基于褪黑素的分子探針在膠質(zhì)母細胞瘤成像中的研究

萬家穎，王銀

作者單位武漢市第一醫(yī)院（武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院）a.腎病內(nèi)科，b.檢驗科 武漢430022

膠質(zhì)母細胞瘤是復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率和致死率極高的疾病[1]。經(jīng)過治療患者的生存期大多仍然只有14 個月，5 年總體生存率不足5%[2]。因此，早期精準(zhǔn)診斷及評估腫瘤的侵襲性對提高患者生存率具有重要的臨床意義。褪黑素（melatonin，MT）是由腦松果體分泌的激素之一，化學(xué)名為N-乙?；?5甲氧基色胺（Methoxytryptamine，MT）。MT 是一種膠質(zhì)母細胞瘤靶向藥物，能夠有效的抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[3]，臨床實驗也證實了MT可以改善膠質(zhì)母細胞瘤患者的生存率[4]。因此，本研究選擇MT作為膠質(zhì)母細胞瘤的靶向配體，將其與近紅外染料Cy5偶聯(lián)制備膠質(zhì)母細胞瘤成像探針，并在細胞水平評價探針對膠質(zhì)母細胞瘤的靶向性以及成像效果，以期為膠質(zhì)母細胞瘤的精準(zhǔn)成像提供參考探針。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

1.1.2 主要試劑和儀器 5-MT 和二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購于北京伊諾凱科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基購于上海帝博思生物科技有限公司；胎牛血清購于美國Gibco公司；人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞（U87）和人腦星型膠質(zhì)細胞（HEB）分別購于國家生物醫(yī)學(xué)實驗室細胞資源庫以及湖南豐暉生物科技有限公司；MTT 試劑盒購于Sigma 公司。ELx800型酶標(biāo)儀購于Biotek公司；BSA124S型電子分析天平購于賽多利斯公司；C6型流式細胞儀購于BD 公司；激光共聚焦顯微鏡購于蔡司公司。

1.2 方法

1.2.1 探針合成 將5-MT（3.8 mg，20 μM）和Cy5-NHS（11.6 mg，20 μM）溶解到2 mLDMSO中，室溫攪拌5 min后，加入三乙胺（6.1 mg，60 μM），在室溫下繼續(xù)反應(yīng)12 h，然后將反應(yīng)液進行冷凍干燥，粗產(chǎn)物用高效液相色譜進行分離（流動相：85%甲醇/15%水，V/V），得到綠色的粉末（12.1 mg，92.8%），見圖1。

圖1 探針Cy5-MT的合成路線

1.2.2 體外細胞毒性實驗 取對數(shù)生長期的U87細胞以及HEB 細胞，胰酶消化后接種到96 孔板中，細胞密度約為1×104個/孔，每孔加入DMEM 100 μL，空白對照不加入細胞。將96 孔板置于5%CO2和37℃的培養(yǎng)箱中孵育12 h，棄去培養(yǎng)基，每孔分別加入200μL濃度為0、0.5、1、10、20、50、100 和200 μmol/L 的探針，空白對照組只加入200μL的培養(yǎng)基。隨后，將96孔板在細胞培養(yǎng)箱中分別繼續(xù)孵育24 h和48 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入20 μL 5 mg/mL 的MTT 溶液和100 μL 培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，再在每孔加入150 μL 的DMSO，在搖床上震蕩15 min，使結(jié)晶物充分的溶解。使用酶標(biāo)儀在波長為490 nm處測定每孔吸光度（OD）值，計算細胞在不同濃度探針孵育下的存活率：

1.2.3 流式細胞實驗 取對數(shù)生長期的U87 和HEB 細胞，胰酶消化后接種到6 孔板中，細胞密度約5×105個/孔，在培養(yǎng)箱中孵育12 h 后加入濃度為0、0.25、0.50、1.00、5.00 μM 的探針Cy5-MT 或Cy5 孵育3 h，隨后將細胞用PBS洗滌3次，用胰酶消化后離心收集細胞，用BD 流式細胞儀進行測試，分析U87 細胞和HEB細胞對Cy5-MT探針的百分?jǐn)z取率。

1.2.4 激光共聚焦成像實驗 取對數(shù)生長期的U87細胞，胰酶消化后接種到小皿中，細胞密度約為500個/皿。將細胞在培養(yǎng)箱中孵育12 h 后加入0.25 μM Cy5-MT或0.25 μM Cy5孵育3 h，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定細胞，PBS 洗滌3 次，0.2%Triton-100 破膜20 min，PBS洗滌3次，3%BSA封閉1 h，PBS 洗滌3 次，5 g/mL的DAPI 染核3 min，PBS 洗滌3 次，加入防淬滅劑。Zeiss710激光共聚焦顯微鏡進行觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 探針體外細胞毒性

MTT 實驗結(jié)果顯示，當(dāng)U87 和HEB 細胞與探針Cy5-MT 孵育24 h 和48 h 后，存活率均較高。即使在Cy5-MT 濃度為100 和200 μmol/L 的處理下，2 種細胞的存活率仍可達到80%以上，見表1。

表1 U87和HEB細胞與Cy5-MT探針孵育的存活率（±s）

表1 U87和HEB細胞與Cy5-MT探針孵育的存活率（±s）

探針濃度/(μmol/L)200 100 50 20細胞存活率/%50 24 h U87 84.6±1.9 88.8±6.9 95.5±0.7 92.2±6.7 91.2±4.3 100.0±7.9 HEB 87.0±1.3 89.7±2.7 95.4±4.0 95.6±2.5 96.4±3.6 100.0±2.3 48 h U87 84.2±5.1 93.8±8.2 91.9±2.1 91.6±4.0 95.4±7.5 100.0±0.6 HEB 85.2±1.9 88.5±5.3 94.7±8.6 92.0±7.2 97.3±5.2 100.0±7.9

2.2 腫瘤細胞對探針的攝取率

流式細胞檢測結(jié)果顯示，U87細胞對Cy5-MT探針的攝取百分率顯著高于Cy5（均P＜0.05），且U87細胞對Cy5-MT 探針的攝取百分率隨著探針Cy5-MT 濃度的增加而增加；當(dāng)Cy5-MT 的濃度為5 μmol/L 時，U87細胞對Cy5-MT 攝取率為99.9%。HEB 細胞對探針Cy5-MT 和Cy5 的攝取百分率低于U87 細胞（均P＜0.05），當(dāng)探針濃度為5 μmol/L和2.5 μmol/L時，HEB對Cy5-MT的攝取百分率高于Cy5，見表2。

表2 U87和HEB細胞對探針Cy5-MT和染料Cy5的攝取百分率（±s）

表2 U87和HEB細胞對探針Cy5-MT和染料Cy5的攝取百分率（±s）

注：與同一組細胞Cy5比較，①P＜0.05；與U87細胞對相同濃度Cy5-MT的攝取百分率比較，②P＜0.05

探針濃度/(μmol/L)5.00 2.50 1.00 0.50 0.25 0相對百分?jǐn)z取率/%U87 Cy5-MT 99.9±0.0①98.5±0.3①43.8±1.7①24.8±0.7①4.4±0.1①0.3±0.1 HEB Cy5-MT 59.9±8.1①②15.6±0.6①②2.7±1.1②0.9±0.6②0.5±0.4②0.1±0.1 Cy5 13.6±0.7 3.6±0.3 0.7±0.1 0.8±0.1 0.4±0.1 0.2±0.0 Cy5 49.7±0.1 2.8±0.6 0.9±0.3 0.5±0.2 0.4±0.1 0.3±0.1

2.3 探針體外細胞成像

與Cy5-MT 共同孵育后，U87 細胞對探針Cy5-MT（綠色熒光）有著明顯的攝取，實現(xiàn)了對腫瘤細胞成像；與Cy5 共同孵育后，U87 細胞對探針Cy5 的攝取顯著地減少，幾乎沒有攝取，見圖2。

圖2 探針Cy5-MT及Cy5對膠質(zhì)母細胞瘤U87的成像效果

3 討論

分子影像技術(shù)是在傳統(tǒng)影像學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展的新型成像技術(shù)，能夠在疾病早期在分子水平和細胞水平觀察體內(nèi)的生物過程，能夠?qū)崟r無創(chuàng)的監(jiān)測疾病的發(fā)展[5]。這種技術(shù)通過借助分子探針和成像設(shè)備能夠?qū)⑷庋鄄豢梢姷牟≡钸M行點亮，使得疾病組織能夠被精準(zhǔn)的檢測，在術(shù)中病灶能夠被精準(zhǔn)的切除。若在疾病的早期階段采用有效的分子影像技術(shù)提高疾病的診斷效率，將會顯著的提高患者的存活率，該技術(shù)尤其是在腫瘤早診的方面具有獨特的優(yōu)勢。分子影像技術(shù)的關(guān)鍵是開發(fā)出腫瘤高特異性、高靈敏的靶向探針，能夠精準(zhǔn)的對腫瘤進行成像[6]。目前已有數(shù)個探針被開發(fā)在臨床上用于腫瘤的精準(zhǔn)成像和手術(shù)導(dǎo)航。2011年van Dam等[7]開發(fā)了一種靶向葉酸α受體的近紅外探針實現(xiàn)了對卵巢癌患者癌變組織的精準(zhǔn)切除；2020年Hu等[8]采用熒光染料吲哚青綠（ICG）對肝癌患者的微小病灶和部分轉(zhuǎn)移灶組織實現(xiàn)了精準(zhǔn)的切除。

針對膠質(zhì)母細胞瘤的精準(zhǔn)診斷，目前也有多個靶向探針被報道。例如，2018 年有學(xué)者[9]以尿激酶型纖溶酶原激活物受體（uPAR）為靶標(biāo)，將uPAR 的靶向配體多肽AE105與近紅外二區(qū)染料CH1055偶聯(lián)制得了探針CH1055-4Glu-AE105。該探針不僅能夠精準(zhǔn)的對膠質(zhì)母細胞瘤進行成像，還能對膠質(zhì)母細胞瘤的術(shù)中切除提供指導(dǎo)。2019 年有學(xué)者[10]以整合素αvβ3 為靶點，將其配體多肽RWrNK與熒光染料Cy5制得了探針Cy5-RWrNK。在膠質(zhì)母細胞瘤的動物模型上，探針Cy5-RWrNK 也準(zhǔn)確地可視化了腫瘤組織。這些探針的研發(fā)有助于膠質(zhì)母細胞瘤的診療。但目前能在臨床用于膠質(zhì)母細胞瘤診療的探針卻很少，因為已報道的大部分探針存在生物相容性差、腫瘤成像對比度低等缺點。因此，臨床上亟需膠質(zhì)母細胞瘤的成像探針。

研究發(fā)現(xiàn)MT是對膠質(zhì)母細胞瘤具有高親和力的靶向配體[11]，本研究將其用熒光染料Cy5 進行標(biāo)記，構(gòu)建出膠質(zhì)母細胞瘤的成像探針Cy5-MT，并通過質(zhì)譜確證結(jié)構(gòu)。在細胞毒性實驗中發(fā)現(xiàn)，即使探針在200 μmol/L 的高濃度，對U87 和HEB 細胞的抑制率仍然低，提示探針Cy5-MT的毒性小，具有高的生物安全性。在流式細胞實驗中發(fā)現(xiàn)，探針Cy5-MT 在腫瘤細胞U87 中的攝取率比正常細胞HEB 高，表明探針Cy5-MT 能夠選擇性的靶向膠質(zhì)母細胞瘤細胞U87。在激光共聚焦實驗中，探針Cy5-MT 能夠特異性對膠質(zhì)母細胞瘤細胞U87 進行精準(zhǔn)成像。綜上所述，本研究對膠質(zhì)母細胞瘤的成像探針進行了探索，為該疾病的精準(zhǔn)診斷提供了一定的參考意義。