基于轉(zhuǎn)錄組測序方斑東風(fēng)螺LPS刺激的免疫機(jī)制研究

陳宗發(fā)，洪雨潔，趙明明，王 菁，王忠良

(廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東湛江 524088)

方斑東風(fēng)螺(Babyloniaareolata)俗稱花螺，屬軟體動物門腹足綱前鰓亞綱新腹足目蛾螺科東風(fēng)螺屬[1]，主要分布于環(huán)西太平洋。其生產(chǎn)周期短，具有肉質(zhì)勁道、味道鮮美、營養(yǎng)價值豐富等優(yōu)點(diǎn)[2]。但是隨著方斑東風(fēng)螺養(yǎng)殖的快速發(fā)展，育苗與養(yǎng)殖過程中病害暴發(fā)日趨嚴(yán)重[3]，其病害主要以革蘭陰性菌感染為主[4-6]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性菌細(xì)胞壁外膜結(jié)構(gòu)的重要組分，可作用于不同生物細(xì)胞而表現(xiàn)出多種生物活性[7]。朱璐璐[8]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加LPS能提高凡納濱對蝦對WSSV和副溶血弧菌的抵抗力，周妍英等[9]研究發(fā)現(xiàn)，脂多糖可以誘導(dǎo)河南華溪蟹提高血淋巴細(xì)胞酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、溶菌酶活性和酚氧化酶活性，從而增強(qiáng)其免疫能力，被廣泛應(yīng)用于水生動物的免疫學(xué)研究，揭示LPS刺激對方斑東風(fēng)螺轉(zhuǎn)錄組的影響，有助于培育抗病品種。

轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)是一種利用深度測序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析的方法[10]。轉(zhuǎn)錄組是隨著生物生長發(fā)育階段、生理狀態(tài)和外界環(huán)境的改變而變化的[11]，因此轉(zhuǎn)錄組測序在水生生物的生長[12]、免疫[13]、適應(yīng)[14]等方面的研究中得到了廣泛應(yīng)用。吳勇等[15]通過RNA-seq測序研究馬氏珠母貝(Pinctadafucata)血細(xì)胞中存在的補(bǔ)體系統(tǒng)組分，結(jié)果表明其補(bǔ)體系統(tǒng)可能通過凝集素途徑或替代途徑發(fā)揮生物學(xué)功能；張中日[16]通過轉(zhuǎn)錄組測序分析得出，氰氟草酯使斑馬魚(Brachydanioreriovar)的差異表達(dá)基因在藥物等代謝途徑、代謝-細(xì)胞色素P450、抗生素的生物合成和外來物質(zhì)的代謝等途徑明顯富集；張恒澤等[17]通過轉(zhuǎn)錄組測序，揭示了大黃魚(Larimichthyscrocea)對致病性假單胞菌(LAV)的免疫應(yīng)答機(jī)制，LAV免疫有效激發(fā)魚體的細(xì)胞免疫應(yīng)答,有助于快速清除胞內(nèi)病原。筆者以方斑東風(fēng)螺為試驗(yàn)對象，經(jīng)LPS注射后，利用 RNA-seq 技術(shù)獲得轉(zhuǎn)錄本后，通過DEGs的表達(dá)分析和功能富集分析，揭示LPS調(diào)控方斑東風(fēng)螺DEGs的功能和通路。該研究有助于全面深入了解細(xì)菌對方斑東風(fēng)螺發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，為方斑東風(fēng)螺的遺傳改良提供理論基礎(chǔ)，對其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展有現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料方斑東風(fēng)螺購自廣東省湛江市某東風(fēng)螺養(yǎng)殖場，平均體質(zhì)量為25 g，于實(shí)驗(yàn)室海水桶中暫養(yǎng)7 d(80 L,25 ℃)。將方斑東風(fēng)螺隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對照組，試驗(yàn)組對方斑東風(fēng)螺注射100 μL 0.5 mg/mL LPS懸浮液，對照組注射同體積的pH 7.0的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)，分別于刺激后4、8 h(分別記為LPS-4 h、LPS-8 h組)采集各組足組織樣品，于液氮中速凍，置-80 ℃下保存，用于轉(zhuǎn)錄組分析。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測序轉(zhuǎn)錄組文庫的制備及測序由廣州基迪奧生物科技有限公司完成。使用TRIzol法提取總RNA，利用NanoDrop 2000檢測所提RNA的純度，利用Agilent 2100檢測所提RNA的濃度，同處理組10個個體樣本合并后進(jìn)行建庫測序，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA。加入fragmentation buffer將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物(random hexamers)合成第1條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第2條cDNA鏈，經(jīng)過QiaQuick PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫后進(jìn)行末端修復(fù)、加poly(A)并連接測序接頭，然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建好的測序文庫用Illumina HiSeqTM2000進(jìn)行測序，測序讀長為雙端150 bp。

1.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析測序儀產(chǎn)生的原始圖像數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)(raw reads)，經(jīng)過初步的過濾后得到質(zhì)控數(shù)據(jù)(clean date或clean reads)，再對下機(jī)的clean reads去除含有帶接頭、重復(fù)、測序質(zhì)量很低的reads，最后得到高質(zhì)量的質(zhì)控數(shù)據(jù)(clean reads)。通過Trinity[18]軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組從頭組裝。通過BLAST[19]將Unigene序列比對到蛋白數(shù)據(jù)庫nr、SwissProt、KEGG和COG/KOG(evalue<1×10-5)，得到與給定Unigene具有最高序列相似性的蛋白，從而得到該Unigene的蛋白功能注釋信息。

1.4 差異表達(dá)基因(DEGs)分析采用短reads比對軟件Bowtie2[20]將高質(zhì)量質(zhì)控數(shù)據(jù)與參考基因序列進(jìn)行對比，根據(jù)對比結(jié)果，使用RPKM法(Reads Per kb per Million reads)計算Unigene的表達(dá)量。利用edgeR[21]進(jìn)行RNA-seq數(shù)據(jù)成對樣本之間或組間的差異表達(dá)分析，獲得不同時間梯度的DEGs。在篩選過程中，利用FDR與log2FC篩選DEGs，篩選條件為FDR<0.05且|log2FC|>1。得到DEGs后，對DEGs進(jìn)行GO功能注釋分析及KEGG Pathway富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果統(tǒng)計及質(zhì)量評估用Illumina HiSeqTM2000分別對方斑東風(fēng)螺LPS空白對照組(BLANK)、LPS刺激4 h后取樣組(LPS-4 h)和LPS刺激8 h后取樣組(LPS-8 h)測序，共構(gòu)建了3個轉(zhuǎn)錄組文庫，共獲得81 773條unigenes，序列平均長度681 bp，序列長度中位數(shù)(N50)為1 035 bp,每組GC含量為46.15%～47.81%，過濾后的clean reads在97.58%～97.74%， Q20均不小于98.49%， Q30均不小于95.40%(表1)，說明測序質(zhì)量良好，能進(jìn)行后續(xù)的數(shù)據(jù)分析[22]。從長度分布(圖1)與GC含量等方面對unigenes進(jìn)行評估，數(shù)據(jù)顯示測序質(zhì)量好，可信度高。

表1 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)評估統(tǒng)計

圖1 方斑東風(fēng)螺unigenes的長度分布Fig.1 Length distribution of unigene sequence in B.areolata

2.2 Unigene功能注釋使用4大數(shù)據(jù)庫(KOG、Nr、Swiss-Prot和KEGG)注釋方斑東風(fēng)螺轉(zhuǎn)錄組unigenes，分別對應(yīng)有13 256、21 702、15 335和11 417條unigenes獲得注釋。其中，9 280條unigenes在以上所有數(shù)據(jù)庫中同時注釋成功，21 938條unigenes至少被1個數(shù)據(jù)庫注釋。

通過轉(zhuǎn)錄組測序中的unigenes與GO數(shù)據(jù)庫的比對，得知在被unigenes注釋的47個功能條目中，包括生物功能(生長、定位等)、細(xì)胞組分(細(xì)胞器、高分子配合物等)、分子功能(裝訂、運(yùn)輸?shù)?3個亞類。分析顯示，生物功能含19個功能條目，細(xì)胞組分含17個功能條目，分子功能含11個條目(圖2)。

圖2 方斑東風(fēng)螺GO功能注釋圖Fig.2 GO function annotation of B.areolata

2.3 DEGs分析KEGG數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示，DEGs富集在5個A級KEGG通路,33個B級KEGG通路,232個C級KEGG通路中。其中，5個A級KEGG通路分別為新陳代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細(xì)胞進(jìn)程和有機(jī)系統(tǒng)。在232個C級KEGG通路(表2)中，共富集到5 141個基因，其中參與代謝通路的基因數(shù)量最多，共有1 455個(28.30%)，參與次生代謝物的生物合成的基因有447個(8.69%)，參與核糖體的基因有384個(7.47%)，參與內(nèi)吞作用的基因有300個(5.84%)，參與抗生素生物合成的基因有276(5.37%)，參與泛素介導(dǎo)的蛋白水解的基因有261個(5.08%)。

表2 方斑東風(fēng)螺轉(zhuǎn)錄組Unigene的KEGG功能分類統(tǒng)計(前10個)

利用edgeR[21]進(jìn)行RNA-seq數(shù)據(jù)成對樣本之間或組間的差異表達(dá)分析，利用FDR與log2FC篩選DEGs，篩選條件為FDR<0.05且|log2FC|>1。在BLANK vs.LPS-4 h時，顯著DEGs的表達(dá)情況為：9 096個顯著DEGs中4 754個上調(diào)，4 342個下調(diào)；在BLANK vs.LPS-8 h時，顯著DEGs的表達(dá)情況為：10 335個顯著DEGs中4 631個上調(diào)，5 704個下調(diào)；在LPS-4 h vs.LPS-8 h時，表達(dá)情況為：8 756個顯著DEGs中3 475個上調(diào)，5 281個下調(diào)(圖3)。

圖3 樣品間DEGs統(tǒng)計Fig.3 Statistics of DEGs between samples

2.4 DEGs的GO和KEGG注釋在DEGs的GO分類圖(圖4)中，橫坐標(biāo)為二級GO term，縱坐標(biāo)為該term的基因數(shù)量，紅色代表基因上調(diào)，綠色代表基因下調(diào)。結(jié)果顯示，在BLANK vs.LPS-4 h組中，在生物功能中，細(xì)胞過程(cellular process)、代謝過程(metabolic process)和單組織過程(Single organism process)基因的上調(diào)與下調(diào)較多；在細(xì)胞組分中，細(xì)胞(Cell)、細(xì)胞部分(cell part)和細(xì)胞器(organelle)基因的上調(diào)與下調(diào)較多；而在分子功能中，基因的上調(diào)與下調(diào)主要集中在綁定(binding)、催化活性(catalytic activity)方面(圖4a)。在BLANK vs.LPS-8 h組中，在生物功能中，細(xì)胞過程(cellular process)、代謝過程(metabolic process)和單組織過程(single organism process)基因的上調(diào)與下調(diào)較多；在細(xì)胞組分中，細(xì)胞(cell)、細(xì)胞部分(cell part)、大分子配合物(macromolecular complex)和細(xì)胞器(organelle)的上調(diào)與下調(diào)較多；而在分子功能中，基因的上調(diào)與下調(diào)主要集中在綁定(binding)、催化活性(catalytic activity)方面(圖4b)。在LPS-4 h vs.LPS-8 h組中，在生物功能中，細(xì)胞過程(cellular process)、代謝過程(metabolic process)和單組織過程(single organism process)基因的上調(diào)與下調(diào)較多；在細(xì)胞組分中，細(xì)胞(cell)、細(xì)胞部分(cell part)、大分子配合物(macromolecular complex)和細(xì)胞器(organelle)的上調(diào)與下調(diào)較多；而在分子功能中，基因的上調(diào)與下調(diào)主要集中在綁定(binding)、催化活性(catalytic activity)方面(圖4c)。

圖4 BLANK vs.LPS-4 h(a)、BLANK vs.LPS-8 h(b)和LPS-4 h vs.LPS-8 h(c)的差異基因GO分類圖Fig.4 GO classification maps of differential genes BLANK vs.LPS-4 h (a),BLANK vs.LPS-8 h (b) and LPS-4 h vs.LPS-8 h(c)

對BLANK、LPS刺激4 h和8 h的DEGs進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示，在BLANK vs.LPS-4 h組中，在心肌收縮、神經(jīng)活性配體受體相互作用和代謝途徑等201個通路中，共富集到506個DEGs(圖5a)；在BLANK vs.LPS-8 h組中，在谷胱甘肽代謝、核糖體和神經(jīng)活性配體受體相互作用等191個通路中，共富集到551個DEGs(圖5b)；在LPS-4 h vs.LPS-8 h組中，在DNA復(fù)制、神經(jīng)活性配體受體相互作用和鞘糖脂生物合成等173個代謝通路中，共富集到414個DEGs(圖5c)。

圖5 BLANK vs.LPS-4 h(a)、BLANK vs.LPS-8 h(b)和LPS-4 h vs.LPS-8 h(c)的KEGG富集氣泡圖Fig.5 KEGG classification maps of differential genes BLANK vs.LPS-4 h (a),BLANK vs.LPS-8 h (b) and LPS-4 h vs.LPS-8 h(c)

根據(jù)DEGs的GO功能分類和KEGG富集分析，篩選到NOD樣受體信號通路、趨化因子信號通路、B細(xì)胞受體信號通路、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)反應(yīng)、Fc蛋白RI信號通路、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、T細(xì)胞受體信號通路、toll樣受體信號通路、rig-i樣受體信號通路、血小板激活、造血細(xì)胞系通路和抗原的處理和呈遞等免疫信號通路。

3 討論

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是研究特定細(xì)胞、組織或器官在特定生長發(fā)育階段或某種生理狀況下所有轉(zhuǎn)錄本的學(xué)科[10]，基于RNA-seq的轉(zhuǎn)錄組分析在許多水生生物研究中得到應(yīng)用，如李喜蓮等[23]通過RNA-seq研了羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)不同組織的轉(zhuǎn)錄組差異；王菁等[24]通過轉(zhuǎn)錄組測序挖掘了方斑東風(fēng)螺(Babyloniaareolata)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)。該研究利用RNA-seq技術(shù)，對方斑東風(fēng)螺進(jìn)行了無參轉(zhuǎn)錄組測序，得到81 773個unigenes，其中得到注釋的基因數(shù)總共為21 938個，注釋率為26.83%，注釋率較低的原因可能是與方斑東風(fēng)螺相近的物種在公共數(shù)據(jù)庫中收錄較少，其他無脊椎動物也有注釋率較低的情況，如克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)的卵巢、肝胰腺和肌肉組織只有30.1%的基因得到注釋[13]。該研究得到的unigenes與Nr數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果顯示，與在公共數(shù)據(jù)庫中已注冊的方斑東風(fēng)螺序列匹配的unigenes僅有0.014%，這說明目前公共數(shù)據(jù)庫中仍缺乏方斑東風(fēng)螺的基因信息，該研究是對方斑東風(fēng)螺基因信息庫的有力補(bǔ)充。免疫調(diào)控機(jī)制一直是貝類研究的熱點(diǎn)，已有研究報道，貝類的免疫受到免疫細(xì)胞、體液和化學(xué)遞質(zhì)等的綜合調(diào)控[22]。

該試驗(yàn)中，BLANK vs.LPS-4 h組的DEGs顯著富集至NOD樣受體信號通路，在NOD樣受體信號通路中篩選到半胱天冬酶8(caspase 8; CASP 8)、半胱天冬酶募集域家族9(caspase recruitment domain-containing protein 9; CARD 9)和含有桿狀病毒IAP重復(fù)序列的蛋白質(zhì)2/3(baculoviral IAP repeat-containing protein 2/3; BIRC2_3)。caspase是一類具有天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶，參與所有凋亡通路的級聯(lián)反應(yīng)，是細(xì)胞凋亡的核心[25]。Caspase 8是外源性細(xì)胞凋亡途徑的關(guān)鍵啟動子，caspase 8酶原通過其上的DED與FADD(fasassoclated death domain protein)的DED相結(jié)合形成多聚體，將caspase 8酶原招募到細(xì)胞質(zhì)膜上，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物DISC(death inducing signaling complex)，在復(fù)合物中進(jìn)而形成有活性的caspase 8，發(fā)生caspase級聯(lián)反應(yīng)，啟動細(xì)胞凋亡[26]。CARD 9可與開放的Apaf-1結(jié)合，進(jìn)而與大小亞基結(jié)合，使caspase 9得到活化，啟動細(xì)胞凋亡[27]。BIRC2_3是凋亡相關(guān)基因,其編碼的蛋白可抑制細(xì)胞凋亡，其中凋亡抑制因子(IAP)是通過抑制半胱天冬酶(caspases)的活性而起到抑制凋亡的作用[28]。有研究者從盤紋羅鮑(Haliotisdiversicolor)中鑒定出了caspase-3-like(saCASP-3lp)基因，并且進(jìn)一步研究表明saCASP-3lp可能是sacaspase-8上游的調(diào)節(jié)分子，并參與細(xì)胞凋亡過程[29]。在BLANK vs.LPS-4 h組的BIRC2_3呈上調(diào)，其通過受體相互作用的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶2(receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 2；RIPK2)激活CASP 8和CARD 9，CASP 8和CARD 9同樣參與了細(xì)胞凋亡過程，其中CARD 9激活了p38、JNK，最終激活MAPK通路，促進(jìn)促炎因子的釋放，參與了細(xì)胞的凋亡過程[27]。在BLANK vs.LPS-8 h組，免疫相關(guān)DEGs同樣顯著富集至NOD樣受體信號通路，但在NOD樣受體信號通路中除了篩選到CARD 9和BIRC2_3，還篩選到了熱休克蛋白90α(molecular chaperone 90 A；HSP90α)。HSPs是一類進(jìn)化上高度保守的蛋白，可以增強(qiáng)細(xì)胞對應(yīng)激的反應(yīng)能力[30]。有研究發(fā)現(xiàn)，縊蟶(Sinonovaculaconstricta)[30]、菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)[31]在受到脅迫后HSP90發(fā)生顯著變化。在該試驗(yàn)中，HSP90α在方斑東風(fēng)螺受到LPS刺激后亦發(fā)生顯著變化，說明HSP90α在LPS刺激后的免疫反應(yīng)中發(fā)揮了作用。

在該試驗(yàn)中，BLANK vs.LPS-8 h組的DEGs顯著富集到趨化因子信號通路。趨化因子(chemokine)是機(jī)體重要的免疫調(diào)節(jié)因子，可協(xié)調(diào)免疫細(xì)胞遷移[32]。范婷婷[33]在短蛸(Octopusocellatus)幼體對鰻弧菌(Vibrioanguillarum)感染應(yīng)答中發(fā)現(xiàn)有3個差異表達(dá)基因(Gai、PLCβ、β-arrestin)在趨化因子信號通路富集。該試驗(yàn)中，有PKA、SOS(son of sevenless)、CDC42(cell division control protein 42)差異表達(dá)基因在趨化因子信號通路富集。其中CDC42和Rac1是PAK的主要激活劑，通過調(diào)控PKA的表達(dá)來抑制肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)[34]。從而達(dá)到清除病原體和促進(jìn)創(chuàng)傷組織愈合，維持組織細(xì)胞的平衡的目的[33]，表明該信號通路可能在方斑東風(fēng)螺免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。

在BLANK vs.LPS-4 h組的DEGs除了顯著富集至趨化因子信號通路，還富集至B細(xì)胞受體信號通路、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)反應(yīng)、Fc蛋白RI信號通路、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、T細(xì)胞受體信號通路、toll樣受體信號通路、rig-i樣受體信號通路、血小板激活和抗原的處理和呈遞等免疫相關(guān)KEGG通路，這些通路均與化學(xué)遞質(zhì)的傳遞有關(guān)，在這些通路中篩選出了一些免疫相關(guān)的基因，如Ras 相關(guān)C3肉毒桿菌毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1；Rac1)、熱休克蛋白70(heat shock 70kDa protein 1/2/6/8；HSPA1s)、α-1-抗胰蛋白酶(alpha-1-antitrypsin；Serpina1b)和蛋白激酶A(protein kinase A[EC:2.7.11.11]；PKA)。其中，Rac1不僅與PAK參與了MARK通路的激活，還通過JNK通路來激活炎癥反應(yīng)，從而在由免疫球蛋白受體所介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞吞噬作用中起著關(guān)鍵作用[35]。

在LPS-4 h vs.LPS-8 h組的DEGs還富集至抗原的處理和呈遞通路、NOD樣受體信號通路、造血細(xì)胞系和Toll樣受體信號通路等免疫信號通路。其中，抗原的處理和呈遞通路篩選到HSP70、HSP90α差異表達(dá)基因。其中，HSP90α基因還被富集至NOD樣受體信號通路、PI3K-Akt信號通路等。與試驗(yàn)組LPS-4 h組相比，HSP90α表達(dá)量下降。在NOD樣受體信號通路中，除了篩選到HSP90α基因，還篩選到BIRC2_3基因。與試驗(yàn)組LPS-4 h組相比，BIRC2_3的表達(dá)量差異不顯著，在4 h時表達(dá)量最大。在Toll樣受體信號通路中篩選到Rac1。與試驗(yàn)組LPS-4 h組相比，Rac1表達(dá)量下降，在4 h 時表達(dá)量最大。在造血細(xì)胞系通路中篩選到低親和力免疫球蛋白εFc受體(low affinity immunoglobulin ε Fc receptor；FCER2)。Ren等[36]在鰻弧菌感染下菲律賓蛤仔肝胰腺轉(zhuǎn)錄組分析中，同樣發(fā)現(xiàn)了8個DEGs在造血細(xì)胞系通路中。

該試驗(yàn)注釋到了僅存在于脊椎動物中的特定通路和同源基因，如造血細(xì)胞系通路、抗原處理和呈遞通路。這些通路和基因的進(jìn)化關(guān)系和免疫相關(guān)功能將是未來幾年的主要研究領(lǐng)域。

4 結(jié)論

根據(jù)GO功能分類和KEGG信號通路分析篩選到NOD樣受體信號通路、趨化因子信號通路、B細(xì)胞受體信號通路、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)反應(yīng)、Fc蛋白RI信號通路、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、T細(xì)胞受體信號通路、toll樣受體信號通路、rig-i樣受體信號通路、血小板激活、造血細(xì)胞系通路和抗原的處理和呈遞等免疫信號通路以及大量與方斑東風(fēng)螺免疫相關(guān)的候選基因，如Birc3、Rac1、hsps-1、Serpina1b、Casp8、BIRC2、TPK3、TP02_0244、ACT1、Fcer2、Diap2、Cdc42-、CARD11、actc1和HSP70等。該研究結(jié)果豐富了方斑東風(fēng)螺的基因資源，可為方斑東風(fēng)螺的免疫研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。