慢性間歇性低氧對OSAHS大鼠心肌細胞焦亡的影響

李瑜，古麗娜孜·吐拉洪，陳玉嵐，沙熱扎提·依沙江，王蒙蒙，祖柏旦·阿布漢，阿麗亞·阿不力孜

1 新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院干部保健中心綜合內二科，烏魯木齊 830000；2 新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心血管病中心高血壓科；3 新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院高血壓中心

阻塞性睡眠暫停低通氣綜合征（OSAHS）是一種常見的睡眠障礙，其特征是反復發(fā)生夜間低氧血癥、高碳酸血癥和短暫性覺醒［1］。慢性間歇性低氧（CIH）是OSAHS 最根本的致病因素。CIH 可通過多種生物學途徑導致心血管功能異常［2-4］。在OSAHS小鼠模型中，阻塞性呼吸3 h 將會導致全身性炎癥，心室中炎性細胞浸潤顯著增加［5］。研究顯示，細胞焦亡是新發(fā)現的一種伴隨炎癥反應的細胞程序性死亡，在心血管疾病發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色［6］。細胞焦亡與CIH 誘導心肌損傷的關系目前尚不清楚。2021 年6 月—8 月，本研究通過觀察OSAHS 大鼠左室心肌組織焦亡相關蛋白（Caspase-1、GSDMD、NLRP3）的表達變化，探討CIH 對OSAHS 大鼠心肌細胞焦亡的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 雄性SD 大鼠16 只，8～10周齡，體質量180～260g，由新疆醫(yī)科大學動物實驗中心提供，動物許可證編號：SCXK（新）2018-0003。常溫下，普通飼料飼養(yǎng)，自由飲水及進食，造模前適應性飼養(yǎng)時間為1周。本研究經新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準通過，審批號為IACUC-20210326-08。 Easy Ⅱ Protein Quantitative Kit （DQ111-01）購自北京全式金生物技術有限公司；RIPA裂解液（AR0105）、蛋白酶抑制劑（AR1178）購自武漢博士德生物工程有限公司；山羊抗兔IgG H&L（HRP）、山羊抗小鼠IgG H&L （HRP）購自英國Abcam公司；PVDFTransfer Membrane 0.45μm（ IPVH00010）購自美國Millipore 公司；Tris（A600194-0500g）、SDS（A100227-0500g）、丙烯酰胺（A501033-0500g）、雙丙烯酰胺（A600025-0250g）購自德國Sangon Biotech 公司；GSDMDC1 抗體（sc-393581）購自美國Santacruz公司；EvaGreen Express 2×qPCR MasterMix-Low Rox（MasterMix-LR/1051845151001）、5X All-In-One RT MasterMix （with AccuRT Genomic DNA Removal Kit）（G492）、TRIzol? Reagent（15596026/229006）購自澳大利亞Abm 公司；M5 HiClear DL2000 DNA marker（MF025/18Ka2705）購自北京聚合美生物科技有限公司；瓊脂糖（A610013-0250/A811BA0014）購自生工生物工程（上海股份有限公司）公司；DEPC（D60029-500ml/6635JK102）購自美國Amresco公司。重組Anti-pro Caspase-1+p10+p12 抗體［EPR16883］（ab179515）、重組Anti-NLRP3 抗體［EPR23094-1］ （ab263899）（ab282104）購自英國Abcam 公司。漩渦混合器（GL-88B）購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司；臺式離心機（Neofuge）購自上海力申科學儀器制造廠；酶標儀（xMarkTM）購自Bio-Rad（中國）公司；化學發(fā)光成像儀系統（Chemiscope 3000）購自上海勤翔科學儀器有限公司；移液器（Dragon lab）購自德國Eppendorf 公司；蛋白轉膜儀（Mini-PROTEAN Tetra system）、PCR儀購自美國Bio-Rad公司；電子天平（CP324S）購自德國Sartorius 公司；高速冷凍離心機（Heraeus Multifuge X1R）購自賽默飛世爾科技公司；微量分光光度計（Nano-100）購自杭州奧盛儀器有限公司；凝膠成像系統（2500）購自上海天能科技有限公司；Real Time PCR instrument（7500 Fast）購自美國ABI公司

1.2 動物分組、模型制備 適應性飼養(yǎng)1 周后將大鼠隨機分為對照組、OSAHS 組各8 只。將OSAHS 組置于間歇性低氧艙，每天10：00—18：00 向艙內循環(huán)充入氮氣（濃度99.9%）并排除混合空氣。充入氮氣90 s，當艙內氧濃度達6.5%時維持30 s，隨后60 s排出艙內氣體，氧濃度上升到21%持續(xù)60 s，為1 個循環(huán)，每天持續(xù)8 h［7］。對照組置于常氧艙內，提供常氧空氣。8 周后注射氯胺酮將大鼠處死，開胸取出心臟，將心尖部組織用2.5%的戊二醛固定，用于掃描電子顯微鏡檢測；將剩余心臟組織迅速放入液氮中。

1.3 心肌細胞超微結構變化觀察 將新鮮左室心肌組織切下3 塊（大小1 mm×5 mm），放置于預冷的2.5%戊二醛溶液中固定。4 ℃保存至少24 h 后取出，PBS沖洗3次，置于1%鋨酸溶液中固定至少1 h，再次漂洗，逐級乙醇脫水，樹脂包埋，常規(guī)超薄切片（8 nm），用4%醋酸雙氧鈾和0.4%檸檬酸鉛固定，由新疆醫(yī)科大學電子顯微鏡中心的專業(yè)人員制備樣品，用掃描電子顯微鏡進行觀察。

1.4 左室心肌組織中Caspase-1、GSDMD、NLRP3 mRNA 表達檢測 采用實時熒光定量PCR 法。取各組左室心肌組織約1 cm3置于預冷的凍存管，迅速置于-80 ℃冰箱保存。取大鼠左室心肌組織，液氮研磨，TRLzol 法提取總RNA，微量分光光度計測定RNA 濃度及260、280 nm 波長處吸光度值，RNA樣本A260/A280在1.8～2.1。按照cDNA 反轉錄試劑盒說明書，將RNA 反轉錄為cDNA。將反轉錄得到的cDNA 置于-80 ℃保存。用實時熒光定量PCR 儀進行PCR 反應。反應體系：Eva Green2×qPCR MasterMix 10 μL，Forward Primer 0.6 μL，Reverse Primer 0.6 μL，cDNA 1 μL，RNase-free 水加至20 μL。反應條件：95 ℃預變性10 min，95℃變性15 s、60 ℃退火與延伸60 s共40個循環(huán)。以β-actin為內參。引物由上海生工生物工程有限公司設計合成，Caspase-1 上游引 物5'-CTGAGGGCAAAGAGGAAGCA-3'，下 游 引物3'-CATGATCGCACAGGTCTCGT-5'；GSDMD 上游引物5'-CCAGCATGGAAGCCTTAGAG-3'，下游引物3'-CAGAGTCGAGCACCAGACAC-5'；NLRP3 上游引物5'-TCTGTTCATTGGCTGCGGAT-3'，下游引物3'-TAGCCGCAAAGAACTCCTGG-5'；大 鼠 GAPDH 上游引物5'-CAGGGCTGCCTTCTCTTGTG-3'，下游引物3'-GATGGTGATGGGTTTCCCGT-5'。

1.5 左室心肌組織中Caspase-1、GSDMD、NLRP3蛋白表達檢測 采用Western blotting 法。取左室心肌組織加入液氮研磨，RIPA 裂解液提取總蛋白，用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉移到PVDF膜上。使用含5%脫脂奶粉的封閉液，封閉轉印膜1 h，與抗pro Caspase-1+p10+p12 抗體（1∶800）、GSDMDC1 抗 體（1∶500）、抗NLRP3 抗 體（1∶800）、β-actin（1∶1 000）4 ℃冰箱中共孵育過夜。次日TBST 洗膜，以HRP 標記的二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h。TBST 洗膜，將顯色液A 液和B 液混合，加2 mL至膜上，用ChemiScope 3000 mini 化學發(fā)光儀檢測、拍照。Image Lab 軟件分析條帶灰度值。目的蛋白相對表達量為目的蛋白灰度值/內參灰度值。

1.6 統計學方法 采用SPSS23.0 統計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，兩組比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組心肌細胞超微結構變化比較 對照組心肌細胞膜完整、結構正常；OSAHS組心肌細胞膜完整性被破壞，表現為細胞膜表面欠光滑，形成裂隙、凹陷和大小不等的凸起，細胞膜表面有纖維組織附著，能夠看到明顯的泡狀突起和焦亡小體流出。見圖1。

圖1 兩組掃描電子顯微鏡下心肌細胞超微結構變化

2.2 兩組左室心肌組織中Caspase-1、GSDMD、NLRP3 mRNA 表達比較 與對照組比較，OSAHS 組Caspase-1、NLRP3 mRNA 相對表達量高（P均＜0.05），兩組GDMDS mRNA 相對表達量比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組左室心肌組織中Caspase-1、GSDMD、NLRP3 mRNA表達比較（±s）

表1 兩組左室心肌組織中Caspase-1、GSDMD、NLRP3 mRNA表達比較（±s）

組別對照組OSAHS組P n 8 8 Caspase-1 mRNA 1.051 ± 0.331 1.516 ± 0.377＜0.05 GSDMD mRNA 1.028 ± 0.261 1.193 ± 0.344＞0.05 NLRP3 mRNA 1.046 ± 0.318 1.506 ± 0.335＜0.05

2.3 兩組左室心肌組織中Caspase-1、GSDMD、NLRP3 蛋白表達比較 與對照組比較，OSAHS 組Caspase-1、GSDMD、GSDMD-N、NLRP3 蛋白相對表達量高（P均＜0.05），見表2。

表2 兩組左室心肌組織中Caspase-1、GSDMD、NLRP3蛋白表達比較（±s）

表2 兩組左室心肌組織中Caspase-1、GSDMD、NLRP3蛋白表達比較（±s）

組別對照組OSAHS組P n 8 8 Caspase-1蛋白0.331 ± 0.039 0.519 ± 0.043＜0.05 GSDMD蛋白0.571 ± 0.015 0.792 ± 0.042＜0.05 GSDMD-N蛋白0.251 ± 0.005 0.370 ± 0.023＜0.05 NLRP3蛋白0.399 ± 0.079 0.645 ± 0.030＜0.05

3 討論

OSAHS 病因及發(fā)病機制復雜，且極易誘發(fā)合并癥，而在眾多由OSAHS 引起的合并癥中，心血管疾病是導致嚴重不良事件的重要原因［8］。OSAHS介導炎癥級聯反應的誘導和活化，而炎癥級聯反應又可以促進OSAHS 的發(fā)生發(fā)展，加劇心臟血管損傷，最終引發(fā)心血管系統并發(fā)癥［9-10］。細胞焦亡是一種新的細胞死亡方式，其特征是形成膜孔，細胞溶解，釋放促炎細胞因子和細胞內容物。本研究中，OSAHS組左心室發(fā)生心肌細胞細胞膜完整性被破壞，能夠看到明顯的泡狀突起和焦亡小體，提示CIH可誘導心肌細胞發(fā)生焦亡。細胞焦亡是一種新型Caspase-1依賴的程序性細胞死亡。Caspase-1 最初被認為是IL-1β 轉換酶，將IL-1β 和IL-18 的非活性前體加工成成熟的炎癥細胞因子。Caspase-1 的激活不僅可以使炎癥細胞因子活化，而且還可通過細胞膜破裂及促炎物質的釋放致細胞快速死亡［6］。本研究發(fā)現，間歇性低氧大鼠左室心肌Caspase-1 表達上調，提示CIH 激活Caspase-1，使細胞膜破裂，促進細胞膜促炎物質釋放。

GSDMD 是焦亡的下游效應物，由1 個功能性的N 端結構域和1 個自抑制的C 端結構域組成。在細胞焦亡過程中，GSDMD 被裂解成GSDMD-N 在細胞質膜上形成孔隙，細胞膜的物理完整性喪失，最終導致細胞腫脹和細胞膜裂解［11］。本研究發(fā)現，間歇性低氧大鼠左室心肌GSDMD 和GSDMD-N 的表達上調，亦從蛋白水平證實CIH 促進OSAHS 大鼠心肌細胞焦亡的發(fā)生。此結果提示CIH 激活的Caspase-1裂解了GSDMD，誘導心肌細胞焦亡。

細胞焦亡與細胞凋亡和自噬不同，是由炎癥小體誘導的細胞死亡的一種炎癥形式。NLRP3 是最典型的炎癥小體，可介導細胞焦亡的過程［12］。其中經典焦亡通路中NLRP3 炎癥小體組成的復合物可以活化下游的Caspase-1 和GSDMD，誘導細胞焦亡，從而促進炎癥因子的成熟和分泌［13］。本研究顯示，OSAHS 組Caspase-1、GSDMD、NLRP3 表達上調。提示OSAHS 大鼠NLPR3 小體活化，并通過激活Caspase-1 裂解GSDMD 參與了間歇缺氧誘導的心肌細胞焦亡。NLRP3 在心肌炎癥相關的心血管疾?。ü跔顒用}粥樣硬化、心肌缺血/再灌注、心肌病、心律失常等）中也發(fā)揮著關鍵的作用［14］。如在心肌梗死動物模型中，抑制NLRP3 炎癥小體或凋亡相關斑點樣蛋白可減少梗死面積，改善心功能［15-16］。高糖可促進NLRP3 炎癥小體介導的細胞焦亡，并通過引起線粒體功能障礙而加重心肌再灌注損傷，而NLRP3 炎癥小體抑制劑可減少氧自由基產生并顯著減少心肌再灌注損傷［17］。本研究顯示，CIH 增加了心肌組織中NLRP3 表達，提示CIH 誘導的焦亡可能與心肌炎癥有關。

綜上所述，CIH 可誘導心肌細胞焦亡。本研究不足之處在于未進行NLRP3 基因阻斷，這是以后研究的方向。