體外和體內(nèi)評價(jià)法分析苦杏仁油抗氧化能力

韓金承，孟 鑫，吳慎威，閆伊狄，陳瑞琦

（錦州醫(yī)科大學(xué)食品與健康學(xué)院，遼寧 錦州 121000）

氧化應(yīng)激反應(yīng)是指生物體氧化與抗氧化能力失衡的一種狀態(tài)[1]。當(dāng)生物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)無法與過量自由基結(jié)合時(shí)，過量的自由基會從鄰近的分子（如蛋白質(zhì)、脂肪酸、核酸等）上奪取電子，使機(jī)體組織產(chǎn)生不可逆的損傷，從而引起一系列如衰老、動脈粥樣硬化、腫瘤等問題[2-3]。因此食用天然抗氧化成分是對抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的有效手段之一。

苦杏仁油是從薔薇科植物杏的成熟干燥種子中經(jīng)提取得到的一種營養(yǎng)價(jià)值極高的植物油脂，其脂肪酸組成中約60%為油酸（順式-9-十八烯酸）[4]。科學(xué)家們研究發(fā)現(xiàn)，油酸具有極佳的抗氧化、延緩衰老和清除自由基的能力[5-6]。因此研究苦杏仁油在抗氧化方面的作用具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

目前常用的抗氧化能力測試方法有體外測試法和體內(nèi)測試法。體外測試法主要是測定物質(zhì)對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）、超氧陰離子自由基（）、羥自由基（·OH）等自由基的清除能力[7]；體內(nèi)測試法主要是通過建立動物模型，測定血清或部分器官中抗氧化酶類的活性和氧化代謝產(chǎn)物的含量來判斷物質(zhì)的抗氧化能力[8]。體外試驗(yàn)具有反應(yīng)迅速、試驗(yàn)周期短等優(yōu)點(diǎn)，但難以反映出體內(nèi)真實(shí)的抗氧化水平；體內(nèi)試驗(yàn)可以較準(zhǔn)確地反映機(jī)體真實(shí)的抗氧化能力。本研究先通過體外試驗(yàn)測試苦杏仁油對自由基的清除能力和總還原能力，再通過體內(nèi)試驗(yàn)測試苦杏仁油對小鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量的影響，綜合判斷苦杏仁油的抗氧化能力。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

苦杏仁：購于錦州中藥材市場；堿性蛋白酶：酶活性2×105U/g，購自南寧龐博生物工程有限公司；雄性昆明小鼠40 只（SPF 級、4 周齡），體重（20±3）g，由錦州醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供（生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2019—0003；實(shí)驗(yàn)許可證號：SYXK（遼）2019-0007）；飼養(yǎng)條件：空調(diào)房間，溫度20～25 ℃，相對濕度50%～60%，分籠飼養(yǎng)，自由飲水、進(jìn)食，每天更換墊料。

無水乙醇、無水甲醇、氫氧化鈉、鹽酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、Tris-HCl 緩沖溶液、鄰苯三酚、磷酸鹽緩沖液、硫酸亞鐵、過氧化氫、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；SPF 大小鼠生長繁殖飼料（許可證號：SCXK（京）2019—0003）、實(shí)驗(yàn)動物玉米芯墊料：北京科澳協(xié)力飼料有限公司；總超氧化物歧化酶測定試劑盒（批號：A001-3-1）、丙二醛測定試劑盒（批號：A003-1-2）：南京建成生物工程研究所。

1.1.2 儀器與設(shè)備

DK-98-1 型恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；Sorvall Legend Micro21R 型離心機(jī)，賽默飛世爾科技公司；PHS-3C 型pH 計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；UV-5100B 型紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；DHG-9140 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司；MYP11-2A 型磁力攪拌器，上海酶穎浦儀器儀表制造有限公司；SuPerMax型光柵酶標(biāo)儀，上海閃譜生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 苦杏仁的預(yù)處理

將苦杏仁投入沸水中保溫10 min 后取出脫皮，按照料液比1∶12（g/mL）的比例加入蒸餾水，超聲處理60 min（55 ℃、300 W），取出后于100 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒重[9-10]。

1.2.2 苦杏仁油的提取

將預(yù)處理過的苦杏仁粉碎后，用40 目網(wǎng)篩篩選，按照料液比1∶8（g/mL）的比例加入體積分?jǐn)?shù)為20.5%的乙醇溶液混勻，調(diào)溶液pH 為9.5，向溶液中加入3.5%的堿性蛋白酶并混勻，于45 ℃、750 r/min 的條件下磁力攪拌酶解147 min，結(jié)束后將溶液置于90 ℃水浴鍋中水浴滅酶并揮發(fā)乙醇10 min，滅酶后的溶液于4 000 r/min 的條件下離心15 min，吸出油層。

1.2.3 苦杏仁油體外抗氧化試驗(yàn)

1.2.3.1 苦杏仁油對DPPH 自由基的清除作用

用無水乙醇將苦杏仁油稀釋成濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL 的樣液待用，用蒸餾水將VC 稀釋成相同濃度并避光保存。空白管中加入2 mL 80% 甲醇溶液、3 mL 濃度為0.5 mmol/L 的DPPH甲醇溶液；測定管中加入2 mL 樣品液、3 mL 濃度為0.5 mmol/L 的DPPH 甲醇溶液；對照管中加入2 mL樣品液、3 mL 80%甲醇溶液，混勻后，在室溫條件下避光靜置30 min，于517 nm 處測定吸光值，無水乙醇調(diào)零[11]。DPPH 自由基清除率計(jì)算公式為：

式中：A測為測定管在波長517 nm 處的吸光度值；A對為對照管在波長517 nm 處的吸光度值；A空為空白管在波長517 nm 處的吸光度值。

式中：A測為測定管在波長325 nm 處的吸光度值；A對為對照管在波長325 nm 處的吸光度值；A空為空白管在波長325 nm 處的吸光度值。

1.2.3.3 苦杏仁油對·OH 的清除作用

采用Fenton 反應(yīng)測定苦杏仁油對·OH 的清除能力，以VC 為對照進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)溶液配制：用無水乙醇將苦杏仁油稀釋成濃度為0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mg/mL 的樣液待用，用蒸餾水將VC 稀釋成相同濃度并避光保存。管中加入2.0 mL 濃度為0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液，1.5 mL 鄰二氮菲，空白管中加入1.0 mL 濃度為7.5 mmol/L 的硫酸亞鐵、5.5 mL 蒸餾水，對照管中加入1.0 mL 濃度為7.5 mmol/L 的硫酸亞鐵、4.5 mL 蒸餾水、1.0 mL 0.1% H2O2溶液，測定管中加入2.0 mL 濃度為7.5 mmol/L 的硫酸亞鐵、1.0 mL 樣品液、2.5 mL 蒸餾水、1.0 mL 0.1% H2O2溶液，將以上各管混勻，將各管置于37 ℃條件下保溫20 min，于510 nm 處測定吸光度，蒸餾水調(diào)零[13]?！H清除率計(jì)算公式為：

式中：A測為測定管在波長510 nm 處的吸光度值；A對為對照管在波長510 nm 處的吸光度值；A空為空白管在波長510 nm 處的吸光度值。

1.2.3.4 苦杏仁油還原力的測定

將苦杏仁油用無水乙醇稀釋成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的樣液待用，用蒸餾水將VC 稀釋成相同濃度并避光保存。在離心管中加入1.0 mL 樣液和1.0 mL 濃度為0.2 mol/L 的磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）混合，混勻后加入1.0 mL 1%的鐵氰化鉀溶液，混勻后于50 ℃水浴20 min 后冷卻，再加入1.0 mL 10%的三氯乙酸溶液，0.2 mL 0.1%的氯化鐵溶液和0.8 mL 蒸餾水混勻，靜置10 min 后，于3 000 r/min 離心10 min，取上清液于700 nm 處測定吸光度，蒸餾水調(diào)零[14]。

1.2.4 體內(nèi)抗氧化試驗(yàn)

1.2.4.1 小鼠飼喂與建模

參照國食藥監(jiān)?；痆2012]107 號文件中反應(yīng)較迅速的乙醇氧化損傷造模法進(jìn)行建模[15]。將40 只動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為5 組，每組8 只，依次設(shè)定為A（空白組）、B（對照組）、C（低劑量模型組）、D（中劑量模型組）、E（高劑量模型組）。分組后的小鼠先用基礎(chǔ)飼料飼喂4 周，再進(jìn)行灌胃處理4 周，空白組按照體重每只灌注0.05 mL/g 生理鹽水，對照組按照體重每只灌注0.05 mL/g VE，低劑量模型組按照體重每只灌注0.05 mL/g 苦杏仁油，中劑量模型組按照體重每只灌注0.15 mL/g 苦杏仁油，高劑量模型組按照體重每只灌注0.25 mL/g 苦杏仁油[16]。末次灌胃后禁食16 h（期間正常飲水），然后按照12 mL/kg mb的灌胃量一次性給予每只小鼠50%乙醇。6 h 后采用摘除眼球采血法取血，分別搜集血液于EP 管中，后采用頸椎脫臼法處死小鼠。

1.2.4.2 SOD、MDA 指標(biāo)測定

將裝有血液的離心管于4 ℃條件下離心10 min（4 000 r/min），輕輕吸取上層血清后，使用對應(yīng)的試劑盒進(jìn)行嚴(yán)格的指標(biāo)測定。

1.2.4.3 肝臟組織病理學(xué)觀察

解剖小鼠并取出肝臟后對小鼠肝臟進(jìn)行HE 染色，并于顯微鏡下觀察組織形態(tài)[17]。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)類試驗(yàn)均重復(fù)3 次，采用SPSS 18.0 軟件分析數(shù)據(jù)，采用Origin Pro9 軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦杏仁油體外抗氧化試驗(yàn)

DPPH·是一種穩(wěn)定的以氮為中心的脂溶性自由基，其氮端有一個(gè)孤對電子，醇溶液呈紫色，加入抗氧化劑后，其孤對電子可以與氫配對，使紫色褪去，抗氧化劑能力越強(qiáng)，顏色褪去越明顯。是一個(gè)氧分子獲得一個(gè)電子而形成的，廣泛存在于細(xì)胞的線粒體中，可進(jìn)一步反應(yīng)生成對細(xì)胞破壞力更強(qiáng)的過氧化氫和羥自由基；在堿性環(huán)境中，鄰苯三酚可產(chǎn)生超氧陰離子自由基和帶有顏色的中間產(chǎn)物，在反應(yīng)體系中加入抗氧化劑可清除已產(chǎn)生的超氧陰離子并可以減緩鄰苯三酚的氧化，因此可以通過測定吸光度來判斷抗氧化劑的抗氧化能力?！H 是機(jī)體氧化代謝過程中產(chǎn)生的氧化性最強(qiáng)的一種自由基，它可以破壞人體DNA 結(jié)構(gòu)，使其出現(xiàn)永久損傷，還會破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，從而誘發(fā)衰老和其他多種氧化代謝疾病；Fenton反應(yīng)生成·OH 促使Fe2+氧化為Fe3+，加入抗氧化劑會減緩這一反應(yīng)，通過測定吸光度可以判斷出其抗氧化能力。還原力與抗氧化能力成正比，常用鐵氰化鉀還原法來測定某一物質(zhì)的還原力，抗氧化劑提供電子給Fe3+，使得Fe3+還原成Fe2+，通過吸光度的大小判斷Fe2+的濃度，從而反映其抗氧化能力，吸光度越大，樣品的還原能力越強(qiáng)[18-20]?？嘈尤视蛯PPH 自由基、、·OH 的清除能力及對Fe3+的還原力見圖1。

圖1 苦杏仁油體外抗氧化能力Fig. 1 Antioxidant capacities of bitter almond oil in vitro

根據(jù)測試結(jié)果可以看出：苦杏仁油對DPPH·的清除能力呈梯度增加，但較同濃度的VC 差，半數(shù)清除率（IC50）為0.215 mg/mL；苦杏仁油對清除能力呈梯度增加，但較同濃度的VC 差，半數(shù)清除率（IC50）為0.378 mg/mL；苦杏仁油對·OH 的清除能力呈梯度增加，但較同濃度VC 差，半數(shù)清除率（IC50）為0.679 mg/mL；苦杏仁油對Fe3+的還原能力隨劑量的增加而增強(qiáng)，但抗氧化能力弱于VC。出現(xiàn)以上情況可能是因?yàn)榭嘈尤视椭泄潴w相對較少,且VC 作為水溶性抗氧化劑，反應(yīng)時(shí)間更短，因此苦杏仁油的抗氧化能力相比同濃度的VC 差。

2.2 苦杏仁油體內(nèi)抗氧化試驗(yàn)

2.2.1 苦杏仁油對小鼠體重的影響

試驗(yàn)期間各組小鼠體態(tài)生長良好，活潑好動，精神飽滿，皮毛順滑有光澤，飲食飲水正常，剛灌胃后出現(xiàn)短暫不適感，但片刻后即恢復(fù)正常。試驗(yàn)期間小鼠平均體重測定結(jié)果見圖2。

圖2 試驗(yàn)期間小鼠體重測定結(jié)果（n=8）Fig. 2 Body weights of mice during the experiment(n=8)

2.2.2 苦杏仁油對小鼠血清中SOD 活性和MDA 含量的影響

SOD 是生物體內(nèi)源性抗氧化酶系統(tǒng)組成之一，可以清除機(jī)體產(chǎn)生的超氧陰離子和過氧化物等，減少生物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和蓄積，從而發(fā)揮清除自由基、保護(hù)細(xì)胞完整性等抗氧化的功效，生物體內(nèi)SOD活性越高說明機(jī)體清除自由基、抗氧化能力越強(qiáng)。MDA 是體內(nèi)細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸與活性氧簇氧化代謝產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物，其含量可以反映細(xì)胞的氧化損傷程度，含量越低說明細(xì)胞被氧化損傷的程度越低[21]。各組動物血清中SOD 活性和MDA 含量的測定結(jié)果見圖3。

圖3 苦杏仁油對小鼠血清中SOD 活性和MDA 含量的影響（n=8）Fig. 3 Effects of bitter almond oil on SOD activity and MDA content in mice sera(n=8)

由圖3 可以看出：低劑量模型組SOD 活性與空白組之間存在顯著差異（P＜0.05），其余各組與空白組之間則存在極顯著差異（P＜0.01）；各組MDA 含量與空白組之間均存在極顯著差異（P＜0.01）；各組SOD 活性均高于空白組，MDA 含量均低于空白組，表明苦杏仁油對氧化損傷具有一定的保護(hù)作用。中劑量模型組小鼠血清SOD 活性值最高且MDA 含量最低，說明該劑量對氧化損傷的保護(hù)作用最強(qiáng)。

低、中、高劑量模型組中SOD 活性及MDA 含量均與對照組之間存在極顯著差異（P＜0.01），中劑量模型組小鼠抗氧化能力與對照組最接近，其次為高劑量模型組，最后為低劑量模型組。

盡管苦杏仁油對生物體具有一定的抗氧化效果，但隨著苦杏仁油攝入量增大，卻表現(xiàn)出了抗氧化能力降低的情況，造成這種情況的原因可能是由于攝入過多苦杏仁油，延長了機(jī)體吸收利用的時(shí)間，反而導(dǎo)致油脂產(chǎn)生了促氧化效果，從而使得抗氧化能力有所下降[22]。因此苦杏仁油攝入量并不是越多越好，攝入量過多也許會產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng)。

2.2.3 苦杏仁油對小鼠肝臟組織病理形態(tài)學(xué)的影響

對各組小鼠肝臟切片進(jìn)行HE 染色觀察，結(jié)果見圖4。肝臟是生物體內(nèi)最重要的代謝器官，短時(shí)間內(nèi)攝入大量乙醇會激發(fā)生物體氧分子發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生自由基，從而引起組織細(xì)胞過氧化效應(yīng)，造成肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷和功能損傷，因此通過觀察小鼠肝臟細(xì)胞的形態(tài)可以初步判斷出其氧化損傷的情況。通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，空白組小鼠肝細(xì)胞之間連接松散、排列分散、界限模糊，對照組、中劑量模型組小鼠肝臟組織均勻、肝細(xì)胞形態(tài)完整，無明顯脂肪浸潤現(xiàn)象，無明顯病理反應(yīng)；低劑量模型組和高劑量模型組的小鼠肝臟出現(xiàn)不同程度的肝細(xì)胞形態(tài)不完整、脂肪浸潤的現(xiàn)象，其中高劑量模型組的小鼠此種情況更為嚴(yán)重。這可能是因?yàn)榈蛣┝磕Ｐ徒M的小鼠體內(nèi)拮抗氧自由基的供氫體含量較少，肝臟無法代謝短時(shí)間內(nèi)攝入的大量乙醇，導(dǎo)致過多的乙醇對肝細(xì)胞造成破壞；高劑量模型組的小鼠由于長期攝入過多脂肪，能量過剩，富裕的脂肪轉(zhuǎn)換為糖原儲存在肝臟中導(dǎo)致肝細(xì)胞增大，同時(shí)肝細(xì)胞無法快速代謝短時(shí)間攝入的乙醇，從而造成了肝細(xì)胞形態(tài)破損和脂肪浸潤現(xiàn)象[23]。

圖4 小鼠肝臟切片HE 染色結(jié)果（200×）Fig. 4 HE staining results of mice livers slices（200×）

3 結(jié)論