二甲雙胍對糖尿病大鼠血清同型半胱氨酸水平及腸道菌群的影響

劉昱昭，孫瑩姍，王顏剛，李文怡

1 青島大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東 青島 266003；2 山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院

糖尿病患者發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的可能性比非糖尿病患者高2～4倍，且具有發(fā)病早、進(jìn)展快的特點(diǎn)，70%～80%糖尿病患者死于大血管病變。血糖較高或波動(dòng)較大的糖尿病患者發(fā)生血管并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)顯著高于血糖穩(wěn)定患者［1］。研究表明，血糖、LDL-C 及同型半胱氨酸（Hcy）都具有致動(dòng)脈粥樣硬化的作用。血清Hcy能經(jīng)多種機(jī)制導(dǎo)致血管疾病發(fā)生，是糖尿病及其血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［2］。目前雙胍類藥是一線降糖藥物，二甲雙胍可有效降低2 型糖尿病患者的血糖和心血管病死率。有研究發(fā)現(xiàn)，長時(shí)間應(yīng)用二甲雙胍降糖的患者會(huì)出現(xiàn)葉酸、維生素B12代謝異常，進(jìn)而導(dǎo)致高同型半胱氨酸血癥（HHcy）的發(fā)生；但也有研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍不僅不會(huì)升高糖尿病患者Hcy，反而能使血清Hcy 水平下降［3-4］。Hcy 可反映維生素B12的狀態(tài)，二甲雙胍對Hcy 有影響［5］。研究顯示，冠心病患者的血清Hcy 水平與腸道菌群有關(guān)，尤其是與雙歧桿菌、大腸桿菌顯著相關(guān)；腦卒中患者腸道菌群紊亂也會(huì)導(dǎo)致葉酸、維生素B12代謝異常，從而引起血清Hcy 水平發(fā)生變化；且移植卒中患者腸道菌群的大鼠，較移植健康人群腸道菌群的大鼠，維生素B12、葉酸水平低，Hcy 水平高［6-8］。二甲雙胍通過改變糖尿病患者腸道菌群組成及其代謝產(chǎn)物進(jìn)而影響糖脂代謝［9-10］，但二甲雙胍對糖尿病患者Hcy 代謝的影響是否與腸道菌群的改變存在相關(guān)性仍鮮見報(bào)道。2020年11 月—2022 年7 月，本研究探討了二甲雙胍對糖尿病大鼠血清Hcy 水平及其腸道菌群的影響，以期為糖尿病及其并發(fā)癥防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及儀器 20 只SPF 級健康雄性SD大鼠，4 周齡，體質(zhì)量（100 ± 20）g，購于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司［動(dòng)物許可證：SCXK（京）2019-0010］，質(zhì)檢免疫后適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。動(dòng)物房溫度（25 ± 1）℃，濕度30%～40%，12 h 明/暗周期，通風(fēng)良好，動(dòng)物自由飲水和攝食。大鼠維持飼料、高糖高脂飼料購于江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司，鹽酸二甲雙胍片購自中美上海施貴寶制藥有限公司，鏈脲佐菌素（STZ）購于美國Sigma 公司，大鼠Hcy ELISA 檢測試劑盒購自武漢純度生物科技有限公司。全密閉組織脫水機(jī)、石蠟包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)、自動(dòng)封片機(jī)（德國Leica 公司），臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），-80 ℃超低溫冰箱（日本三洋電機(jī)株式會(huì)社），電子分析天平（上海博通經(jīng)貿(mào)有限公司），血糖儀（拜耳醫(yī)藥保健有限公司）。

1.2 動(dòng)物分組、模型構(gòu)建及干預(yù) 適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)選取5只大鼠作為正常對照組，給予普通飼料喂養(yǎng)；余15 只均構(gòu)建糖尿病模型，給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周，禁食不禁水12 h后，一次性腹腔注射1% STZ 溶液35 mg/kg。10 d 后采尾尖靜脈血，用血糖儀測定隨機(jī)血糖，以連續(xù)2 次血糖≥16.7 mmol/L為造模成功。將糖尿病大鼠模型隨機(jī)分為二甲雙胍組7只、模型組8只。二甲雙胍組予二甲雙胍懸濁液200 mg/（kg·d）灌胃，模型組每天予等量雙蒸水灌胃，連續(xù)灌胃8 周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，二甲雙胍組、模型組分別脫落2、1只。

1.3 標(biāo)本采集 干預(yù)8周后，禁食不禁水12 h，用10%水合氯醛溶液麻醉大鼠并固定，常規(guī)消毒，取心尖血約8 mL，室溫下于促凝管中靜置20 min，3 000 r/min離心15 min，離心半徑16 cm，取血清凍存于-80 ℃冰箱。灌注后取大鼠結(jié)腸約5 cm，置于4%多聚甲醛固定液中以備HE 染色觀察腸道病理組織改變。從結(jié)腸根部取約1 g 糞便，凍存于-80℃冰箱，為16S高通量測序備用。

1.4 一般情況觀察 觀察大鼠的進(jìn)食、飲水、大小便、毛色、活動(dòng)情況。

1.5 血糖檢測 于干預(yù)第1、4、8 周末稱重，取尾尖血檢測血糖。

1.6 血清Hcy 及血脂檢測 用ELISA 法檢測血清Hcy，用全自動(dòng)生化分析儀檢測血清TG、TC、HDL-C、LDL-C。

1.7 結(jié)腸組織病理變化觀察 采用HE 染色法。結(jié)腸組織固定后，制作石蠟切片，進(jìn)行HE 染色，采用病理切片掃描機(jī)掃描觀察。

1.8 腸道菌群分析 用MagPure Stool DNA KF Kit試劑盒提取糞便樣本DNA，進(jìn)行16SDNA 測序及分析。PCR 擴(kuò)增，建立文庫，用Agilent 2100 生物分析儀檢測文庫的片段濃度及范圍，應(yīng)用HiSeq 平臺行高通量測序。對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，使用FLASH 軟件v1.2.11 進(jìn)行序列拼接，得到高變區(qū)的Tags，在97%序列相似度下，用USEARCH 將Tags 進(jìn)行聚類，生成分類操作單元（OTU）代表序列，采用序列之間的97%相似性把某一個(gè)分類單元定義為一個(gè)OTU，每個(gè)OTU 對應(yīng)于一種代表序列。利用UCHIME將擴(kuò)增后產(chǎn)生的嵌合體從OTU代表序列中去除，并在Gold database 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比較檢測，使用Usearch global 法將所有Tags 比對回OTU 代表序列，得到每個(gè)樣品的OTU 豐度統(tǒng)計(jì)表。通過RDP classifer v2.2 軟件將序列和已知物種數(shù)據(jù)庫比對，進(jìn)行物種注釋，并對測序結(jié)果進(jìn)行生物學(xué)信息分析。對測序數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行OTU 分析及Alpha 多樣性分析。OTU 分析結(jié)果用Venn 圖和物種組成柱狀圖來表示，反映樣本間物種門水平、目水平和屬水平的物種變化。Alpha 多樣性用稀釋曲線與盒形圖來表示，稀釋曲線評價(jià)測序量能否覆蓋所有微生物物種及樣品中物種豐富程度，Chao 指數(shù)評價(jià)物種豐度，Shannon評價(jià)多樣性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK 法。不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，多組比較采用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)，進(jìn)一步兩兩比較采用Bonferroni法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組一般情況比較 正常對照組狀態(tài)良好，體質(zhì)量逐漸增加，攝食飲水、大小便正常，毛色光亮，活動(dòng)敏捷。模型組飲水進(jìn)食量增多，尿量明顯增加，精神萎靡，反應(yīng)遲緩，毛色暗淡，體質(zhì)量略下降。二甲雙胍組糖尿病典型癥狀緩解，皮毛暗淡、精神萎靡等表現(xiàn)與模型組比較有一定改善。

2.2 三組各時(shí)點(diǎn)血糖比較 見表1。

表1 三組血糖變化（mmol/L，±s）

表1 三組血糖變化（mmol/L，±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別正常對照組模型組二甲雙胍組n 5 7 5血糖干預(yù)第1周5.32 ± 0.24 27.35 ± 5.08*25.36 ± 5.08干預(yù)第4周5.22 ± 0.19 26.91 ± 4.56*20.08 ± 4.17#干預(yù)第8周5.18 ± 0.14 25.97 ± 4.83*19.70 ± 4.62#

2.3 三組血清Hcy及血脂水平比較 見表2。

表2 三組血清Hcy及血脂水平比較（±s）

表2 三組血清Hcy及血脂水平比較（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別正常對照組模型組二甲雙胍組n 5 7 5 Hcy（μmol/L）14.0 ± 1.6 16.4 ± 1.9*14.6 ± 2.0#TG（mmol/L）0.64 ± 0.21 0.86 ± 0.47 1.18 ± 0.85 TC（mmol/L）2.05 ± 0.53 2.13 ± 0.21 2.32 ± 0.33 HDL-C（mmol/L）0.56 ± 0.13 0.65 ± 0.17 0.63 ± 0.19 LDL-C（mmol/L）0.26 ± 0.05 0.58 ± 0.09*0.56 ± 0.21*

2.4 三組結(jié)腸組織病理變化比較 正常對照組結(jié)腸組織未見明顯病理變化；模型組結(jié)腸固有層可見較多炎細(xì)胞浸潤，腸道結(jié)構(gòu)損傷程度較重，細(xì)胞形態(tài)不完整；二甲雙胍組炎細(xì)胞浸潤較輕，細(xì)胞形狀與正常對照組差別小。

2.5 三組腸道菌群檢測結(jié)果比較

2.5.1 OTU分析結(jié)果 正常對照組、模型組、二甲雙胍組OTU值分別為412.53 ± 51.69、381.57 ± 53.12、438.60 ± 28.58。與正常對照組比較，模型組OTU值低（P＜0.05）；與模型組比較，二甲雙胍組OTU值高（P＜0.05）。三組共有的OTU 423 個(gè)，正常對照組、模型組、二甲雙胍特有的OTU分別為180、32、60個(gè)。三組腸道菌群門、目、屬水平構(gòu)成比較見表3～5。

表3 三組腸道菌群門水平構(gòu)成比較［%，M（P25，P75）］

2.5.2 Alpha 多樣性分析結(jié)果 模型組的物種豐富度低于正常對照組，二甲雙胍組的物種豐富度與正常對照組相近。見圖1。

圖1 Alpha多樣性分析

3 討論

近年來文獻(xiàn)報(bào)道二甲雙胍治療過程中存在Hcy代謝異常，雖然結(jié)果不一致，但由于Hcy是心血管疾病、糖尿病大血管病變的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，因此二甲雙胍對糖尿病Hcy代謝及其機(jī)制研究越來越受到關(guān)注。本研究模型組大鼠血糖一直維持在較高水平，8周后出現(xiàn)了血清Hcy明顯升高，與正常對照組大鼠比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示糖尿病大鼠有明顯的Hcy代謝紊亂。二甲雙胍組大鼠經(jīng)二甲雙胍干預(yù)后，血糖顯著下降，血清Hcy水平也明顯降低并接近正常對照組水平。說明二甲雙胍能有效降低血糖和血清Hcy水平。已有研究證實(shí)，糖尿病患者血清Hcy水平明顯高于健康人。林園等［4，11］應(yīng)用二甲雙胍治療2 型糖尿病，周期3個(gè)月，患者的血糖和糖化血紅蛋白均顯著下降，胰島素抵抗指數(shù)下降，而且結(jié)果顯示血清Hcy水平明顯下降，這與我們的研究結(jié)果一致。但是朱鋒等［3，12］研究卻發(fā)現(xiàn)二甲雙胍治療糖尿病半年以上，雖然明顯降低空腹血糖、餐后2 h血糖和糖化血紅蛋白，但是血清維生素B12和葉酸水平明顯降低，血清Hcy 水平顯著升高，而且Hcy 的升高與血清維生素B12、葉酸的降低及二甲雙胍使用劑量有關(guān)，這與本研究結(jié)論相反。原因可能是因?yàn)槎唐诤烷L期服用二甲雙胍對糖尿病血清Hcy代謝的作用機(jī)制不同。

表4 三組腸道菌群目水平構(gòu)成比較［%，M（P25，P75）］

表5 三組腸道菌群屬水平構(gòu)成比較［%，M（P25，P75）］

既往研究表明，二甲雙胍除具有降糖、影響Hcy和脂質(zhì)代謝，調(diào)節(jié)腸道菌群，改善炎癥反應(yīng)的作用［13-14］。袁鳳易等［9］采用二甲雙胍治療新診斷的2型糖尿病患者3 個(gè)月，患者變形菌門和擬桿菌門的多個(gè)物種相對豐度有所上調(diào)，厚壁菌門相對豐度下調(diào)。葛方升等［10］采用二甲雙胍治療60例老年2型糖尿病患者3 個(gè)月，發(fā)現(xiàn)觀察組患者腸道菌群較治療前和正常對照組均有改變，主要表現(xiàn)為有益菌（雙歧桿菌、乳桿菌、擬桿菌等）顯著增加，某些中性菌（腸球菌、腸桿菌等）減少，炎癥因子水平顯著降低。近年研究還發(fā)現(xiàn)，血清Hcy 代謝與腸道菌群存在相關(guān)性。妙煒等［8］發(fā)現(xiàn)，與移植健康人群腸道菌群組比較，移植卒中患者腸道菌群的維生素B12、葉酸水平降低，Hcy 水平升高。石翠等［6］發(fā)現(xiàn)，冠心病患者存在HHcy，患者血清Hcy 水平與大腸桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量分別呈顯著正相關(guān)、顯著負(fù)相關(guān)和無相關(guān)性。張國勇等［7］發(fā)現(xiàn)，PCI手術(shù)的冠心病患者血清Hcy 明顯升高，腸道菌群紊亂，乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌數(shù)量與血清Hcy 呈顯著負(fù)相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組結(jié)腸可見病理變化，大量炎細(xì)胞浸潤，腸道結(jié)構(gòu)損傷，腸道細(xì)胞萎縮；而且模型組腸道菌群也出現(xiàn)顯著改變，OTU 值降低，其中擬桿菌門相對豐度明顯增加，厚壁菌門相對豐度顯著降低；擬桿菌目相對豐度明顯增高，梭菌目相對豐度明顯降低；普氏菌屬相對豐度明顯升高，顫落菌屬、瘤胃球菌屬相對豐度下降。提示糖尿病大鼠存在腸道菌群紊亂。二甲雙胍干預(yù)后，大鼠腸道結(jié)構(gòu)受損較輕，細(xì)胞形態(tài)接近正常，炎細(xì)胞浸潤程度較輕；腸道菌群OTU 值升高，腸道菌群紊亂有所改善。與模型組比較，二甲雙胍組擬桿菌門相對豐度顯著降低，厚壁菌門則顯著增加，菌群結(jié)構(gòu)與正常對照組相近；梭菌目相對豐度升高，擬桿菌相對豐度下降；普氏菌屬顯著降低，考拉桿菌屬相對豐度顯著增加。Alpha 多樣性分析顯示，模型組顯著降低；而二甲雙胍干預(yù)則顯著增加Alpha 多樣性，并與正常對照組水平相近。因此，短期服用二甲雙胍治療糖尿病引起的腸道菌群變化可能是血清Hcy 降低的重要機(jī)制之一，而長期服用二甲雙胍治療引起的Hcy升高可能是腸道菌群發(fā)生新的失衡而導(dǎo)致葉酸、維生素B12生成減少。

綜上所述，二甲雙胍能有效降低糖尿病大鼠血糖及血清Hcy水平，調(diào)節(jié)腸道菌群，進(jìn)而可能對糖尿病并發(fā)癥起到一定防治作用。但本研究因條件有限，未能進(jìn)一步驗(yàn)證，如長時(shí)間應(yīng)用二甲雙胍是否會(huì)導(dǎo)致腸道菌群改變，以致出現(xiàn)血清維生素B12和葉酸水平降低，血清Hcy水平升高；且未能進(jìn)一步探索具體細(xì)菌種屬改變。后期研究將進(jìn)一步挖掘腸道菌群改變的作用機(jī)制。