正交試驗(yàn)法優(yōu)選液體發(fā)酵云芝糖肽提取工藝條件

李 巖

（廣東嶺南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東廣州 510663）

云芝糖肽（Posaverptidum）是從多孔菌科（Polyporaceae）云芝屬（Polystictus）真菌云芝（Coriolus versicolorL.ex.Fr.）（菌株Cov-1）的菌絲體中提取的高分子糖肽聚合物[1-3]，具有補(bǔ)益精氣、健脾養(yǎng)心的功效，對(duì)細(xì)胞免疫功能和血象有一定的保護(hù)作用，可用于食管癌、胃癌及原發(fā)性肺癌患者放療、化療所致的氣陰兩虛，已開發(fā)為中成藥[4-6]。

目前，云芝糖肽通常采用液體發(fā)酵培養(yǎng)，因?yàn)橐后w發(fā)酵具有高效生產(chǎn)、萃取工藝簡(jiǎn)便、萃取成本低等特點(diǎn)[7-9]。已報(bào)道的云芝糖肽的提取方法有水提法、水提醇沉法、酶制劑提取法、超聲提取法和微波提取法等，其中水提醇沉法因操作簡(jiǎn)便且安全而被廣泛使用[10]。為提高液體發(fā)酵云芝糖肽的提取率，本文以云芝糖肽含量為指標(biāo)，采用單因素和正交試驗(yàn)法對(duì)液體發(fā)酵的云芝進(jìn)行水提醇沉工藝優(yōu)化，采用苯酚-硫酸法進(jìn)行云芝糖肽含量的測(cè)定，從而篩選出高提取率的提取方法。

1 材料與方法

1.1 菌種

云芝菌種由本實(shí)驗(yàn)室保存，培養(yǎng)條件為轉(zhuǎn)速150 r·min-1，溫度28 ℃，裝液量100 mL/250 mL 三角瓶，培養(yǎng)96 h。

1.2 發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖30 g、玉米粉15 g、豆餅粉20 g、麩皮 7.5 g、磷酸二氫鉀3 g、蛋白胨1 g、硫酸鎂0.2 g，用水定容至1 L，滅菌后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 儀器與試劑

BSA224S 型電子天平，賽多利斯上海貿(mào)易有限公司；CARY 300Conc 型紫外可見分光光度計(jì)，美國(guó)Varina 公司；BSI-3 型恒溫培養(yǎng)搖床，上海貝茵生物科技有限公司；FSSJG 型高壓滅菌鍋，歐業(yè)食品工業(yè)裝備（諸城）有限公司；PHSJ-3F 型pH 計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；HHS 型電熱恒溫水浴鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；葡萄糖、鹽酸、氫氧化鈉、蒽酮、硫酸和乙醇，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 水提醇沉法提取云芝糖肽單因素試驗(yàn)

將云芝置于三角瓶中，以云芝糖肽提取率為指標(biāo)，按照一定料液比加入蒸餾水，經(jīng)一定溫度水浴提取一定時(shí)間后，趁熱抽濾至澄清，濾液濃縮后加入4 倍體積無水乙醇，于4 ℃靜置過夜，3 000 r·min-1離心30 min，沉淀即為云芝糖肽。

1.4.2 正交試驗(yàn)法優(yōu)化云芝糖肽提取工藝

選取提取時(shí)間（A）、料液比（B）、提取溫度（C）和提取次數(shù)（D）為考察因素，以云芝糖肽提取率為指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，選用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

1.4.3 云芝糖肽含量的測(cè)定

參考李巖等[5]的方法采用苯酚-硫酸法進(jìn)行云芝糖肽含量的測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)云芝糖肽提取率的影響

分別考察不同提取時(shí)間（30 min、60 min、 90 min、120 min、150 min 和180 min）對(duì)云芝糖肽提取率的影響。由表2 可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，云芝糖肽提取率逐漸升高，當(dāng)提取時(shí)間超過120 min 后，云芝糖肽提取率逐漸趨于平衡穩(wěn)定，不再提高。故水提醇沉法提取云芝糖肽的時(shí)間選 擇120 min。

表2 提取時(shí)間對(duì)云芝糖肽提取率的影響

2.1.2 料液比對(duì)云芝糖肽提取率的影響

分別考察不同料液比（10 g·L-1、20 g·L-1、30 g·L-1、50 g·L-1、100 g·L-1和150 g·L-1）對(duì)云芝糖肽提取率的影響。由表3 可知，隨著料液比的增加，云芝糖肽提取率逐漸升高，當(dāng)料液比≥100 g·L-1時(shí)，云芝糖肽提取率逐漸趨于平衡穩(wěn)定，若繼續(xù)增大料液比，對(duì)后續(xù)提取工序增加難度。故水提醇沉法提取云芝糖肽的料液比選擇100 g·L-1。

表3 料液比對(duì)云芝糖肽提取率的影響

2.1.3 提取溫度對(duì)云芝糖肽提取率的影響

分別考察不同提取溫度（45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃、85 ℃和95 ℃）對(duì)云芝糖肽提取率的影響。由表4 可知，隨著提取溫度的增加，云芝糖肽提取率逐漸升高，當(dāng)提取溫度超過85 ℃時(shí)，云芝糖肽提取率下降。故選擇85 ℃作為最適提取溫度。

表4 提取溫度對(duì)云芝糖肽提取率的影響

2.1.4 提取次數(shù)對(duì)云芝糖肽提取率的影響

分別考察不同提取次數(shù)（1 次、2 次、3 次和4 次）對(duì)云芝糖肽提取率的影響。由表5 可知，隨著提取次數(shù)的增加，云芝糖肽提取率逐漸升高，當(dāng)提取次數(shù)超過2 次時(shí)，云芝糖肽提取率增長(zhǎng)情況逐漸趨于平衡，故提取次數(shù)選擇2 次。

表5 提取次數(shù)對(duì)云芝糖肽提取的影響

2.2 正交試驗(yàn)法優(yōu)化云芝糖肽提取工藝

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)的結(jié)果，并綜合考慮各因素經(jīng)濟(jì)成本和效益，以云芝糖肽提取率為試驗(yàn)指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別考察提取時(shí)間（A）、料液比（B）、提取溫度（C）和提取次數(shù)（D）對(duì)云芝糖肽提取率的影響，優(yōu)化水提醇沉法工藝參數(shù)，具體結(jié)果見表6。由表6 可知，根據(jù)極差R值對(duì)云芝糖肽提取率的影響排序?yàn)樘崛r(shí)間＞料液比＞提取溫度＞提取次數(shù)；云芝糖肽的最佳水提醇沉法工藝為A2B3C3D3，即提取時(shí)間120 min、液料比150 g·L-1、提取溫度 95 ℃、提取次數(shù)3 次。由表7 可知，提取時(shí)間對(duì)水提醇沉法提取云芝糖肽的提取率有顯著影響 （P＜0.05），而料液比、提取溫度和提取次數(shù)對(duì)其無顯著性影響（P＞0.05）；在最優(yōu)提取條件下，云芝糖肽得率為4.2%，此工藝可為功效活性成分云芝糖肽的工業(yè)化提取及應(yīng)用提供技術(shù)參考。

表6 正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

表7 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方差分析

3 結(jié)論

本文以云芝糖肽提取率為指標(biāo)，并采用正交試驗(yàn)法對(duì)液體發(fā)酵的云芝進(jìn)行水提醇沉工藝優(yōu)化，采用苯酚-硫酸法進(jìn)行云芝糖肽含量的測(cè)定，從而篩選出高提取率的提取方法。結(jié)果顯示，水提醇沉法提取云芝糖肽工藝中，提取時(shí)間對(duì)云芝糖肽提取率具有顯著影響（P＜0.05），而料液比、提取溫度和提取次數(shù)對(duì)其無顯著性影響（P＞0.05）；液體發(fā)酵云芝糖肽的最佳水提醇沉提取工藝為提取時(shí)間 120 min、 液 料 比150 g·L-1、 提 取 溫 度95 ℃、提取次數(shù)3 次，在此條件下，云芝糖肽得率為4.2%，此工藝為功效成分云芝糖肽的工業(yè)化提供 參考。