痰熱清與頭孢曲松鈉聯(lián)用對巨噬細胞極化的影響①

劉曉霞 陳劍華 郭旭麗 李衛(wèi)霞 王雪玲 熊南燕 （河北工程大學醫(yī)學院，邯鄲 056038）

抗生素在感染性疾病治療方面歷史悠久、貢獻突出，但隨之出現(xiàn)了細菌耐藥現(xiàn)象，導致療效降低。為提高抗生素療效，臨床常將具有清熱、解毒等作用的中藥制劑，如喜炎平注射液、疏風解毒膠囊等，與抗生素聯(lián)用治療感染性疾病，臨床認為中藥制劑與抗生素聯(lián)用具有協(xié)同作用［1-2］。為明確其聯(lián)用的作用機制，本研究將痰熱清與頭孢曲松鈉聯(lián)用于金黃色葡萄球菌感染小鼠，研究感染小鼠腹腔巨噬細胞極化情況，探討其是否可通過影響巨噬細胞極化發(fā)揮作用，為臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 昆明小鼠購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心；PE-抗小鼠CD80 抗體、 FITC-抗小鼠CD206 抗體購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ、PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time 購自日本TaKaRa 公司；引物由 Invitrogen 公司 合成；兔抗 鼠iNOS、TNF-α、IL-6、 IL-1β、Arg-1、Fizz-1、TGF-β、STAT1、p-STAT1、IRF5

抗體、HRP-羊抗兔IgG 抗體購自ThermoFisher 公司；兔抗鼠Ym-1 抗體購自STEMCELL Technologies；26001-25金黃色葡萄球菌菌株購自北京市藥品生物制品檢定所。

1.2 方法

1.2.1 動物造模 6～8周齡昆明小鼠60只，雌雄各半，體溫相近（相差≤0.2 ℃），腹腔注射金黃色葡萄球菌0.2 ml （9×108個/ml），1 h 后電子體溫計經直腸測體溫，選擇體溫≥37.2 ℃小鼠40只，按體溫高低均分為4 組：模型組、頭孢曲松鈉組、痰熱清組和痰熱清+頭孢曲松鈉組，每組10 只，對照組為10 只正常未處理小鼠。對照組和模型組腹腔給予生理鹽水（70 mg/kg），其他三組分別腹腔給予頭孢曲松鈉 （70 mg/kg）、痰熱清（13 mg/kg）和頭孢曲松鈉+痰熱清（70 mg/kg+13 mg/kg），2 次/d，連續(xù)7 d。第7 天給藥后2 h采集小鼠腹腔巨噬細胞。

1.2.2 小鼠腹腔巨噬細胞分離 小鼠摘眼球和頸動脈放血至血流盡，75%乙醇浸泡5 min（頭部不浸入），沿腹中線剪開皮膚，充分暴露腹膜，5 ml預冷無菌PBS沖洗，收集液體至離心管，沖洗3次，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS 重懸，洗滌3 次，收集細胞，RPMI1640 完全培養(yǎng)基重懸細胞，接種于無菌培養(yǎng)皿，培養(yǎng)2 h，棄上清，無菌PBS 洗滌3 次，去除未貼壁細胞，得到貼壁細胞即小鼠腹腔巨噬細胞，調整細胞濃度為2×106個/ml。

1.2.3 流式細胞術檢測巨噬細胞M1、M2 極化情況 取1.2.2 中的細胞懸液100 μl，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，含0.1%BSA的PBS洗滌2次，加入含0.1%BSA 的PBS 重懸細胞，加入2 μl PE-抗小鼠CD80 抗體、2 μl FITC-抗小鼠CD206 抗體 混 勻， 4 ℃孵 育 30 min，加 入1 ml 含0.1%BSA 的PBS， 1 000 r/min 離 心5 min，棄 上 清，加 入0.5 ml 含0.1%BSA的PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測。

1.2.4 小鼠腹腔巨噬細胞總RNA 提取及RT-qPCR檢測 TRIzol 法提取細胞總RNA，取1.2.2 中細胞懸液，PBS洗滌2次，加入500 μl TRIzol渦旋振蕩，使細胞完全裂解，靜置5 min。加入200 μl 三氯甲烷 渦旋振蕩15 s，靜置2 min，4 ℃、12 000 r/min 離心 15 min，取上清加至新EP 管，加入等量異丙醇混勻，室溫靜置10 min，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min， 棄上清，加入1 ml 75%乙醇室溫靜置2 min，4 ℃、 7 500 r/min 離心5 min，棄上清，重復洗滌2 次。將EP 管室溫晾干，加入適量焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解沉淀，檢測RNA 濃度和純度，以總RNA 為模板轉錄為cDNA，進行RT-qPCR 反應，反應體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 μl、ddH2O 8.5 μl、cDNA 2 μl、 正反向引物各1 μl，引物序列見表1。反應條件：95 ℃ 30 s，1個循環(huán)預變性；95 ℃ 5 s變性；60 ℃ 30 s退火延伸，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s；60 ℃ 60 s；95 ℃ 15 s， 1 個循環(huán)。2-ΔΔCt法計算并分析iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β、Arg-1、Fizz-1、Ym-1、TGF-β mRNA相對表達。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.5 Western blot 檢測巨噬細胞相關蛋白表達 取上述細胞懸液，PBS 洗滌2 次，RIPA 裂解，提取總蛋白，BCA 法定量。取各組蛋白20 μl 進行SDDPAGE 電泳，電轉至PVDF 膜，含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉1 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜4 次，10 min/次，加入HRP-二抗室溫孵育2 h，TBST 洗膜。超敏ECL 化學發(fā)光試劑盒顯影曝光，Image J軟件分析蛋白灰度值。

1.3 統(tǒng)計學分析 應用GraphPad Prism 8 軟件處理數據，結果以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey 法，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠腹腔巨噬細胞極化情況 模型組、頭孢曲松鈉組、痰熱清組、痰熱清+頭孢曲松鈉組M1 型（CD86陽性）巨噬細胞比例明顯高于對照組，痰熱清組與痰熱清+頭孢曲松鈉組均明顯高于模型組和頭孢曲松鈉組（F=24.030，P＜0.05）；而模型組與頭孢曲松鈉組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），痰熱清組與痰熱清+頭孢曲松鈉組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各組M2型（CD206陽性）巨噬細胞比例差異無統(tǒng)計學意義（F=1.608，P＞0.05，圖1）。

圖1 小鼠腹腔巨噬細胞極化情況Fig.1 Polarization of peritoneal macrophage in mice

2.2 小鼠腹腔巨噬細胞iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β、Arg-1、Fizz-1、Ym-1、TGF-β mRNA 表達 頭孢曲松鈉組、痰熱清組以及痰熱清+頭孢曲松鈉組M1 型巨噬細胞極化標志物iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表達明顯高于對照組，痰熱清組和痰熱清+頭孢曲松鈉組明顯高于模型組和頭孢曲松鈉組（P＜0.01），而模型組與頭孢曲松鈉組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），痰熱清組與痰熱清+頭孢曲松鈉組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各組M2 型巨噬細胞極化標志物Arg-1、Fizz-1、Ym-1、TGF-β mRNA 表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表2）。

表2 小鼠腹腔巨噬細胞iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β、Arg-1、Fizz-1、Ym-1、TGF-β mRNA表達（±s，n=10）Tab.2 mRNA level of iNOS， TNF-α， IL-6， IL-1β， Arg-1， Fizz-1， Ym-1 and TGF-β of peritoneal macrophage in mice （±s，n=10）

表2 小鼠腹腔巨噬細胞iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β、Arg-1、Fizz-1、Ym-1、TGF-β mRNA表達（±s，n=10）Tab.2 mRNA level of iNOS， TNF-α， IL-6， IL-1β， Arg-1， Fizz-1， Ym-1 and TGF-β of peritoneal macrophage in mice （±s，n=10）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05； compared with ceftriaxone sodium group， 3）P＜0.05.

2.3 小鼠腹腔巨噬細胞iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β、Arg-1、Fizz-1、Ym-1、TGF-β 蛋白表達 模型組、頭孢曲松鈉組、痰熱清組以及痰熱清+頭孢曲松鈉組M1型巨噬細胞極化標志物iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β 蛋白表達明顯高于對照組，痰熱清組和痰熱清+頭孢曲松鈉組明顯高于模型組和頭孢曲松鈉組（P＜0.05），而模型組與頭孢曲松鈉組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），痰熱清組與痰熱清+頭孢曲松鈉組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各組M2 型巨噬細胞極化標志物Arg-1、Fizz-1、Ym-1、TGF-β 蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖2），與mRNA結果一致。

圖2 小鼠巨噬細胞iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β、Arg-1、Fizz-1、Ym-1、TGF-β蛋白表達Fig.2 Protein expressions of iNOS，TNF-α，IL-6，IL-1β， Arg-1， Fizz-1， Ym-1， TGF-β of peritoneal macrophage in mice

2.4 小鼠腹腔巨噬細胞IRF/STAT信號通路相關蛋白表達 Western blot 結果顯示，模型組、頭孢曲松鈉組、痰熱清組及痰熱清+頭孢曲松鈉組p-STAT1和IRF5 蛋白表達明顯高于對照組，痰熱清組和痰熱清+頭孢曲松鈉組明顯高于模型組和頭孢曲松鈉組（P＜0.05），而模型組與頭孢曲松鈉組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），痰熱清組與痰熱清+頭孢曲松鈉組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各組STAT1 蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖3）。

圖3 小鼠巨噬細胞IRF/STAT信號通路相關蛋白表達Fig.3 Protein expressions of IRF/STAT signaling pathway of peritoneal macrophage in mice

3 討論

痰熱清注射液由連翹、山茱萸、黃芩、金銀花、藜蘆5 種成分組成，含有咖啡酸、鵝去氧膽酸、黃芩苷、綠原酸、熊去氧膽酸5種活性物質，具有清熱、解毒、化痰等作用，用于肺炎早期、急性支氣管炎、慢性支氣管炎急性發(fā)作及上呼吸道感染治療［3］。臨床將其與抗生素聯(lián)用治療呼吸道疾病，可提高療效、降低不良反應發(fā)生率、縮短住院和抗生素使用時間，但未進行機制研究［4］。宋福江［5］對痰熱清成分及抗菌作用機制進行研究發(fā)現(xiàn)，痰熱清可通過抑制細菌細胞壁和脂肪酸合成發(fā)揮體外抗菌作用；李文等［6］發(fā)現(xiàn)痰熱清與常規(guī)西藥治療風熱型氣管-支氣管炎后，中醫(yī)癥候群改善優(yōu)于單用西藥治療，可能與聯(lián)用下調IL-4、IL-8、IL-10 水平有關；李芷悅［7］研究發(fā)現(xiàn)痰熱清與左氧氟沙星聯(lián)用于銅綠假單胞菌感染大鼠，可通過抑制炎癥反應和氧化應激提高療效。但未發(fā)現(xiàn)二者聯(lián)用對巨噬細胞影響的研究。

巨噬細胞屬于機體固有免疫細胞，在抗感染免疫中發(fā)揮重要作用，受到刺激可發(fā)生極化，分化為經典活化巨噬細胞（M1 型）和旁路活化巨噬細胞（M2型），二者表型、分泌細胞因子、功能均不同，M1型巨噬細胞能有效清除病原體，并引起炎癥損傷和組織損傷，M2 型巨噬細胞具有抗炎作用，對炎癥刺激不敏感，促進組織修復［8-9］。本研究發(fā)現(xiàn)單用痰熱清、痰熱清+頭孢曲松鈉聯(lián)用均可促進巨噬細胞M1型分化，且M1 型標志物iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA 及蛋白表達顯著增加。iNOS 可促進NO 生成，促進氧化應激，本研究iNOS 表達增加與李芷悅［7］發(fā)現(xiàn)的痰熱清與左氧氟沙星聯(lián)用可抑制氧化應激不符，可能是其針對氧化應激進行的是SOD 和MDA 研究，并未檢測NO，且其研究的是整個肺組織氧化應激情況，而本研究僅針對巨噬細胞進行研究；本研究顯示TNF-α、IL-6 表達增加，與李文等［6］、李芷悅［7］研究的痰熱清與抗生素聯(lián)用下調炎癥因子表達不符，原因可能在于二人分別針對血漿和整個肺組織進行研究。

巨噬細胞極化受多種信號分子和轉錄因子調控，IRF/STAT 信號通路即為其中之一，STAT1 是 一種連接膜受體與效應器信號轉導的重要分子，其磷酸化后形成二聚體進入細胞核，啟動靶基因轉錄，既往研究發(fā)現(xiàn)其可促進M1 型巨噬細胞極化［10-11］；極化后的M1 型巨噬細胞IRF5 分子表達上調，進而誘導M1 相關細胞因子分泌［11-12］。本研究也顯示，單用痰熱清、痰熱清+頭孢曲松鈉聯(lián)用STAT1磷酸化水平、IRF5 分子表達明顯高于其他三組，提示其可能通過調節(jié)IRF/STAT信號通路促進M1型巨噬細胞極化。

綜上，痰熱清與頭孢曲松鈉聯(lián)用于金黃色葡萄球菌感染小鼠，可通過促進M1 型巨噬細胞分化促進iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β 表達，進而促進NO 產生和炎癥反應，增強機體抗感染能力，可能通過調節(jié)IRF/STAT信號轉導途徑實現(xiàn)。