生化培養(yǎng)箱，天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司。

1.1.3試劑。蛋白胨、牛肉膏、瓊脂，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；石油醚，分析純，廣東光華科技股份有限公司；三氯甲烷，分析純，衡陽(yáng)市凱信化工試劑有限公司；乙酸乙酯，分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；正丁醇，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；檸檬酸、氫氧化鈉，分析純，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1菌液和培養(yǎng)基的制備。牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基加熱至全溶，分裝封瓶口后高溫高壓蒸汽滅菌備用。半固體培養(yǎng)基除了瓊脂的量減少50%以外，其余與固體培養(yǎng)基相同。

將各供試菌在其對(duì)應(yīng)的試管斜面培養(yǎng)基上活化，保存在4 ℃冰箱中，用時(shí)移種至新鮮瓊脂斜面上，37 ℃溫度培養(yǎng)24 h，用2～3 mL無(wú)菌水洗下菌苔。將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的新鮮培養(yǎng)物制成菌液。

1.2.2黃芩水提物的系統(tǒng)分離物的抑菌作用。

1.2.2.1黃芩水提液的制備。取黃芩100 g，加水2 L，浸泡30 min后煎煮，煮沸后文火煎30 min，過(guò)濾。藥渣加水1 L，按上述方法進(jìn)行再次操作后，過(guò)濾藥液，合并2次濾液。離心去除掉液體里的藥物殘?jiān)?，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至100 mL。置于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2.2黃芩水提液中有效成分的分離。采用系統(tǒng)分離法[23]對(duì)水提液進(jìn)行萃取分離。依次用有機(jī)溶劑石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取進(jìn)行萃取，重復(fù)3次，所得的萃取液各自合并，再加上萃余項(xiàng)，分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成濃度為0.5 g/mL。置于0～4 ℃冰箱中備用。

1.2.2.3抑菌作用。每種萃取物各取9支試管，用二倍稀釋法[24]建立濃度梯度。每支試管中有效成分的濃度依次為0.500、0.250、0.125、0.063、0.032、0.016、0.008、0.004、0.002 g/mL。

根據(jù)馬永全等[25]的方法。操作前將裝有融化好的半固體培養(yǎng)基的錐形瓶置于55 ℃的恒溫水浴鍋中保溫，加入3 mL菌液混勻；取定量半固體培養(yǎng)基-菌液混合物覆蓋于固體培養(yǎng)基表面，凝固后進(jìn)行后續(xù)操作。待凝固后將1 mL的移液槍頭倒扣于半固體培養(yǎng)基上進(jìn)行打孔，每皿4孔，每孔注入0.05 mL黃芩各萃取物，空白對(duì)照注入等量對(duì)應(yīng)的萃取劑或無(wú)菌水。在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，精確測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.3黃芩各萃取物抑菌作用及穩(wěn)定性研究。

1.2.3.1光照對(duì)黃芩水提液抑菌能力的影響。根據(jù)Wu等[26]的方法，取部分黃芩水提液分成4等份，1份置于超凈工作臺(tái)上，打開(kāi)紫外燈照射2 h；1份置于另一超凈工作臺(tái)上，打開(kāi)白熾燈照射2 h；1份置于晴天太陽(yáng)光下直射2 h；最后一份用5層報(bào)紙包好作對(duì)照組，置于工作臺(tái)上2 h。用金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作指示菌，測(cè)量并比較抑菌圈大小。

1.2.3.2pH對(duì)黃芩水提液抑菌能力的影響。取部分黃芩水提液分成6等份，用檸檬酸和NaOH溶液調(diào)節(jié)黃芩水提液的pH分別為4、5、6、7、8、9，相應(yīng)pH的無(wú)菌水溶液作對(duì)照，用金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作指示菌，測(cè)量并比較抑菌圈大小。

1.2.3.3溫度對(duì)黃芩水提液抑菌能力的影響。取部分黃芩水提液分成2等份，分別置于28和4 ℃黑暗條件下儲(chǔ)藏。每隔10 d進(jìn)行一次抑菌試驗(yàn)，用大腸桿菌作指示菌，測(cè)量并比較抑菌圈大小。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析采用Excel 2010進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的整理、統(tǒng)計(jì)與作圖；用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用單因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD法進(jìn)行多重比較以及差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芩各萃取物的最低抑菌濃度由表1可見(jiàn)，各萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度分別為石油醚0.032 g/mL、氯仿0.063 g/mL、乙酸乙酯0.032 g/mL、正丁醇0.016 g/mL、水0.063 g/mL。由表2可見(jiàn)，各萃取物對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度分別為石油醚0.032 g/mL、氯仿0.063 g/mL、乙酸乙酯0.032 g/mL、正丁醇0.032 g/mL、水0.125 g/mL。結(jié)果顯示正丁醇萃取物對(duì)2種菌的抑菌效果最強(qiáng)，其他萃取物均有抑菌效果。黃芩中的主要有效成分為黃芩素、漢黃芩素、漢黃芩苷等苷類(lèi)化合物，此類(lèi)化合物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有明顯的抑菌作用。黃芩素等水溶性苷類(lèi)化合物大量存在于水層中，并被正丁醇萃取。黃芩及其有效成分具有廣譜的抗菌作用?？赡苁歉饔行С煞值臉O性不同而被不同的溶劑萃取，不同的有效成分抗菌效果不同。

表1 黃芩各萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑

表2 黃芩各萃取物對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑

2.2 不同萃取物抑菌效果的顯著性分析為了研究不同萃取物對(duì)細(xì)菌的抑制情況，取濃度為0.500 g/mL的黃芩各萃取液對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)，檢驗(yàn)結(jié)果如表3～4所示。

從表3可以看出，黃芩各萃取物中，正丁醇萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強(qiáng)，與石油醚、氯仿、乙酸乙酯和水萃取物的抑菌效果比較均有顯著差異；氯仿與水萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果較差；石油醚和乙酸乙酯萃取物的抑菌效果處于正丁醇和氯仿之間，石油醚對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果比乙酸乙酯的抑菌效果強(qiáng)，且具有顯著差異。

表3 黃芩各萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果的顯著性分析

從表4可以看出，黃芩各萃取物中，正丁醇萃取物對(duì)大腸桿菌的抑菌作用最強(qiáng)，與氯仿和水萃取物的抑菌效果比較均有顯著差異，而與石油醚和乙酸乙酯萃取物的抑菌效果無(wú)顯著差異；水萃取物對(duì)大腸桿菌的抑菌效果最差，氯仿萃取物對(duì)大腸桿菌的抑菌效果比水萃取物的強(qiáng)，與水萃取物的抑菌效果有顯著差異；石油醚和乙酸乙酯萃取物的抑菌效果處于正丁醇和氯仿萃取物之間，石油醚萃取物對(duì)大腸桿菌的抑菌效果比乙酸乙酯萃取物的抑菌效果強(qiáng)，但無(wú)顯著差異。

從表3和表4可看出，正丁醇萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果比其他相萃取物的抑菌效果強(qiáng)且較為明顯，而正丁醇萃取物對(duì)大腸桿菌的抑菌效果比氯仿和水萃取物的抑菌效果強(qiáng)且明顯，比石油醚和乙酸乙酯萃取物的抑菌效果強(qiáng)卻不明顯。由此可見(jiàn)，正丁醇對(duì)2種菌的抑菌作用均較強(qiáng)，可以從黃芩中提取并制成高效的抑菌類(lèi)藥物，其中對(duì)金黃色葡萄球菌一類(lèi)的革蘭氏陽(yáng)性菌抑菌作用較強(qiáng)；而其他萃取物的抑菌作用較差，但也可制成低效的抑菌類(lèi)藥物進(jìn)行合理利用，其中石油醚和乙酸乙酯萃取物對(duì)大腸桿菌的抑菌作用與正丁醇萃取物的相差不大，可制成對(duì)大腸桿菌的高效抑菌類(lèi)藥物。

表4 黃芩各萃取物對(duì)大腸桿菌抑菌效果的顯著性分析

2.3 黃芩水提液抑菌能力的穩(wěn)定性分析

2.3.1光照對(duì)黃芩水提液抑菌能力的影響。由圖1可知，太陽(yáng)光、紫外光和白熾燈光的照射使黃芩水提液的抑菌能力均有所降低，其中白熾燈光的照射對(duì)黃芩水提液的抑菌能力幾乎沒(méi)有影響，太陽(yáng)光的照射對(duì)黃芩水提液的抑菌能力有一定影響，紫外光次之，但幾種因素之間并沒(méi)有顯著差異。

圖1 不同光源的照射對(duì)黃芩水提液抑菌能力的影響Fig.1 Effect of irradiation with different light sources on bacteriostatic ability of aqueous extract of Radix Scutellariae

2.3.2pH對(duì)黃芩水提液抑菌能力的影響。由圖2可知，當(dāng)pH≤7時(shí)，黃芩水提液的抑菌能力隨著pH的升高而降低。當(dāng)pH>7時(shí)，黃芩水提液抑菌能力急劇下降?？赡苁菈A性條件下黃芩水提液的有效成分如黃芩素等不穩(wěn)定，被氧化而失去抑菌能力的緣故。

圖2 pH對(duì)黃芩水提液抑菌能力的影響Fig.2 Effect of pH on the antibacterial ability of aqueous extract of Radix Scutellariae

2.3.3溫度對(duì)黃芩水提液抑菌能力的影響。由圖3可知，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，黃芩水提液的抑菌能力逐漸減弱。其中28 ℃儲(chǔ)藏下的黃芩水提液的抑菌能力減弱趨勢(shì)較為明顯?？赡苁撬嵋褐杏行С煞峙c空氣中的氧氣發(fā)生作用，喪失抑菌能力，有效成分含量減少，使黃芩水提液的總體抑菌能力減弱。28 ℃下儲(chǔ)藏的黃芩水提液中有效成分與氧氣反應(yīng)的速率較4 ℃的快，有效成分的含量減少速率快，使黃芩水提液的總體抑菌能力減弱得快。但在20 d內(nèi)，兩者并沒(méi)有顯著差異。

圖3 溫度對(duì)黃芩水提液抑菌能力的影響Fig.3 Effect of storage at different temperatures on the bacteriostatic ability of aqueous extract of Radix Scutellariae

3 結(jié)論

該試驗(yàn)采用系統(tǒng)分離法對(duì)黃芩水提液進(jìn)行系統(tǒng)分離，獲得石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取物，并將各萃取物進(jìn)行抑菌作用比較分析。結(jié)果表明，各萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有抑菌作用，抑菌作用從大到小依次為正丁醇>石油醚>乙酸乙酯>氯仿>水。同時(shí)，各萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用比大腸桿菌的抑菌作用稍強(qiáng)。

黃芩水提物在不同環(huán)境條件下的抑菌能力試驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芩水提物的抑菌能力在強(qiáng)光易減弱，可能是少部分有效成分因降解而失去藥效；黃芩水提物的抑菌能力在堿性條件下易減弱，可能是堿性條件下有效成分不穩(wěn)定，被氧化而失去抑菌能力；黃芩水提物的抑菌能力在室溫環(huán)境下比低溫較易減弱，可能是較高溫度是有效成分的氧化速率加快。因此，在制作和儲(chǔ)藏黃芩水提物類(lèi)抑菌藥品時(shí)，建議在酸性、避光和低溫環(huán)境下進(jìn)行。