miR-199b-5p對阿霉素誘導足細胞凋亡的影響及機制

吳靜漪

江蘇盛澤醫(yī)院兒科，江蘇 蘇州 215228

慢性腎臟病（CKD）患病率逐年增加，隨著病程進展，其最終進入終末期腎病（ESRD）。蛋白尿是促進ESRD 進展的獨立危險因素［1-2］，而足細胞損傷是產(chǎn)生蛋白尿的主要原因。足細胞凋亡可預測CKD患者蛋白尿增多和腎功能進行性下降［3］。微小RNA（miRNA）是一類內源性的高度保守的短鏈非編碼RNA，是基因表達的主要轉錄后調節(jié)因子，參與多種疾病的病理生理過程［4-5］。miRNA 在腎臟疾病中發(fā)揮了重要作用，但具體機制并不清楚。越來越多的研究顯示miR-199b-5p 在多種疾病進展中發(fā)揮關鍵作用。但miR-199b-5p 與足細胞凋亡的關系并不明確。因此，2021 年1 月—2022 年7 月，本研究擬探討miR-199b-5p 對阿霉素誘導足細胞凋亡的影響及其機制，為CKD的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 小鼠足細胞購自上海ATCC細胞庫。阿霉素購自美國MedChemExpress公司；miR-199b-5p mimic 和miR-199b-5p inhibitor 購自上海吉瑪制藥技術有限公司；過表達/沉默脂肪細胞質膜相關蛋白（APMAP）腺病毒購自上海吉凱基因醫(yī)學科技股份有限公司；野生型APMAP 3′UTR（pRL-APMAP-3′UTR WT）、突變型APMAP 3′UTR（pRL-APMAP-3′UTR MUT）質粒和轉染試劑盒購自廣州銳博生物技術有限公司；Podocin 抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology 公司；Bax、Bcl-2 和GAPDH抗體購自美國Affinity Biosciences 公司；Cleaved caspase-3、NF-κB 誘導激酶（NIK）、TNF 受體相關因子3（TRAF3）和APMAP 抗體購自美國Abcam 公司；Allin-one miRNA 試劑盒購自廣州易錦生物技術有限公司；HiScript Ⅲ RT SuperMix 和BCA 蛋白定量試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及干預 將小鼠足細胞復蘇后用含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素、10 U/mL γ 干擾素（IFN-γ）的RPMI-1640 培養(yǎng)液于37 ℃含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞于培養(yǎng)瓶中長滿后，接種至12孔板或6孔板，并用不含IFN-γ 的培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱中進行分化成熟10～14 d。取部分足細胞隨機分為對照組、阿霉素組，阿霉素組取1 μL 阿霉素工作液（1 μg/mL）加入1 mL 無血清RPMI-1640培養(yǎng)基誘導24 h，阿霉素終濃度為1 ng/mL。

1.3 細胞轉染及分組 將足細胞接種于12孔板或6孔板中，使細胞培養(yǎng)至40%～50%融合。為證實miR-199b-5p在阿霉素誘導足細胞凋亡中的作用，取部分細胞隨機分為對照組、阿霉素組、阿霉素+miR-199b-5p mimic 組（過表達）、阿霉素+NC mimic 組，阿霉素+miR-199b-5p inhibitor 組（沉默表達）、阿霉素+NC inhibitor組并給予相應方法轉染。為證實APMAP在足細胞凋亡中的作用，取部分細胞隨機分為阿霉素+miR-199b-5p mimic+Ad-APMAP 組（過表達）、阿霉素+miR-199b-5p mimic+Ad-NC mimic 組，阿 霉 素+miR-199b-5p inhibitor+Ad-APMAP RNAi組（敲低表達）和阿霉素+miR-199b-5p inhibitor+Ad-NC RNAi組，分別轉染過表達或敲低APMAP腺病毒，使APMAP過表達或沉默表達。

1.4 細胞內miR-199b-5p及足細胞標志蛋白（Podocin）、凋亡相關基因（Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3）、APMAP mRNA 表達檢測 采用實時熒光定量PCR。用TRIzol試劑提取細胞總RNA，采用逆轉錄試劑盒合成cDNA，按照PCR 試劑盒說明書以cDNA 為模板進行熒光定量PCR。miR-199b-5p 反應條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。APMAP、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、Podocin mRNA 反應條件：95 ℃ 39 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。引物序列見表1。用2-ΔΔCt法計算目標基因的相對表達量。

表1 各基因引物序列

1.5 細胞內Podocin、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、APMAP 及NF-κB 信號通路相關蛋白（NIK、TRAF3）表達檢測 采用Western blotting 法。用RIPA 法提取細胞總蛋白，采用BCA 蛋白定量法測定蛋白濃度，將適量變性蛋白樣本進行SDS-PAGE 電泳、轉膜、抗原抗體反應后，在ECL 發(fā)光液和凝膠成像分析系統(tǒng)下顯影，采用Image J 進行圖像分析。一抗稀釋 濃度：Podocin（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、Cleaved caspase-3（1∶1 000）、APMAP（1∶1 000）、NIK（1∶1 000）、TRAF3（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000）。以GAPDH 作為對照，以目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值作為目的蛋白相對表達量。

1.6 miR-199b-5p特異性下游靶基因分析 采用生物信息學分析。通過Targetscan（http：//www. targetscan. org/）數(shù)據(jù)庫尋找miR-199b-5p 的特異性下游靶基因。

1.7 miR-199b-5p直接靶基因驗證 采用雙熒光素酶報告基因實驗。將細胞接種于24孔板中，待細胞生長至60%融合時，隨機分為NC mimic+WT-APMAP組、miR-199b-5p+WT-APMAP 組、NC mimic+MUTAPMAP 組、miR-199b-5p+MUT-APMAP 組，使用轉染試劑分別將構建的野生型（WT-APMAP）、突變型（MUT-APMAP）質粒、miR-199b-5p mimic、NC-mimic共培養(yǎng)24 h，加入細胞裂解液充分裂解細胞，按照雙熒光素酶報告基因實驗操作測定熒光素酶活性。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism8.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，兩組比較采用t檢驗；多組比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用Bonferroni方法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 對照組與阿霉素組miR-199b-5p、足細胞標志蛋白、凋亡相關基因表達比較 對照組、阿霉素組miR-199b-5p相對表達量分別為1.00 ± 0.02、1.89 ± 0.70，阿霉素組miR-199b-5p 相對表達量高于對照組（P＜0.05）。兩組足細胞標志蛋白、凋亡相關基因表達比較見表2。

表2 對照組與阿霉素組足細胞標志蛋白、凋亡相關基因表達比較（ˉx ± s）

2.2 過表達或敲低miR-199b-5p 對阿霉素誘導足細胞凋亡的影響 過表達miR-199b-5p 對阿霉素誘導足細胞凋亡的影響：阿霉素+NC mimic 組、阿霉素+miR-199b-5p mimic 組miR-199b-5p 相對表 達 量分別為1.00 ± 0.20、9.36 ± 0.24，阿霉素+miR-199b-5p mimic 組miR-199b-5p 相對表達量高于阿霉素+NC mimic 組（P＜0.05）。兩組Podocin、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3 表達比較見表3。敲低miR-199b-5p對阿霉素誘導足細胞凋亡的影響：阿霉素+NC inhibitor 組、阿 霉 素+miR-199b-5p inhibitor 組miR-199b-5p相對表達量分別為1.00 ± 0.10、0.43 ± 0.02，阿霉素+miR-199b-5p inhibitor組miR-199b-5p相對表達量低于阿霉素+NC inhibitor組（P＜0.05）。兩組Podocin、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3表達比較見表4。

表3 過表達miR-199b-5p對阿霉素誘導足細胞凋亡的影響（±s）

表3 過表達miR-199b-5p對阿霉素誘導足細胞凋亡的影響（±s）

組別阿霉素+NC mimic組阿霉素+miR-199b-5p mimic組＜0.05 Podocin蛋白1.00 ± 0.22 0.51 ± 0.08＜0.05 mRNA 1.02 ± 0.01 0.45 ± 0.13＜0.05 Bax蛋白0.98 ± 0.12 1.94 ± 0.02＜0.05 mRNA 1.11 ± 0.02 1.95 ± 0.03＜0.05 Bcl-2蛋白1.00 ± 0.05 0.56 ± 0.18＜0.05 mRNA 1.01 ± 0.02 0.60 ± 0.02＜0.05 Cleaved caspase-3蛋白1.00 ± 0.02 1.88 ± 0.40＜0.05 mRNA 1.03 ± 0.60 1.76 ± 0.03＜0.05

表4 敲低miR-199b-5p對阿霉素誘導足細胞凋亡的影響（±s）

表4 敲低miR-199b-5p對阿霉素誘導足細胞凋亡的影響（±s）

組別阿霉素+NC inhibitor組阿霉素+miR-199b-5p inhibitor組P Podocin蛋白1.00 ± 0.22 1.62 ± 0.02＜0.05 mRNA 1.05 ± 0.01 1.65 ± 0.04＜0.05 Bax蛋白1.00 ± 0.04 0.45 ± 0.02＜0.05 mRNA 1.01 ± 0.02 0.55 ± 0.03＜0.05 Bcl-2蛋白1.01 ± 0.05 1.92 ± 0.50＜0.05 mRNA 1.00 ± 0.03 1.83 ± 0.02＜0.05 Cleaved caspase-3蛋白1.01 ± 0.02 0.59 ± 0.16＜0.05 mRNA 1.01 ± 0.01 0.56 ± 0.03＜0.05

2.3 miR-199b-5p 靶向APMAP 對足細胞凋亡的影響 生物信息學分析結果顯示，APMAP-3′UTR 具有miR-199b-5p 高度保守的結合位點。NC mimic+WT-APMAP 組、miR-199b-5p+WT-APMAP 組、NC mimic+MUT-APMAP 組、miR-199b-5p+MUT-APMAP組熒光素酶活性分別為1.00 ± 0.10、0.53 ± 0.02、0.97 ± 0.03、1.00 ± 0.02。 與NC mimic+MUTAPMAP組比較，miR-199b-5p+WT-APMAP組APMAP的熒光素酶活性低（P＜0.05）。各組APMAP及足細胞標志蛋白、凋亡相關基因表達比較見表5～7。

表5 各組APMAP表達比較（±s）

表5 各組APMAP表達比較（±s）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與阿霉素+NC mimic 組比較，bP＜0.05；與阿霉素+NC inhibitor比較，cP＜0.05。

組別對照組阿霉素組阿霉素+NC mimic組阿霉素+miR-199b-5p mimic組阿霉素+NC inhibitor組阿霉素+miR-199b-5p inhibitor組APMAP蛋白1.00 ± 0.10 0.53 ± 0.02a 0.52 ± 0.20 0.33 ± 0.12b 0.59 ± 0.12 1.35 ± 0.23c mRNA 1.01 ± 0.02 0.45 ± 0.10a 0.56 ± 0.12 0.26 ± 0.13b 0.55 ± 0.02 1.50 ± 0.13c

表6 阿霉素+miR-199b-5p mimic+Ad-NC組、阿霉素+miR-199b-5p mimic+Ad-APMAP組足細胞標志蛋白、凋亡相關基因表達比較（±s）

表6 阿霉素+miR-199b-5p mimic+Ad-NC組、阿霉素+miR-199b-5p mimic+Ad-APMAP組足細胞標志蛋白、凋亡相關基因表達比較（±s）

組別阿霉素+miR-199b-5p mimic+Ad-NC組阿霉素+miR-199b-5p mimic+Ad-APMAP組P Podocin蛋白1.00 ± 0.02 1.85 ± 0.30＜0.05 mRNA 1.00 ± 0.01 1.95 ± 0.03＜0.05 Bax蛋白0.98 ± 0.12 0.45 ± 0.10＜0.05 mRNA 1.01 ± 0.02 0.52 ± 0.50＜0.05 Bcl-2蛋白1.00 ± 0.05 1.98 ± 0.40＜0.05 mRNA 1.01 ± 0.02 1.86 ± 0.12＜0.05 Cleaved caspase-3蛋白1.02 ± 0.02 0.46 ± 0.03＜0.05 mRNA 1.00 ± 0.01 0.36 ± 0.13＜0.05

表7 阿霉素+miR-199b-5p inhibitor+Ad-NC組、阿霉素+miR-199b-5p inhibitor+Ad-APMAP組足細胞標志蛋白、凋亡相關基因表達比較（±s）

表7 阿霉素+miR-199b-5p inhibitor+Ad-NC組、阿霉素+miR-199b-5p inhibitor+Ad-APMAP組足細胞標志蛋白、凋亡相關基因表達比較（±s）

組別阿霉素+miR-199b-5p inhibitor+Ad-NC組阿霉素+miR-199b-5p inhibitor+Ad-APMAP組P Podocin蛋白1.02 ± 0.02 0.45 ± 0.12＜0.05 mRNA 1.00 ± 0.02 0.42 ± 0.03＜0.05 Bax蛋白1.00 ± 0.13 1.88 ± 0.15＜0.05 mRNA 1.00 ± 0.02 1.90 ± 0.50＜0.05 Bcl-2蛋白1.01 ± 0.05 0.34 ± 0.10＜0.05 mRNA 1.00 ± 0.01 0.46 ± 0.02＜0.05 Cleaved caspase-3蛋白1.02 ± 0.03 1.86 ± 0.13＜0.05 mRNA 1.00 ± 0.02 1.99 ± 0.15＜0.05

2.4 miR-199b-5p 靶向APMAP 對NF-κB 信號通路的影響 見表8、9。

表8 各組TRAF3、NIK蛋白表達比較（±s）

表8 各組TRAF3、NIK蛋白表達比較（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與阿霉素+NC mimic 組比較，bP＜0.05；與阿霉素+NC inhibitor組比較，cP＜0.05。

組別對照組阿霉素組阿霉素+NC mimic組阿霉素+miR-199b-5p mimic組阿霉素+NC inhibitor組阿霉素+miR-199b-5p inhibitor組TRAF3蛋白1.00 ± 0.02 0.63 ± 0.12a 0.61 ± 0.12 0.34 ± 0.22b 0.55 ± 0.12 1.55 ± 0.22c NIK蛋白1.01 ± 0.02 1.87 ± 0.13a 1.90 ± 0.21 2.50 ± 0.21b 1.86 ± 0.16 0.65 ± 0.20c

3 討論

有研究顯示，在阿霉素處理的足細胞中miR-199b-5p 表達升高，沉默miR-199b-5p 表達通過靶向RGS10 抑制阿霉素誘導的足細胞凋亡［6］。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-199b-5p 過表達可以促進足細胞凋亡，下調miR-199b-5p表達可緩解阿霉素誘導的足細胞凋亡。這與先前的報道一致。

miRNA作用機制之一是通過不完全互補結合至基因mRNA 3′UTR區(qū)，從而阻斷mRNA的翻譯過程［7］。因此，本研究擬通過尋找miR-199b-5p的下游靶基因，探討miR-199b-5p在足細胞凋亡中的潛在作用機制。通過分析TargetScan、miRDB 數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，APMAP 可能是miR-199b-5p的下游靶基因。APMAP是一類脂肪細胞質膜相關蛋白，在多種疾病進展中發(fā)揮重要作用［8-10］。但是，目前尚無研究表明APMAP在腎臟疾病足細胞凋亡中的作用。為了證實APMAP是否為miR-199b-5p的真正分子靶標，本研究使用雙熒光素酶報告基因實驗，結果顯示，miR-199b-5p 可顯著降低HEK-293T細胞中野生型APMAP的熒光素酶活性，但突變體APMAP未觀察到該結果。表明在阿霉素干預的足細胞中APMAP表達明顯降低，沉默miR-199b-5p后APMAP表達明顯升高，說明miR-199b-5p可能通過負性調控APMAP參與足細胞凋亡。接下來為了證實APMAP對足細胞凋亡的影響，本研究對APMAP進行挽救實驗。過表達APMAP可以逆轉miR-199b-5p對足細胞凋亡的影響，沉默APMAP 可以加劇miR-199b-5p對足細胞凋亡的促進作用。表明miR-199b-5p可以通過負性靶向調控APMAP促進足細胞凋亡。

表9 各組TRAF3、NIK蛋白表達比較（±s）

表9 各組TRAF3、NIK蛋白表達比較（±s）

注：與阿霉素+miR-199b-5p mimic+Ad-NC 組比較，aP＜0.05；與阿霉素+miR-199b-5p inhibitor+Ad-NC RNAi組比較，bP＜0.05。

組別阿霉素+miR-199b-5p mimic+Ad-NC組阿霉素+miR-199b-5p mimic+Ad-APMAP組阿霉素+miR-199b-5p inhibitor+Ad-NC RNAi組阿霉素+miR-199b-5p inhibitor +Ad-APMAP RNAi組TRAF3蛋白0.32 ± 0.01 1.36 ± 0.12a 1.56 ± 0.12 0.43 ± 0.02b NIK蛋白1.67 ± 0.14 0.60 ± 0.20a 0.52 ± 0.10 2.00 ± 0.02b

有研究報道，APMAP 參與了NF-κB 信號通路的調控，下調APMAP 表達可促進NF-κB 信號通路激活［11］。NF-κB信號通路參與調控多種生物功能，激活NF-κB 信號通路可降低TNF 誘導的細胞凋亡，而在NF-κB活性缺乏的情況下，TNF誘導的細胞凋亡的敏感性將顯著增加［12］。研究表明，NF-κB信號通路在足細胞凋亡中起至關重要的作用。在糖尿病腎病小鼠模型和高糖干預下，足細胞中NF-κB 和下游TLR 信號通路被激活，促進各種炎癥因子釋放，從而促進足細胞凋亡［13］。研究顯示，NF-κB信號轉導通常有兩種激活通路，一種為經(jīng)典的NF-κB信號通路，炎癥因子與相關受體結合，激活IkBa 激酶，使IkBa 磷酸化，NF-κB啟動，信號轉導被激活［14］。本研究利用另一種非經(jīng)典的信號轉導方式，通過檢測TRAF3 和NIK 蛋白的表達探討NF-κB 信號轉導對足細胞凋亡的影響。發(fā)現(xiàn)在阿霉素的干預下，NF-κB通路激活。通過沉默miR-199b-5p和過表達APMAP發(fā)現(xiàn)NF-κB信號轉導被抑制，由此說明miR-199b-5p 能夠通過抑制APMAP表達激活TRAF3/NIK/NF-κB信號通路。

綜上所述，miR-199b-5p可能與慢性腎臟病足細胞凋亡有關，可通過靶向調控APMAP 激活TRAF3/NIK/NF-κB 信號通路促進足細胞凋亡。miR-199b-5p有望成為慢性腎臟病治療的新靶點。