斑籽木乙酸乙酯萃取部位的體內(nèi)外抗炎作用及機(jī)制

楊銳，盧光衣，張倩茹，陳帥，何紅平，蔣華夷

云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 云南省南藥可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500

斑籽木別名斑籽，為大戟科斑籽木屬灌木，產(chǎn)于我國云南西南部，在亞洲南部和東南部各國亦有分布［1］。斑籽木全株均可入藥，具有清熱解毒、消腫止痛、瀉下利尿等功效，常用于治療支氣管炎、哮喘、水腫、黃疸、麻風(fēng)病和皮膚病等［2］。研究表明，斑籽木提取物具有抗腫瘤、抗過敏、抗菌、抗氧化、保肝、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性，而關(guān)于其化學(xué)成分的研究報(bào)道較少，已分離鑒定的化學(xué)成分主要涉及二萜、苯丙素、生物堿等結(jié)構(gòu)類型［2-6］。為進(jìn)一步明確斑籽木活性部位及其物質(zhì)基礎(chǔ)，2021 年8 月—2022 年1 月本研究以斑籽木地上部分為研究對象，采用角叉菜膠致小鼠足跖腫脹模型，初步評價(jià)其90%乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位（BSEA）的抗炎活性，并對BSEA 體外抗炎活性進(jìn)行評價(jià)；同時，通過分子對接技術(shù)初步探討活性成分可能的抗炎作用機(jī)制，為斑籽木在抗炎方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 斑籽木地上部分于2019 年3 月采自云南省西雙版納州，經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)張雪梅鑒定為大戟科斑籽木Baliospermum solanifolium （Burman） Suresh，標(biāo)本（BS-201903001）保存于云南省傣醫(yī)藥與彝醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；角叉菜膠（美國Sigma 公司）；阿司匹林、羧甲基纖維素鈉（北京索萊寶科技有限公司）。雌性ICR 小鼠［SPF 級，體質(zhì)量（20 ± 2）g，斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0010］，適應(yīng)性飼養(yǎng)4 d，環(huán)境溫度為（22 ± 2）oC，濕度為40%～60%，每日光照約12 h，自由飲食和攝水。小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7（中科院上海細(xì)胞庫）；DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清（以色列Biological Industries 公司）；Griess 試劑、LPS 及陽性對照藥物L(fēng)-NMMA 均購自日本Sigma 公司；一氧化氮（NO）檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；GF254型薄層層析硅膠板（青島海洋化工廠）；柱色譜硅膠（80～100、100～200 目，青島海洋化工廠）；RP-C18柱色譜填料（美國EMD Millipore 公司）；MCI（CHP20P，75～150 μm，日本三菱化學(xué)公司）；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠（美國GE Healthcare公司）；色譜純乙腈和甲醇（上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆?；工業(yè)乙醇、石油醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇（上海泰坦化學(xué)有限公司）經(jīng)重蒸后使用。NX-1R離心機(jī)（天津鼎昊源生物科技有限公司）；Varioskan FLASH 多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo 公司）；MX-S 旋渦混勻儀（北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器股份公司）；Caliper3 數(shù)顯卡尺（東莞三量具有限公司）；Centrifuge 5804R 型冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；Synergy2 型多功能酶標(biāo)儀（美國Biotek 公司）；Bruker AV-500 型核磁共振儀（德國Bruker 公司）；Hei-VAP Core HL/G3 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國Heidolph 公司）；Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），色譜柱為XDB-C18（9.4 mm×250 mm，5 μm，美國Agilent公司）。

1.2 BSEA體內(nèi)抗炎作用觀察方法

1.2.1 BSEA的制備 取干燥斑籽木地上部分20 kg適當(dāng)粉碎，用90%乙醇/水浸漬提取4 次，每次3 d。合并濾液，減壓濃縮至無醇味后將浸膏分散于水中，用石油醚于室溫下萃取3次。水相隨后用乙酸乙酯萃取4次，萃取液經(jīng)減壓濃縮后得到浸膏800 g。

1.2.2 動物分組、藥物干預(yù)及模型制備 參照文獻(xiàn)［7-8］方法，將48只雌性小鼠，隨機(jī)分為正常對照組、模型組、陽性對照組及BSEA 高、中、低劑量組。陽性對照組給予阿司匹林400 mg/kg 灌胃，BSEA 高、中、低劑量組分別給予176、88、44 mg/kg 浸膏灌胃，均以1 mL/100 g連續(xù)灌胃5 d，每天1次；模型組給予等體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃。給藥劑量根據(jù)人給藥劑量換算并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定。除正常對照組外，其他各組均在末次給藥1 h 后，于小鼠左后足跖皮下注射1%角叉菜膠水溶液25 μL 致炎。采用游標(biāo)卡尺法測定致炎后5 h 小鼠的左后足足跖厚度，并分別按下式計(jì)算足跖腫脹度和腫脹抑制率。

1.3 BSEA體外抗炎作用觀察方法

1.3.1 斑籽木BSEA 化學(xué)成分的分離 斑籽木BSEA 經(jīng)正相硅膠（3.5 kg，80～100目）柱色譜分離，以石油醚-丙酮（1∶0～0∶1）梯度洗脫，薄層色譜法監(jiān)測，合并相同組分，得到7 個部分Fr.A～G。Fr.C（69.1 g）經(jīng)硅膠柱層析（691 g，100～200目，石油醚-丙酮1∶0～0∶1 梯度洗脫）分為7 個組分Fr. C1～C7。Fr.C1經(jīng)半制備HPLC（51%乙腈-水，3 mL/min）得到化合物1（6.3 mg，tR=24.7 min）。Fr. D（30.4 g）經(jīng)MCI柱層析，以90%甲醇-水洗脫，得到4 個組分Fr.D1～D4。Fr.D1（13.2 g）經(jīng)硅膠柱色譜（400 g，100～200 目，石油醚-丙酮50∶1～1∶1 梯度洗脫）分為8 個組分Fr.D1-1～D1-8。Fr.D1-8經(jīng)半制備HPLC（15%乙腈-水，3 mL/min）得到化合物4（8.7 mg，tR=7.6 min）。Fr.E（32.9 g）經(jīng)MCI 柱色譜（40%～100%甲醇-水梯度洗脫）得到3 個組分Fr. E1～E3。Fr.E2 經(jīng)中壓RP-18 柱層析，以40%～100%甲醇-水梯度洗脫，得到8個組分Fr.E2-1～E2-8。Fr.E2-4經(jīng)硅膠柱層析（80 g，80～100 目，石油醚-乙酸乙酯20∶1等度洗脫）得到化合物2（129.8 mg）。Fr. E3 經(jīng)硅膠柱層析（120 g，80～100目，石油醚-乙酸乙酯30∶1～2∶1 梯度洗脫）分為9 個組分Fr. E3-1～E3-9。Fr.E3-5 經(jīng)半制備HPLC（82%乙腈-水，3 mL/min）得到化合物3（7.4 mg，tR=29.6 min）。

圖1 化合物1～4的結(jié)構(gòu)

1.3.2 單體化合物的體外抗炎活性檢測 將RAW264.7 巨噬細(xì)胞接種至96 孔板，用1 μg/mL LPS 進(jìn)行誘導(dǎo)刺激，同時加入待測化合物處理（終濃度從50 μmol/L 開始2 倍稀釋），設(shè)置空白對照組（不含藥物）和NG-甲基-L-精氨酸乙酸鹽（L-NMMA）陽性對照組。細(xì)胞過夜培養(yǎng)后取培養(yǎng)基檢測NO 生成，在570 nm 處測定吸光值（OD）。采用MTS 法在剩余培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞存活率檢測，以排除化合物對細(xì)胞的毒性影響［9］。半數(shù)抑制濃度（IC50）值按Reed&Muench法計(jì)算［10］。

1.4 BSEA體外抗炎作用機(jī)制分析 利用PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），獲得化合物2的sdf格式文件。根據(jù)文獻(xiàn)［11-13］，選取5個與抗炎活性密切相關(guān)的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）組成靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫。通過RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）搜索以上靶點(diǎn)對應(yīng)的蛋白，下載相應(yīng)蛋白的pdb 格式文件。用CB-Dock2（https：//cadd. labshare. cn/cb-dock2/php/index.php）自動計(jì)算結(jié)合位置和box的范圍，然后基于AutoDock Vina執(zhí)行分子對接［14-15］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，三組及以上比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD 法檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BSEA 的體內(nèi)抗炎作用 連續(xù)灌胃給藥5 d，小鼠未出現(xiàn)異常，表明受試樣品在實(shí)驗(yàn)所設(shè)定的劑量條件下對小鼠的正常生命活動無影響。模型組、陽性對照組及BSEA 高、中、低劑量組致炎5 h 足腫脹度 分 別 為（29.52 ± 3.14）%、（16.07 ± 1.61）%、（19.02 ± 3.63）%、（21.48 ± 2.45）%、（25.33 ± 4.93）%。與模型組比較，陽性對照組、BSEA 高劑量組、BSEA 中劑量組足腫脹度低（P均＜0.05）；與陽性對照組比較，BSEA 中、低劑量組足腫脹度高（P均＜0.05），而高劑量組足腫脹度與陽性對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。陽性對照組及BSEA 高、中、低劑量組腫脹抑制率分別為45.56%、35.57%、27.24%、14.19%。

2.2 BSEA 的體外抗炎作用 從斑籽木BSEA 中分離得到4 個化合物，分別鑒定為2，3-反式-6，7，4′-三甲氧基黃烷醇（1）［16］、α-亞麻酸（2）［17］、亞麻酸甲酯（3）［18］、甘油亞麻酸酯（4）［19］。化合物2 在50 μmol/L 濃度下對細(xì)胞生長無影響，細(xì)胞存活率＞90%。進(jìn)一步對化合物2 進(jìn)行NO 生成抑制活性評價(jià)，結(jié)果顯示化合物2 在50 μmol/L 濃度下的NO 生成抑制率為（82.52 ± 0.54）%，IC50值為（22.79 ± 1.48）μmol/L，其抑制活性優(yōu)于陽性對照藥L-NMMA［NO 生成抑制率為（57.42 ± 1.41）%，IC50值為（33.74 ± 2.13）μmol/L］。

2.3 BSEA 的作用機(jī)制 分子對接結(jié)果顯示，化合物2 與iNOS、PPARα、NF-κB、IL-1β 和TNF-α 的結(jié)合能分別為-7.3、-6.7、-6.4、-6.2、-5.9 kCal/mol，提示其可能通過以上5 個靶標(biāo)發(fā)揮抗炎作用?；衔? 的C-1 位羰基氧與iNOS 的Tyr-483 氨基酸殘基形成氫鍵作用，18-CH3與Tyr-485 殘基形成π-σ 作用，與Met-349、Leu-119 殘基形成Alkyl-Alkyl 作用，與Phe-482 殘基形成π-Alkyl 作用；C-1 位羥基與PPARα 的His-274 殘基形成氫鍵作用，18-CH3與Cys-275、Ile-272、Val-332、Ile-339 殘基形成Alkyl-Alkyl作用；C-1位羰基氧與NF-κB 的Ser-164、Gly-163、Gly-165、Lys-166 殘基形成氫鍵作用，C-1 位羧基H與Thr-167 殘基形成氫鍵作用，18-CH3與Arg-204 殘基形成Alkyl-Alkyl作用；C-1位羧基H和羰基氧分別與IL-1β 的Asn-129、Tyr-127 殘基形成氫鍵作用，18-CH3與Pro-28 殘基形成Alkyl-Alkyl 作用；C-1 位羧基H 和羰基氧分別與TNF-α 的Gln-125、Arg-82殘基形成氫鍵作用，18-CH3與Tyr-87 殘基形成Alkyl-Alkyl作用。見表1。

表1 化合物2的分子對接結(jié)果

3 討論

炎癥是機(jī)體受到內(nèi)外侵害或感染后所發(fā)生的一種防御反應(yīng)，具體表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛甚至功能障礙［20］。通常情況下，炎癥可以激活免疫系統(tǒng)，抵抗多種刺激，從而保護(hù)機(jī)體免受傷害或感染。但過度、長期的炎癥反應(yīng)可能會導(dǎo)致細(xì)胞損傷或代謝紊亂，進(jìn)而引發(fā)一系列疾病，包括動脈粥樣硬化、糖尿病、心肌梗塞、癌癥以及神經(jīng)退行性疾病等［21］。在炎癥反應(yīng)的發(fā)生和消退過程中，通常需要多種細(xì)胞和細(xì)胞因子等的參與，它們往往相互協(xié)同或拮抗，共同影響機(jī)體的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)［22］。

NO具有廣泛而重要的生物學(xué)調(diào)控功能，在炎癥的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。當(dāng)免疫細(xì)胞遭受炎癥介質(zhì)或微生物內(nèi)毒素等的刺激時，會產(chǎn)生大量iNOS，iNOS 通過催化L-精氨酸生成NO 進(jìn)行免疫應(yīng)答。因此抑制NO 生成是檢測抗炎活性的直接指標(biāo)。LPS 是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要組成成分，可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子，從而引發(fā)炎癥反應(yīng)。將小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 用LPS 誘導(dǎo)iNOS 的生成，同時加入待測樣品處理，通過Griess 法測定培養(yǎng)基在570 nm 波長下的吸光值可檢測亞硝酸鹽［23］。因此，可通過測定樣品對LPS 誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)NO生成的抑制作用，評價(jià)其抗炎活性。

分子對接技術(shù)屬于計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)的重要組成部分，是將配體小分子放入受體活性口袋中，通過變化小分子配體的空間構(gòu)象，按照幾何、能量及化學(xué)環(huán)境互補(bǔ)的原則來評價(jià)配體與受體相互作用的強(qiáng)弱，從而預(yù)測其結(jié)合模式和親和力的方法。近年來，分子對接技術(shù)在活性成分篩選和作用機(jī)制研究等方面有著廣泛應(yīng)用［24］。中國科學(xué)院昆明動物研究所黃京飛課題組利用分子對接技術(shù)，從21 940 個小分子化合物中獲得了2 355 個候選抗中風(fēng)藥物，包括1 564個單一靶向藥物和791個多靶點(diǎn)藥物，并解釋了多種抗中風(fēng)植物潛在的作用機(jī)制，為抗中風(fēng)藥物的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)［25］。

本研究采用角叉菜膠致小鼠足跖腫脹模型，考察斑籽木BSEA 的體內(nèi)抗炎作用。結(jié)果顯示，與模型組相比，BSEA 高、中劑量組均能顯著抑制角叉菜膠所致小鼠足跖腫脹。同時，腫脹抑制率也表明各給藥組對小鼠的足腫脹有較好的改善作用。采用多種色譜方法從BSEA中分離鑒定了4個化合物，均為首次從斑籽木屬植物中分離得到，進(jìn)一步加深了對斑籽木化學(xué)成分的認(rèn)識。通過抗炎活性評價(jià)發(fā)現(xiàn)其中含量較大的化合物2具有潛在的抗炎活性。采用基于AutoDock Vina 的CB-Dock2 平臺對化合物2 進(jìn)行分子對接，結(jié)果表明其與炎癥相關(guān)靶標(biāo)iNOS、PPARα、NF-κB、IL-1β 和TNF-α 具有較好的親和力，其中與iNOS 蛋白結(jié)合最好，該結(jié)果提示化合物2 的抗炎作用可能與以上5 個靶點(diǎn)相關(guān)，后續(xù)可針對該靶點(diǎn)進(jìn)行其抗炎作用機(jī)制的研究。

本研究為斑籽木在抗炎方面的相關(guān)應(yīng)用提供了一定的科學(xué)依據(jù)，并為進(jìn)一步研究斑籽木抗炎藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制提供了依據(jù)。