黃芪甲苷對(duì)氯吡格雷致大鼠胃黏膜損傷的治療作用及機(jī)制

張靜，張秋瓚，王艷榮

天津市第四中心醫(yī)院 南開大學(xué)附屬第四中心醫(yī)院消化內(nèi)科，天津 300140

目前缺血性心腦血管疾病的發(fā)病率及病死率逐漸上升，抗血小板治療是缺血性心腦血管疾病治療的常規(guī)及有效措施。但是抗血小板治療是一把雙刃劍，有效預(yù)防及治療缺血性疾病的同時(shí)，也可引起胃腸道并發(fā)癥。黃芪是最常用中藥之一，從黃芪中分離出來的皂苷已有數(shù)十種，而甲苷為其主要的活性指標(biāo)成分。2021 年3 月—2022 年1 月，我們探討黃芪甲苷對(duì)氯吡格雷所致胃黏膜損傷大鼠的治療作用及可能的機(jī)制，以期為臨床治療及預(yù)防抗血小板藥物引起的胃腸道不良反應(yīng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及儀器 健康雄性6 周齡SD 大鼠50 只，體質(zhì)量180～200 g，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供及飼養(yǎng)。溫度（24 ± 2）℃，濕度（55 ± 5）%，噪音＜50 db，每12 小時(shí)1 次亮暗循環(huán)，每籠10只，平衡飼料分籠飼養(yǎng)1周。硫酸氫氯吡格雷（波立維）購自賽諾菲萬安特制藥有限公司；黃芪甲苷購自上海圻明生物科技有限公司；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）單克隆抗體（兔IgG）、磷酸化血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2（p-VEGFR2）單克隆抗體（兔IgG）一抗試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。Image Pro Plus 顯微圖像分析與處理系統(tǒng)購自青島美迪康醫(yī)療科技有限公司。

1.2 動(dòng)物分組及干預(yù) 將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組及黃芪甲苷低、中、高劑量組，每組10 只，參考大鼠與人折算系數(shù)分別予生理鹽水1 mL/100 g、氯吡格雷15.6 mg/kg、氯吡格雷15.6 mg/kg+黃芪甲苷15 mg/kg、氯吡格雷15.6 mg/kg+黃芪甲苷30 mg/kg、氯吡格雷15.6 mg/kg+黃芪甲苷60 mg/kg 灌胃，每日1次，干預(yù)1周后脫頸處死大鼠［1］。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 胃黏膜損傷評(píng)價(jià) 取各組胃壁組織，漂洗干凈后，按文獻(xiàn)［2］標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。斑點(diǎn)糜爛1 分；糜爛長度＜1 mm 計(jì)2 分、1～＜2 mm 計(jì)3 分、2～4 mm 計(jì)4分、＞4 mm 計(jì)5 分。糜爛寬度＞1 mm 時(shí)分值×2，各分值相加為損傷指數(shù)總分。

1.3.2 胃黏膜組織中VEGF、p-VEGFR2 蛋白表達(dá)檢測(cè) 取胃竇部黏膜組織0.2 g，加入9 倍生理鹽水，制成10%胃黏膜組織勻漿，3 500 r/min 常溫離心15 min。剪下大小約1 cm×1 cm 胃竇黏膜組織，于液氮中冷凍保存，然后于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩２捎妹庖呓M化SABC 染色法［3］，用4%多聚甲醛外固定胃黏膜標(biāo)本，染色、透明和封片。將切片用0.5%甲醇液在室溫下浸泡30 min，蒸餾水洗，熱修復(fù)，滴加正常山羊血清封閉液，室溫保存20 min。滴加VEGF、p-VEGFR2 組織一抗（稀釋比例1∶150），4 ℃過夜。PBS 沖冼滴加生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃ 20 min，用PBS 沖洗，滴加SABC，20～37 ℃ 20 min，PBS漂洗，DAB顯色，蒸餾水洗滌，脫水，透明，封片，顯微鏡（×200）下觀察。陰性對(duì)照組用PBS 代替一抗。用Image-Pro Plus 分析免疫組化圖片，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，進(jìn)行圖像分析，觀察每個(gè)視野下陽性反應(yīng)的光密度及陽性細(xì)胞面積［4］。免疫組織化學(xué)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：胃黏膜上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組胃黏膜損傷情況比較 50 只大鼠均存活。對(duì)照組、模型組及黃芪甲苷低、中、高劑量組胃 黏膜損傷指數(shù)評(píng)分分別為0、（10.85 ± 1.43）、（8.76 ± 1.53）、（6.48 ± 1.27）、（3.69 ± 0.87）分。與對(duì)照組比較，模型組胃黏膜損傷指數(shù)評(píng)分高（P＜0.05）；與模型組比較，各黃芪甲苷組胃黏膜損傷指數(shù)評(píng)分低（P均＜0.05）。黃芪甲苷低、中、高劑量組胃黏膜損傷指數(shù)評(píng)分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。

2.2 各組胃黏膜組織中VEGF、p-VEGFR2 蛋白表達(dá)比較 見表1。

表1 各組胃黏膜組織中VEGF、p-VEGFR2蛋白表達(dá)比較（±s）

表1 各組胃黏膜組織中VEGF、p-VEGFR2蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與黃芪甲苷低劑量比較，&P＜0.05；與黃芪甲苷中劑量比較，△P＜0.05。

組別對(duì)照組模型組黃芪甲苷低劑量黃芪甲苷中劑量黃芪甲苷高劑量n 10 10 10 10 10 VEGF蛋白陽性面積（μm2）2 730 ± 310 1 120 ± 110*1 410 ± 130#2 015 ± 210#&2 540 ± 260#&△光密度0.319 ± 0.018 0.132 ± 0.009*0.160 ± 0.010#0.214 ± 0.010#&0.288 ± 0.014#&△P-VEGFR2蛋白陽性面積（μm2）4 021 ± 420 2 011 ± 201*2 502 ± 203#3 060 ± 245#&3 785 ± 320#&△光密度0.396 ± 0.022 0.164 ± 0.009*0.185 ± 0.102#0.303 ± 0.012#&0.376 ± 0.020#&△

3 討論

目前，口服阿司匹林聯(lián)合P2Y12 受體抑制劑的雙抗療法是急性冠脈綜合征及冠脈支架置入術(shù)后患者的首選［5］。P2Y12 受體是抗血小板藥物發(fā)揮作用的重要靶點(diǎn)。氯吡格雷是目前臨床上應(yīng)用最廣泛的P2Y12 受體抑制劑之一，它通過腸道吸收后生成能抑制血小板聚集的活性代謝物［6］，起到抗血栓形成的作用。使用氯吡格雷75 mg/d 者與使用阿司匹林100 mg/d 者胃腸道出血風(fēng)險(xiǎn)相當(dāng)［7-8］。二者合用引起的上消化道出血風(fēng)險(xiǎn)是二者單一用藥的2～4倍［9］。接受抗血小板治療的患者都發(fā)生了胃腸道損傷［10］。有研究報(bào)道，氯吡格雷可能通過細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)及信號(hào)通路等導(dǎo)致胃黏膜損傷［11］。我們前期研究也證實(shí)它可以通過影響炎癥細(xì)胞因子水平引起胃黏膜損傷。

黃芪甲苷可以通過改變胃黏膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)揮保護(hù)胃黏膜屏障完整性的作用；也可以通過調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子及相關(guān)信號(hào)通路，對(duì)損傷胃黏膜起到保護(hù)作用［12-13］。李建芝等［14］研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可以通過抗氧化、抑制細(xì)胞凋亡等機(jī)制修復(fù)胃黏膜損傷。黃芪甲苷可通過抑制MAPK信號(hào)通路激活來抑制胃黏膜炎癥反應(yīng)，發(fā)揮胃黏膜保護(hù)作用［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，氯吡格雷可以引起大鼠胃黏膜損傷，黃芪甲苷可以參與損傷胃黏膜的修復(fù)，且隨著劑量增加，修復(fù)作用逐漸增強(qiáng)。

VEGF 是一種促血管生成活性的生長因子，具有促有絲分裂、抗內(nèi)皮細(xì)胞抗凋亡、增加血管通透性、促進(jìn)細(xì)胞遷移等作用，可促進(jìn)新生血管的形成［16］。VEGF 是參與消化性潰瘍愈合的關(guān)鍵因子，可通過促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)堆積，參與潰瘍的愈合及血管再生［17］。VEGF 受體包括三種，其中VEGFR1、VEGFR2 主要分布于血管。VEGF 可以與VEGFR2特異性結(jié)合，VEGFR2在介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移等方面發(fā)揮重要功能［18］。研究發(fā)現(xiàn)，氯吡格雷通過抑制VEGF-VEGFR2-EPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制胃潰瘍血管形成，從而延遲潰瘍愈合［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用氯吡格雷后大鼠胃黏膜組織中的VEGF、p-VEGFR2 蛋白表達(dá)下降，而應(yīng)用黃芪甲苷后大鼠黏膜組織中的VEGF、p-VEGFR2 蛋白表達(dá)升高。提示氯吡格雷可以通過抑制VEGF、p-VEGFR2 表達(dá)對(duì)胃黏膜造成損傷，而黃芪甲苷可以促進(jìn)二者表達(dá)，從而減輕氯吡格雷引起的胃黏膜損傷。

綜上所述，黃芪甲苷對(duì)氯吡格雷所致胃黏膜損傷具有一定治療作用，其作用機(jī)制可能與上調(diào)胃黏膜組織VEGF、P-VEGFR2 表達(dá)保護(hù)胃黏膜屏障有關(guān)。